בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לנתח את המבנה והתפקוד של ריבוזומים טהורים המכילים peptid tRNA ייחודי. דבר זה מושג על ידי ביצוע בדיקות תרגום in vitro עם תמציות תאים נטולות גורמי שחרור (release factor depleted) ו-mRNAs מסומני ביוטין, כדי להפיק קומפלקסים של ריבוזום ו-pep tRNA שהתרגום בהם נעצר ומחוברים ל-mRNAs מסומני הביוטין. בשלב שני, חרו지를 פראמגנטים הקשורים לסטראפטאווידין מעורבבים עם בדיקות התרגום in vitro כדי לאפשר את אינטראקצייתם עם מולקולות הביוטין הממוקמות ב-mRNA.

מאוחר יותר, החרוזים מופקים באמצעות שדות מגנטיים שמשכו את קומפלקסי הריבוזום-tRNA-פפטיד העצור, הקשורים ל-mRNAs, מתוך התגובה הכוללת. לאחר מכן, ניתן לערבב את קומפלקסי הריבוזום-tRNA-פפטיד המNOPופקים עם גורמי תרגום כגון גורמי שחרור (release factor), אנטיביוטיקה מעכבת או חומרי שינוי כימיים לצורך ניתוח התפקוד. תוצאות של עיכוב ומבנה של הריבוזום מראות עיכוב של הידרוליזה של ה-tRNA הפפטידי ואת המתאם שלו לשינויים מבניים בריבוזומים בהתבסס על פעילות פפטיד טרנספראז או בדיקות סיום תרגום באמצעות ג'לי SDS או Tris-Acetate PAGE ובדיקות הגנה מפני מודיפיקציה באמצעות ג'לי Urea PAGE.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צנטריפוגציה דיפרנציאלית, הוא שהדגימות המבודדות מכילות בעיקר ריבוזומים בעל אוכלוסייה אחת בלבד של pep tRNA. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ביטוי הגנים, כגון טבעם של פולייפפטידים ראשוניים (nascent polypeptides) והשפעתם של אנטיביוטיקה על תפקוד הריבוזום, למשל על ידי ויסות תהליך התרגום. כדי להתחיל בהליך זה, השג שני גרמים של משקע חיידקי e coli יבש מתרביות בשלב הלוגריתמי (log phase).

שטפו את המשקע על ידי השהיה מחדש (Resuspend) בליטר אחד של בופר, ולאחר מכן ביצוע צנטריפוגציה ב-5,000 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר ביצוע שתי שטיפות, השהו מחדש את משקע החיידקים שהתקבל ב-40 מיליליטר של בופר ושברו את תאי החיידקים באמצעות מכבש צרפתי (French press) תחת לחץ של 6,000 PSI. לחץ זה מקביל ל-600 יחידות בשימוש בבוכנה של שים אחד.

אספו את התרחיף שעבר דיסרופציה למבחנה זכוכית נקייה בנפח 50 מיליליטר. טפלו בתרחיף שעבר דיסרופציה באמצעות 1 mM של DIO triol או DTT, וסובבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-30,000 Gs למשך 30 דקות. הסירו את supernatant שהתקבל וחזרו על תהליך הסבב בצנטריפוגה.

שמרו את העלייה שהתקבלה מהסבב השני של הסבב הצנטריפוגלי, והעבירו את העלייה הסופית למבחנות מיקרו. לבסוף, בצעו הקפאה מהירה (flash freeze) של המנות באמצעות תערובת של קרח יבש ואתנול או חנקן נוזלי, ואחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 60- או 80- מעלות צלזיוס.

התחל את הכנת התמציות נטולות התאים המדולדלות ב-RF two על ידי ערבוב של 4.5 milliliters של slurry beads מסוג protein A spheros four B עם חמישה milliliters של antiserum נגד RF two. סובב את התערובת על גלגל סיבוב בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. סבב את התערובת בצנטריפוגה ב-2, 500 Gs כדי להפריד את החרוזיים מה-antiserum.

שפכו את הנוזל העליון. החרוזים מכילים כעת את הנוגדנים anti RF two וייקראו להלחה חרוזי anti RF two. שטפו את החרוזים על ידי רספנסיה ב-1 mL של buffer bee.

לאחר מכן, סבב את החרוצים בצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן כדי להפריד את חרוצי ה-anti RF two מבאפר B. חזור על הליך שטיפה זה פעמיים. לאחר שטיפת החרוצים, ערבב 1 milliliter של תמצית נטולת תאים עם 150 microliters של חרוצי anti RF two והדגר על גלגל סיבוב בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים לאחר ההדגרה. סבב את התערובת בצנטריפוגה ב-10,000 Gs כדי להפריד את התמצית נטולת התאים מהחרוצים.

הסר את הנוזל העליון (supernatant) וטפל בו שוב עם 150 µL נוספים של חרוזי anti RF two לפני חזרה על האינקובציה וההסרה (pull down) פעם נוספת. חלק את תמיסת התמצית התאית נטולת ה-RF two הסופית למבחנות מיקרו בנפח של 100 µL למבחנה. הקפא את המנות באמצעות תערובת של קרח יבש ואתנול או חנקן נוזלי ואחסן בטמפרטורה של 60- או 80- מעלות צלזיוס (°C).

הכינו את תגובת ה-PCR על ידי שילוב תבנית הפלסמיד המכילה את הרצפים, אוליגו-דאוקסי-נוקלאוטידים, DTPs, DNA polymerase תקין ובופר PCR ייעודי. לאחר הכנת דגימת ה-PCR, בצעו את תגובת ההגברה והשקיפו את ה-DNA כדי לטהר את תוצרי ה-PCR על ידי הוספת נפח של 1/10 מסודיום אצטט 3M ב-pH 5.2 ושני נפחים של אתנול קר מהקרח. לאחר חזרה על הליך ההשקפה פעם נוספת, המסנו את ה-DNA שהתקבל ב-100 µL של dathyl percarbonate או מים שעברו טיפול ב-dsy.

יש לאמת את שלמות תוצרי ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה בג'לי אגרוז. בדרך כלל, הליך זה מניב 100 micrograms של תוצר DNA באורך 600 base pair. הכינו תגובת שעתוק in vitro בנפח של 100 microliter במים שעברו טיפול ב-depthy, על ידי ערבוב של five micrograms של מקטע ה-DNA שהופק ב-PCR עם ריבונוקלאוטידים, UTP המסומן בביוטין ותערובת אנזים T seven.

דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות. כדי לכמת את כמות ה-mRNA שהתקבלה, הסירו את תבנית ה-DNA על ידי הוספת DNase נקי מ-RNA. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות.

כדי לטהר את תוצרי ה-mRNA, יש להשקיע את ה-RNA פעמיים על ידי הוספת נפח של עשירית מנתרס אצטט בריכוז 3 molar ב-pH 5.2 ושני נפחים של אתנול קר; לאחר מכן יש להמיס מחדש את ה-mRNA שהשקיע ב-100 µL של מים שעברו טיפול ב-dpci. יש לאמת את שלמותם של תוצרי ה-mRNA המסומנים בביוטין באמצעות אלקטרופורזה על ג'לי agarose. בדרך כלל, הליך זה מניב בין 1 ל-2 mg של תוצר mRNA מסומן בביוטין באורך 600 נוקלאוטידים. כדי להתחיל בבידוד ריבוזומים מתרגמים המכילים peptid TRNA, יש להכין תערובת תגובה לתרגום in vitro בנפח של 500 µL במים שעברו טיפול ב-dey.

ראשית, הכינו את תערובת התגובה המבופרת המתוארת בפרוטוקול הכתוב המצורף, ולאחר מכן הוסיפו 75 $\mu$M מכל אחת מחומצות האמינו, למעט זו שתוחלף בחומצת אמינו רדיואקטיבית. לאחר מכן, הוסיפו 20 עד 50 $\mu$l של תמצית תאיים נטולת RF2 לתמיסת הבאפר המכילה את חומצות האמינו. דגרו את התערובת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את הפעלת הריבוזומים.

לאחר שהריבוזומים הופעלו, יש להוסיף לדגימה 10 עד 15 micrograms של mRNAs המסומנים בביוטין. דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות.

בינתיים, הכין שלושה מיליליטר של חרוזי סטראפטאווידין פראמגנטיים או SMB בבופר C. לאחר האינקובציה, הוסף את תרחיף ה-SMP לתערובת תגובת התרגום. דגור את התרחיף החדש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הפרד את ה-SMB מהתערובת על ידי הפעלת שדה מגנטי באמצעות מעמדי הפרדה מגנטית. Resus.

השעה את ה-SMB בבופר C והפרד שוב את החרוצים באמצעות המעמד המגנטי. לאחר חזרה על הליך שטיפה זה פעמיים, השעה מחדש את החרוצים ב-500 µL של בופר C. שמור את התמיה על קרח ובצע את ההליך הבא באופן מיידי. כדי להדמיא את ה-peptid TRNA, ערבב 10 µL של SMB מושעה ובופר C עם 10 µL של בופר טעינה, והפרד את הרכיבים הקשורים לחרוצים על ידי הרצת הדגימות בג'לים של 10% Tris tric poly acrylamide.

ייבשו את הג'לים באמצעות מייבש ג'ל בוואקום. לאחר מכן, ודאו את השלמות והניקיון של הפפטיד TRNA על ידי חשיפת הג'ל המיובש לסרט רנטגן. כדי לנתח את ה-ribosomal RNA, ערבבו 190 µL של תמיסת EDTA בריכוז 2 mM שהוכנה במים שעובדו ב-dpci, 200 µL של פנול המאוזן במים ו-10 µL של ת сусפנזיית חרוצים.

ערבבו את התרחיף שהתקבל באמצעות וורטקס נמרץ. הפרידו את הפאזה האי-אורגנית מהפאזה האורגנית על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-10,000 Gs למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. אספו את שכבת המים העליונה למיקרו-מבחנה חדשה, והשקיפו את ה-RNA משכבת המים על ידי הוספת נפח של 1/10 מנתרן אצטט 3 M ב-pH 5.2, מיקרו-ליטר אחד של תמיסת גליקוגן בריכוז 20 mg/mL, ושני נפחים של אתנול קר מאוד. השביבו מחדש את ה-RNA שהשקיף ב-10 µL של מים שעובדו ב-dpci.

יש לאמת את שלמות ה-ribosomal RNAs באמצעות אלקטרופורזה על ג'לי niros. בדרך כלל, 50 µL של תרחיף חרוצים מניבים 1 µg של ribosomal RNA. כאן מוצגות תוצאות של סדרת אנליזות להערכת האיכות והתפקוד של ריבוזומים מתרגמים שבודדו.

הבחנה בפס ייחודי שזוהה בג'לי פוליאקרילאמיד מעידה על נוכחותם של פוליפפטידים הקשורים ל-mRNAs המסומנים בביוטין המחוברים ל-SMB. טיהור של ribosomal RNAs באמצעות הליך זה מאשש את נוכחותם של ריבוזומים הקשורים ל-mRNAs מסומנים בביוטין אלו גם כן.

הוספה של puromycin, אנטיביוטיקה המשרה את פעילות ה-peptidyl transferase של הריבוזום, גורמת לניתוק של ה-peptidyl-tRNAs הנסמכים. תופעה זו נצפית כשינוי בדפוס הנדידה של הפוליפפטיד המבודד בג'לים של polyacrylamide. יחד, נתונים אלו מעידים על כך ש-mRNAs מסומני ביוטין המחוברים ל-SMB מכילים ריבוזומים תפקודיים עם peptidyl-tRNAs.

בידוד של ריבוזומים מתרגמים המכילים peptid tRNAs ספציפיים מאפשר את חקר ההשפעות של peptid tRNAs, אנטיביוטיקה ומולקולות אחרות על תפקוד הריבוזום ועל מבנה הריבוזום. בדוגמאות המוצגות כאן, האנטיביוטיקה parsamyn וחומצת האמינו trytophan מעכבים את השבירה ההידרוליטית של ה-TNAC tRNA peptid tRNA הנסרי על ידי RF two, בריבוזומים המבודדים.

האינטראקציה של tryptophan או sparsomycin עם הריבוזום גורמת גם לשינויים מבניים בכמה נוקלאוטידים המרכיבים את ה-23 S-R-R-N-A של הריבוזום המתרגם. ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן לבצע את החלק העיקרי שלה בחמישה שעות, במידה שפועלים לפי הפרוטוקולים הללו כראוי. ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון cryo em, לצורך ניתוח מבני נוסף כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע למבנה של ריבוזום המכיל Pepin, RNA ייחודי.