הלבלב Murine איילט בידוד
22 באוגוסט 2007
היי, אני גרג זוט. אני עובד במרכז הסוכרת של UCSF במעבדת בלוסטון, והיום אני הולך להראות לכם את התהליך לבידוד לולאות עכבר. ההליך כולל הזרקה של תמיסת קולגנאז לתוך הלבלב של עכבר תורם C3 H, שם נסיר את הלבלב הזה, נעכל אותו, נטהר את הלולאות בשיפוע פיאלי, ואז נבחר אותן ידנית להשתלה אולטימטיבית לתוך קפסולת הכליה של עכבר NOD סוכרתי, שיהיה המושתל שלנו.
לפני שנתחיל בהליך זה, דיללנו את תמיסת ה-ATE שלנו במאגר הנקס שונה והתאמנו את הריכוז הספציפי לזן העכבר בו אנו משתמשים ב-C3 H. מצאנו עיכול טוב יותר בתמיסת קולגנאז של 0.8 מ"ג למיל, ונשתמש בזה כדי להזריק לתוך צינור המרה המשותף כדי להרחיב את הלבלב. ביצוע. ההליך היום יהיה Pavo codre של מרכז הסוכרת. הוא יזריק, יפתח את העכבר, יחשוף את המעיים ואז יזריק לתוך צינור המרה המשותף.
נרסס את העכבר באתנול כדי לשמור על השיער למטה, ואז גם נוודא שהעכבר הוקרב כראוי עם צביטה בבוהן. פבו יפתח כעת את העכבר ויחשוף את המעי והלבלב עם חתך בקו האמצע. הסרעפת תיחתך גם כדי לוודא שהעכבר יוקרב.
לפני שנתחיל, ברצוני להצביע על כמה מהמבנים החשובים. הקיבה שוכבת ממש כאן כשהלבלב מחובר מתחתיו לתריסריון ומעליו. זהו הכבד שבו נמצא את כיס המרה ואת צינור המרה המשותף, אותו תוכלו לראות ממש כאן.
אז מה שפאבו יעשה עכשיו זה לבודד את המעי הדק, למצוא היכן צינור המרה המשותף נכנס למעי הדק. לאחר חשיפת המעי, אנו מהדקים משני צידי צינור המרה המשותף בעזרת מהדקי יתושים. אנו מוצאים שזה מאפשר ליותר קולגנטים להיכנס ללבלב בעוד קבוצות אחרות מנסות לכוון את המהדק על גבי צינור המרה המשותף.
אנו מוצאים שזו טכניקה טובה יותר לאפשר לאנזים להיכנס ללבלב. זהו הליך עדין. אתה לא רוצה לקרוע את המעי.
אתה רוצה לאפשר למהדקים לשכב בעדינות משני צידי צינור המרה המשותף. כעת נמצא כיס מרה, וברגע שכיס המרה ייחשף, נשתמש בו כמדריך להזרקת הקולגנאז לצינור המרה המשותף. פאוול משתמש במחט בקוטר 30 עם מזרק של חמישה סמ"ק המכיל שלוש טחנות של תמיסת קולגנאז.
כשהוא נכנס לצינור המרה המשותף, הוא מרחיב את הצינור הזה עם תמיסת קולגנאז ואז הוא נוסע במורד צינור המרה המשותף עד שהוא מגיע קרוב למעי. ובזמן שהוא יורד, תמיסות האנזים נשאבות לתוך הזרקה לתוך הלבלב. כעת, כשהלבלב מנופח בתמיסת קולגנאז, פאוול הולך להסיר את ההמוסטטים ואז להסיר את הלבלב מהעכבר ולקרוע אותו בזהירות מהמעי.
הוא מסיר אותו מהבטן. אוקיי, ואז משתמש בטחול כידית, הוא מרים את הלבלב ואז חותך אותו לאט לאט בצינור המרה המשותף, וזהו. הלבלב מונח ואז הטחול מוסר, ושם הוא מסיר את הרקמה המזואנטרית, ואז הלבלב מונח בתמיסת קולגנאז של שני מיל ובקבוקון זכוכית מעוקר והוא מונח בחזרה על קרח.
הלבלב המבודד שהכנסנו לבקבוקוני הזכוכית יוכנס כעת לאמבט מים של 37 מעלות למשך כ-17 דקות. הנחנו אותם במתלה חרוטי של 50 מיל כדי שלא יצופו למעלה. פעם אחת במהלך האמבטיה, הטיימר מתחיל והעיכול מתחיל.
לאחר סיום זמן העיכול, מסירים את הבקבוקונים, ואז מנערים אותם ומפריעים להם בעדינות. וברגע שהרקמה מתחילה להתפרק, הבקבוקון מונח על קרח. מסך סטרילי מונח מעל של 400 מיל המכילה מאגר כביסה.
לאחר מכן יוצקים את עיכול הלבלב בזהירות על המסך לתוך מאגר הכביסה. למטרות הדגמה, מכסה המנוע כבה והזכוכית של מכסה המנוע הורמה כדי שנוכל לראות מה אנחנו עושים. לאחר ששופכים את עיכול הלבלב לכוס, שוטפים את הבקבוקונים באותו מאגר כביסה ומאגר הכביסה מונח על המסך.
יש לנו מזרק מלא במאגר כביסה. נשתמש בזה כדי לשטוף בכוח את הטישו דרך המסך. הרעיון הוא לשחרר את כל הלולאות הרופפות שאינן מחוברות למטריצה, אך להשאיר את הממברנות ואת הרקמה הלא מעוכלת על המסך.
וכשאתה מסיים לשטוף טישו, זה מה שאתה רואה בדרך כלל בסוף ההליך. רקמת הלבלב שנמצאת בתחתית הצינור תועבר כעת לשני חרוטים של 50 מיל, והרקמה תישטף, הרקמה תערבב באופן שווה, ואז תחולק באופן שווה כך שיהיה לנו נפח כדור שווה בכל צינור. הכוס נשטפת כעת עם מאגר כביסה נוסף.
הצדדים נשטפים כך שתקבל שוב את כל הרקמה שנכנסת לכוס. ואז הוא מחולק באופן שווה בין כל השניים, שניהם 50 מיל. לאחר מכן חרוטי ממלאים במאגר כביסה.
הרקמה הופכת מספר פעמים ואז מכניסים אותה לצנטריפוגה. זהו סיבוב מהיר. הצנטריפוגה מותרת להגיע לאלף סל"ד ואז מכבה.
הרקמה בשלב זה היא מאוד S לולאות רגישות מאוד, ואתה לא רוצה לדחוס אותן יתר על המידה. הצינורות מוסרים ואנו נעשה את שלב הכביסה הזה שלוש פעמים נוספות. זה סוף הכביסה השלישית.
מרכיבי הצינור החרוטי של 50 מיל מועברים לצינור החרוטי 15 ולצנטריפוגה למשך אלף סל"ד ואז נעצרים. הסופרנאט יוסר והחלק הראשון של קריאת ה-FI יתחיל. אנחנו בשלב שבו יש לנו את עיכול הלבלב הכדורי שלנו.
אנחנו נשהה מחדש את הרקמה הזו כך שהיא תהיה נחמדה ומשוחררת לכדורים. נוסיף את שיפוע הצפיפות הראשון, שהוא 1 1 0 8. נוסיף חמישה מיל לכל צינור.
לאחר מכן מערבבים היטב את הגלולה בכל אחד מהשיפועים. חשוב שתקבל פיזור רקמות טוב בשיפוע הכבד ביותר שלך. כעת נשכב שני מילים של צפיפות 1 0 9 6.
לאחר מכן, נשכב שני מילים של צפיפות 1 0 6 9, ואז על גבי צפיפות 1 0 3 7. חשוב בזמן שאתה מסדר את הצפיפות שאתה לא מערבב. ואז כל השכבות נוספו לצינור.
ואתם יכולים לראות שזה החלק העליון של 1 1 0 8, החלק העליון של 9 1 0 9 6, החלק העליון של 1 0 6 9 והחלק העליון של 1 0 3 7. ואפשר היה לראות שהרקמה כבר מתחילה לנוע לצפיפות הנכונה שלה גם ללא איחוי צנטרי. שיפועי הפיאל מובאים למהירות של 1800 סל"ד למשך 15 דקות, וזכור לשמור על הבלם כבוי לאחר הוצאת הצינורות מהצנטריפוגה.
אתה יכול לראות בין שכבת 0 0 9 6 ו- 0 0 7, יש רצועה נחמדה של רקמת לולאה של פבלו. כעת מסירים את שכבת 0 3 7 כדי להסיר כל פסולת רקמות ו- DNA שאולי השתחררו במהלך העיבוד. באמצעות פיפטת מרעה סטרילית מפלסטיק, הוא יסיר כעת את שכבת האי ויעביר אותם לחרוט של 50 מיל המכיל 25 מיל של מאגר כביסה.
אתה רוצה לעשות את השלב הזה במהירות כי fol רעיל ללולאות. למעשה הסרנו את כל שכבת 0 6 9 ו- 0 9 6. פבו חותך את החלק העליון של פיפטת המרעה מפלסטיק ושוטף אותה עם חוצץ כביסה.
לאחר מכן הלולאות הן צנטריפוגות כמו שהיינו צנטריפוגות בעבר. מביאים את הצנטריפוגה לאלף סל"ד ואז אנחנו עוצרים אותה ואנחנו שואפים. לולאות העל יישטפו שלוש פעמים באמצעי כביסה.
אז זה עתה השלמנו את תהליך בידוד העפעפיים שלקחנו מהעיכול לשיפוע הפול ללולאות המטוהרות לאחר השטיפה השלישית שלנו עם מאגר הכביסה, השעינו מחדש את הלולאות במדיית ה-RPMI שלנו והשמענו אותה בצלחת תרבית רקמות. לולאות אלה מוכנות כעת לבדיקות מבחנה או להכנות in vivo כמו השתלת לולאות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את תהליך בידוד איים של לנגיר מעכבירי עכבר תורם מסוג C3H. הפרוצדורה כוללת הזרקת קולגנאז, הסרת הלבלב וטיהור האיים לצורך השתלה בעכבר NOD סוכרתי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אנדוקרינולוגיה
- ביולוגיה של השתלות
רקע
- השתלת איים היא טיפול פוטנציאלי לסוכרת.
- בידוד של איי לבלב מחייב עיכול אנזימטי ספציפי.
- קולגנאז (Collagenase) משמש באופן נפוץ לבידוד איים (islet isolation).
- מודלים של עכברים נמצאים בשימוש תכוף במחקרים על סוכרת.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה מהימנה לבידוד איים של עכבר.
- להכין איים להשתלה במקבלים סוכרתיים.
- להגביר את ההבנה של תפקוד האיים וחיוניותם לאחר הבידוד.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקת תמיסת קולגנאז ללבלב.
- הוצאה ועיכול של הלבלב.
- טיהור של איים באמצעות מדרג Ficoll.
- בחירה ידנית של איים להשתלה.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של איי לבלניק מהלבלב.
- איי לבלניק שהוכנו להשתלה הראו חיוניות.
- השיטה הוכיחה יעילות עבור מחקרים עתידיים.
- פוטנציאל לשיפור הטיפול בסוכרת באמצעות השתלה.
מסקנות
- השיטה המתוארת יעילה לבידוד איים של עכברים.
- השתתלת איים יכולה להוות אפשרות רלוונטית עבור מודלים של סוכרת.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על טכניקת בידוד זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד של אילי לבלבל תפקודיים ממודלים עכבריים מאפשר הערכה פרה-קלינית של טיפולים לסוכרת ואסטרטגיות רגנרטיביות. טכניקה זו תומכת בתיקוף מטרות במחלות מטבוליות על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה להערכת הפרשת אינסולין, חיוניות השתל והתערבויות אימונו-מודולטוריות. תנובת איים אמינה מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מולקולות מובילות ובצמצום סיכונים פרה-קליני עבור גישות מבוססות השתלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בהומיאוסטזיס של גלוקוז ובתפקוד תאי בטא באמצעות אילי לבלב ראשוניים של עכברים.
- ערך תפעולי: מספק מקור סטנדרטי של רקמה ראשונית למחקרי מעורבות מטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק איים מטוהרים המתאימים לבדיקות תפקודיות למדידת הפרשת אינסולין וחיוניות תאיות.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות הכנה עקבית של הרקמה וטיהור במדרג צפיפות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מסייע בהערכת יעילות השתלת איים בלבלב במודלים של עכברי NOD עם סוכרת.
- ערך תפעולי: מאפשר רצף משלב הבידוד ועד למחקרי השתבצות, ובכך תומך בתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי על ידי אספקת רקמות ראשוניות מאושרות לצורך תיקוף מטרות, פיתוח בדיקות ומחקרי השתקה פרה-קליניים בחקר הסוכרת.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על תפקוד איים, הישרדות ותגובה למודולטורים חיסוניים או תרכובים רגנרטיביים.
- סריקה: מאפשרת הכנה הדירה של איים עבור קריאות תפקודיות ברמת דיוק גבוהה במערכי סריקה של תרכובים.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים כמותיים כגון שחרור אינסולין ומדדי חיוניות לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין הבידוד לתיקוף פרה-קליני באמצעות השתלה לנRecipientים סוכרתיים, תוך הערכת תפקוד השטבל וסבילות חיסונית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת הדירה להפקה של איים רלוונטיים למחלה עבור מספר תוכניות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות רקמה ראשונית הרלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה בבידוד איים באמצעות עיכול בקולגנאז וטיהור במדרג Ficoll.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי הפחתת אי-ודאות ביולוגית במודלים פרה-קליניים של סוכרת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של אסטרטגיות השתלה והתחדשות על בסיס תפקוד מאושש של האיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים בעכברים וטיפול ברקמות לצורך בידוד ועיכול של הלבלב.
- תלוי בהכנת תמיסת קולגנאז ובאופטימיזציה של הריכוז עבור זני עכברים ספציפיים.
- מחייב גישה לציוד צנטריפוגה לצורך הפרדה במדרג צפיפות ושלבי שטיפה.
- כולל שיקולי התאמה לווריאציות ספציפיות לזן בגודל הלבלב וביעילות העיכול.
- מוגבל על ידי רגישות הרקמה במהלך העיבוד, מה שדורש טיפול עדין כדי לשמר את חיוניות ותפקוד האיים.
