בידוד והתרבות של תאים מאזור nephrogenic של הכליה עכבר עובריים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק תרבית ראשונית של תאים מאזור הנפרוגני (nephrogenic zone) מהכליה המתפתחת. זאת משיגים תחילה על ידי דיסקציה של כליות מעוברים ביום 17.5. השלב הבא של הפרוצדורה הוא הסרת הקפסולות של הכליה.

לאחר מכן מבוצע עיכול אנזימטי מוגבל של האיברים כדי לשחרר תאי מזנכימה של הכובע (cap mesenchyme) ותאי סטרומה קורטיקליים מאזור הנפרוגני. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא זריעת התאים על פיברונקטין וגידולם במצע ללא סרום. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המדגימות אוכלוסיית תאים מזוקקת של האזור הנפרוגני באמצעות צביעה אימונולוגית של סממנים ספציפיים.

למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור העברת אותות תאיים, ניתן ליישם אותה גם כדי להבין את דרישות התשתית להתרחבות תאית. לדוגמה, עבור טכניקות השתלה, את הפרוצדורה ידגימו דרק אדאמס, טכנאי במעבדה שלי, ואהרון בראון, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. לאחר הכנת התמיסות הדרושות וטיפול בצלחות תרבית הרקמה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, התחילו את הניתוח של כלית עוברית של עכבר על ידי הקרבת האם ביום E 17.5.

בהתאם להנחיות המוסדיות שלכם, הוציאו את הרחם והניחו אותו בתוך צלחת פטרי המכילה מספר מיליליטרים של תמיסת סליין מחוצבת (buffered saline) או DPBS עם סידן ומגנזיום. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו בפינצטה עדינה (watchmaker's forceps) כדי להוציא כל עובר ובפינצטה נוספת כדי לבצע עקירה של הראש (decapitation). לאחר שכל השגרייה הוצאה מהרחם וראשיה הוסרו, העבירו את העוברים לצלחת פטרי נקייה המכילה מספיק DPBS עם סידן ומגנזיום כדי לכסות את העוברים.

השאירו מאחור כמה שיותר דם ושאריות רקמה עבור כל עובר, ובצעו חתך היקפי בדופן הבטן בגובה הטבור באמצעות פינסטות. לאחר מכן, הניחו את העובר על גבו וקבעו את הכתפיים בעזרת סט אחד של פינסטות. באמצעות סט שני של פינסטות, הסירו את האיברים הפנימיים מהריאות ועד לשלפוחית השתן.

הכליות יהיו מחוברות לחלק האחורי של מסת האיברים הפנימיים. לאחר מכן, הפרידו בעדינות את הכליות משאר האיברים. הקפידו להשאיר את הכליות מחוברות זו לזו.

לאחר מכן, החזיקו את הרקמה שבין הכליות באמצעות סט אחד של פינצטות, ואחזו בבלוטת העלה המחוברת לקפסולה של אחת הכליות באמצעות הפינצטות השנייה. קלפו בעדינות את הקפסולה מהכליה. היזהרו לא לפגוע בכליה.

הקפידו להסיר כל שארית של קפסולה מהכליה וכן מהרחם אם הוא עדיין מחובר. חזרו על הפעולה עם הכליה שנותרה. לבסוף, גזרו פיפטת העברה לקוטר מתאים והעבירו בעדינות את הכליות לשפופרת פוליסטירן של 5 mL המכילה HBSS.

חזור על בידוד הכליות עבור כל עובר ואיסוף של הכליות לשפורור בתוך המבחנה, עד לשמונה כליות למבחנה, בסביבה סטרילית. התחל את תהליך העיכול האנזימטי על ידי הסרת תמיסת ה-HBSS מהמבחנה בנפח חמישה מיליליטר המכילה את הכליות באמצעות פיפטה. היזהר לא לבוא במגע עם הכליות והוסף מיד 1.5 milliliters של קולגנאז, תמיסת עיכול Pancreatin.

חזרו על הפעולה עבור כל מבחנה של כליות וסגרו את המבחנות. לאחר מכן, הניחו אותן על שייקר במקדם (incubator) בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. רגע לפני סיום הדגירה, הוסיפו 3 µL של DNase בריכוז של 1 unit per microliter למבחנת פוליסטירן נקייה של 5 mL עבור כל עיכול המבוצע.

לאחר האינקובציה, הוצא במהירות את תערובת העיכול מהאינקובטור והוסף 75 µL של FBS; הפוך את המבחנה שלוש פעמים כדי לערבב. השאר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. לאחר מכן, העבר 1.4 mL של תרחיף התאים למבחנת פוליסטירן של 5 mL המכילה DNAs Mix והצב במכשיר ערבוב (mutator) בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות.

לאחר הדגירה, העבר כל תרחיף תאים לשפופרת Einor של 1.5 מיליליטר וסבב בצנטריפוגה ב-325 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את העלייה (supernatant), סבב את השפופרות בצנטריפוגה ב-325 ×g למשך חמש דקות. השהה מחדש את המשקע ב-1 מיליליטר של 5% FBS-HBSS על ידי שאיבה והזרקה (pipetting) חמש עד שש פעמים.

סגרו כל מבחנה לפני המעבר לדגימה הבאה. לאחר הצנטריפוגה, הסירו את ה-SNAT והוסיפו 500 µL של KSFM עם תוספים לכל מבחנה, לאחר שהתווך הוסף לכל המבחנות. השביו בעדינות כל משקע תאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש עד שש פעמים באמצעות מיקרופיפט של 1 mL. איחדו את כל תליי התאים במבחנת פוליסטירן נקייה של 5 mL.

כעת סננו את תרחיף התאים דרך מכסה של מסננת תאים בנקבים של 40 מיקרון שהורטבה מראש, ואספו את הנוזל המסונן לשפופרת פוליסטירן חדשה. הימנעו ממגע של קצה הפ pipette במסננת לאחר שכל הנוזל המסונן נאסף. סננו את הנוזל המסונן פעם שנייה דרך מסננת תאים חדשה שהורטבה מראש.

הסיר את המסננת וסגור את המבחנה עם פקק סטרילי חדש ממבחנה אחרת. ספור את התאים וזריעה בצפיפות של 100, 000 עד 200, 000 תאים לסנטימטר רבוע ב-KSM עם תוספים בצלחת תרבית מקודדת בסיבים. אפשר לתאי האזור הנפרוגני להתאושש ולהיקשר באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך שעתיים עד ארבע שעות לפני כל סטימולציה לצורך הניסוי.

מוצג כאן תמונה בניגודיות פאזה (phase contrast) בהגדלה של 20x של תאי אזור נפרוגני (nephrogenic zone) שנזרעו בריכוז של 200,000 תאים לסמ"ר ותורגדו למשך 24 שעות. בתמונה זו, תאי האזור הנפרוגני נצבעו עם נוגדן anti PAX two, הספציפי לתאי אב של נפרונים, ומוצגים בצבע אדום, בעוד הגרעינים נצבעו בצבע כחול באמצעות dapi כצביעה נגדית.

תצוגת ניגודיות פאזה (phase contrast) של צבר תאי אב של נפרונים מוצגת בהגדלה של 40x. כדי להוכיח ספציפיות נוספת, תאי אזור נפרוגני בודדו מעוברים שבהם laxy נמצא תחת בקרתו של מקדם Fox D one, המובע באוכלוסיית תאי הסטרומה. בתוך האזור הנפרוגני של הכליה המתפתחת, התאים נצבעו ב-DAPI לצביעת גרעינים בכחול, phalloidin עבור F actin בירוק ו-anti beta lactase באדום.

לאחר רכישת המיומנות, ניתן להפיק תרבית ראשונית של שכבה אחת (monolayer) של תאי אזור נפרוגני (nephrogenic zone) תוך כשעתיים. תרביות אלו מאפשרות מחקרים מהירים ובעלי תפוקה גבוהה של מסלולי איתות תאיים בהתפתחות תאי אב של נפרונים, שכן הן רגישות מאוד לטיפול באמצעות טרנסדוקציה ויראלית, חלבונים רקומביננטיים ומולקולות קטנות. ניתן להשתמש גם בהליכי מיון תאים נוספים כדי לבודד סוגי תאים ספציפיים מתרביות אלו.