השתנה ES / OP9 שותף לתרבות פרוטוקול מספקת שירותי אפיון משופר צאצאיהם hematopoietic
7 ביוני 2011
mStrawberry OP9 התאים מאפשרים הערכה מלאה של הצאצאים ES-derived כל מתרבות משותפת.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לגזור תאי גזע עובריים של עכברים לשוורות המטופואטיות פרימיטיביות ודפיניטיביות שונות. כדי לאפיין את כל צאצאי תאי ה-ES, השגת בידול תאים המטופואטיים של עכברים מתבצעת על ידי הנחת תאי ES על שכבה של תאי סטרומה OP9 המסומנים פלואורסצנטית ב-M strawberry ובצפיפות גבוהה (confluent). כל יום של בידול או תרבית משותפת (co-culture) מייצג את השלבים השונים של ההתפתחות ההמטופואטית במועד הקצירה המתאים.
ניתן להפריד תאי צאצאים של תאי ES מובחנים מקו תאי הססתומה M strawberry OP nine באמצעות מיון תאים. פרוטוקול בידול זה של תאי ES משחזר המטופואזה פרימיטיבית ודפיניטיבית כפי שנצפית in vivo, וניתן להשתמש בו לאפיון פגמים המטופואזיים הקשורים לקווי תאי ES עם נוק-אאוט ללא שימוש בעובריים. שלום, ברוכים הבאים למעבדתה של ד"ר Judith Gassen במרכז הסרטן המקיף ג'ונסון של UCLA.
שמי הוא אליסיה פוז. היתרון העיקרי של הטכניקה שאציג בפניכם היום על פני שיטות קו-קלטור (co-culture) קיימות של ESO תשעה הוא שפרוצדורה זו מאפשרת את העברתו של כל תאי יום 5 ויום 8, וכן הפרדה מלאה של כל הצאצאים שנגזרו מתאי ES. מהסטרומה של תשעה, תאי OP תשעה גדלים במצע תרבית לתאי OP תשעה, שיש להחליפו מדי יומיים.
יש לבצע תת-תרבית לתאי OP9 שלושה ימים לפני המועד שבו הם דרושים לתרבית משותפת. חשוב לציין כי במהלך התחזוקה, אין לשמור את תאי ה-OP9 בצפיפות העולה על 90% קונפלואנס. ראשית, שטפו את התאים פעמיים ב-PBS, ולאחר מכן הוסיפו 0.1% trypsin EDTA שחומם מראש למשך חמש דקות, עד שהתאים ניתקו. הוסיפו מצע גידול לתאי OP9 והעבירו את התאים למבחנה קונית של 50 מיליליטר.
לאחר צנטריפוגציה, השקיעו את התאים במבחנה ב-300 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, השליכו את הנוזל העליון והשאיבו מחדש את התאים במצע תרבית תאים טרי מסוג M strawberry OP nine. זרעו את התאים בצפיפות מינימלית של 10⁴ cells cm⁻² ביום תחילת ניסוי התרבית המשולבת. תאי ה-OP nine שסובקלו לפני שלושה ימים צריכים להיות קונפלואנטיים. יש לתרבת את תאי ה-ES בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי עבור קו התאים הספציפי שלכם.
שטפו את תאי ה-ES פעמיים ב-PBS, בצעו עיכול בתאי ה-ES באמצעות trypsin EDTA בריכוז 0.25% והדגירו למשך חמש דקות ב-37 °C. לאחר מכן, הוסיפו מצע דיפרנציאציה לתרבית משותפת (co-culture differentiation media) לתאי ה-ES והעבירו אותם למבחנות קוניות של 15 milliliter. השקיעו את תאי ה-ES ב-400 G למשך חמש עד שבע דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), השביה את תאי ה-ES במצע בידול לעוברית משותפת (co-culture differentiation media). השתמש במחט קהה בכילייב 21 כדי להשיג תליה של תאים בודדים. ספור את התאים באמצעות trypan blue והמוציטומטר.
כעת הוציאו את הבקבוק של M strawberry. הוציאו תאי OP nine מהאינקובטור. הסירו את המצע מתאי ה-OP nine והוסיפו מצע דיפרנציאציה לתרבית משותפת (co-culture) לצלחת הבקבוק.
הוסיפו 10³ תאי ES לכל סמ"ר לכל בקבוק של תאי M strawberry OP nine. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C, ב-5% carbon dioxide עם לחות. זהו היום האפס, והתרבית המשותפת צריכה להיראות כך. שלושה ימים לאחר תחילת תרבית ה-CO-culture של ES ומסוג M strawberry OP nine.
נצפות בעיקר צבירים שטוחים וגדולים של צאצאים שנגזרו מתאי ES עם גבולות מוגדרים, וחלק ממערבולות התאים יחלו להיווצר. הסר בזהירות את המצע מהקו-קלטורה והחלף אותו במצע דיפרנציאציה טרי חמישה ימים לאחר תחילת הקו-קלטורה. דיפרנציאציה תקינה של תאי ES על שכבה מלאה (confluent) של תאי M strawberry OP nine אמורה להביא להיווצרות heman eblasts, הנראים כמערכות תאים נערמות.
ההיבט הקריטי ביותר של הליך זה הוא הבטחת בידול תקין ביום החמישי של השיתוף-תרבית (co-culture). בנקודה זו, ניתן לראות את מושבות ה-heman eblast לא רק באופן מיקרוסקופי, אלא גם באופן מקרוסקופי. שטפו בזהירות את השיתוף-תרבית פעמיים עם PBS ובצעו טריפסין לתאי ה-ice באמצעות 0.25% trypsin EDTA, שטפו את התאים מהבקיתה (flask) עם מצע בידול ES והעבירו למבחנה; השקיעו את התאים ב-400 G למשך שבע דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר סנטריפוגציה, הסר את supernatant והוסף מצע גידול חדש. לאחר מכן, השתמש במחט קהה במידה 21 (21 gauge) כדי לסספנד מחדש את התאים, וכדי להבטיח סספנסיות של תאים בודדים, ספור את התאים באמצעות hemo cytometer; צפויה עלייה של פי 100 עד 150 במספר תאי ה-ES לעומת היום האפס. זרע מחדש את תאי ה-co-culture על שכבה חדשה של תאי M strawberry OP nine קונפלואנטים ביום השמיני או התשיעי, וביום ה-12 ספור את התאים שוב. הסר את מצע הגידול עם התאים ההמטופואטיים ושמור אותם.
שטפו את השכבה החד-שכבתיות (monolayer) פעם אחת עם PBS. כדי להסיר תאי המטופואטיים בתגלוש (suspension) ולשמרם, הוסיפו 0.25%tripsin EDTA לבקבוק; לאחר היצמדות ה-trypsin, שטפו את התאים מהבקבוק באמצעות מצע בידול ES והוסיפו אותם לתאים ההמטופואטיים שנמצאו בתגלוש. צנטריפוגו את התאים ב-400 G למשך שבע דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, השביו את התאים באמצעות מחט בעלת קצה קהה (blunt end needle) בכיל 21 וספרו את התאים. התאים מוכנים כעת להזרעה מחדש או לשימוש בניסויים המשכיים.
ניתן להשתמש במערכת השיתוף-תרבית של ES M strawberry OP nine כדי למדל את ההתפתחות ההמטופואטית שתוארה. להלן סקירה כללית של מהלך הזמן של השיתוף-תרבית, שבה מצוינים הימים שבהם יש להעביר את צאצאי ה-ES המובחלים לתאי M strawberry OP nine חדשים. בידוק תקין של תאי ES על שכבה מלאה (confluent) של תאי M strawberry OP nine יוביל לייצור של flick one positive.
אנגיובלסטים ביום החמישי של תרבית משותפת. אוסטאובלסטים אנושיים הם קדמון מזודרמי נפוץ לשושלות האנדותליאליות וההמטופויטיות, ועליהם להופיע כערימות של תאים, כפי שמוצג בתמונה זו. עם התקדמות התרבית המשותפת, צפופים של שני עד ארבעה תאים אמורים להופיע ביום השישי או השביעי ולהתפתח לצבירי תאים גדולים יותר. ביום השמיני או התשיעי קדמונים המטופויטיים כבר נוכחים (החל מיום השישי), בעוד ששושלות המטופויטיות המובחנות סופית מופיעות ביום ה-14.
לעומת זאת, תרבית משותפת עם התמיינות ESL לקויה תביא לצאצאים המופקים מ-ES שאינם מופיעים בתבנית עולמית (world pattern) ביום החמישי. היעדר תאים בתבנית עולמית מעיד על היווצרות לקויה של GIO blasts. תרבית משותפת עם היווצרות eblast לקויה תוביל בסופו של דבר להתמיינות מעוכבת של שושלת ההמטופואטית ויש להשליכה תחת פרוטוקול תרבית משותפת ES OP nine משופר זה.
צאצאים שנגזרו מתאי ES הם שליליים ל-m strawberry וניתן למיינם באמצעות מיון זרימה (flow sorting) מהתאים החיוביים ל-M strawberry. ביום כלשהו של תרבית משותפת, יש לאסוף תשעה תאים להערכה. תוצאות מניסוי מייצג מוצגות כאן.
תשעי פרוטוקולי תרביות-משותפות של ES OP שפורסמו בעבר התמקדו אך ורק בהעברה ובהערכה של התאים הצפים שאינם נצמדים. בפרוטוקול שונה זה, כל התאים שנגזרו מ-ES, הן תאים נצמדים והן תאים שאינם נצמדים, עוברים העברה וניתן להערכתם. הדבר מוביל לתנובה מוגברת של תאי המטופואזה, מאפשר זיהוי של אוכלוסיות תאים נדירות, ומספק מאפיין מלא של כל צאצאי ה-ES, הן ההמטופואטיים והן אלו שאינם המטופואטיים.
סקירה כללית
מחקר זה מדגים שיטה לגזירה של תאי גזע עובריים של עכבר (ES cells) לשורות המטופאלטיות באמצעות תאי סטרומה mStrawberry OP9. הפרוטוקול מאפשר הערכה מלאה של כל הצאצאים הנגזרים מתאי ES, ובכך מקל על חקר ההתפתחות ההמטופואלית ופגמים הקשורים אליה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- המטופואזיס
- טכניקות לתרבית תאים
רקע
- תאי גזע עובריים של עכברים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים.
- התפתחות המטופוייתית חיונית להבנת הפרעות בדם.
- שיטות קיימות עשויות שלא לאפשר הערכה מלאה של כל הצאצאים.
- תאי סטרומה OP9 מספקים סביבה תומכת להתמיינות.
מטרת המחקר
- להבדיל תאי ES של עכבר לסוגי תאים המטופוטיים.
- לאפיין את כל הצאצאים הגזורים מ-ES מתרבית משותפת.
- לדגמן התפתחות המטופוטית ללא שימוש בעוברי עובר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תיבית-משותפת של תאי ES עם תאי סטרומה OP9 המבטאים mStrawberry.
- מיון תאים להפרדת צאצאים מבדלים.
- הערכה מיקרוסקופית ומקרוסקופית של מקבצי תאים.
- ספירת תאים באמצעות trypan blue והמוציטומטר.
תוצאות עיקריות
- דיפרנציאציה מוצלחת של תאי ES לסלולוארים המטופואטיים.
- תצפית על מקבצי תאים מובחנים בשלבי דיפרנציאציה שונים.
- עלייה במספר התאים, המעידה על דיפרנציאציה יעילה.
- אפיון של פגמים המטופואטיים בקווי תאי ES עם נוק-אאוט (knockout).
מסקנות
- מערכת השיתוף-תרבות (co-culture) של mStrawberry OP9 ממצגת באופן יעיל התפתחות המטופואטית.
- שיטה זו מאפשרת הערכה מלאה של צאצאים המופקים מתאי ES.
- היא מספקת כלי בעל ערך לחקר פגמים המטופואטיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול השיתוף-תרביות (co-culture) המשופר של ES/mStrawberry OP9 מאפשר אפיון מקיף של צאצאים המטופויאטיים מתאי גזע עובריים, ובכך פותר צוואר בקבוק מרכזי בשלבי הגילוי המוקדמים ותיקוף המטרות במחקר המטופויאטי. על ידי לכידה של תאים ממקור ES הן אדהפנטיים (נדבקים) והן לא-אדהפנטיים, שיטה זו מגבירה את הביטחון החזוי במידול של התפתחות המטופויטית ובהערכת הפרעות גנטיות. גישה זו תומכת בהחלטות תיק בניהול סיכונים על ידי אספקת הערכה כמותית ומלאה יותר של תוצאות הדיפרנציאציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מחויבות לשושרית ההמטופואטית ומידול נתיבי התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של שינויים גנטיים או השתקות (knockouts) המשפיעים על ההתפתחות ההמטופואטית.
- תומך בביטחון חיזוי בבחירת מטרות בשלבים מוקדמים על ידי מידול דפוסי התמיינות הדמים דומים לאלו המתרחשים in vivo.
- משפר את הפחתת הסיכונים המכניסטיים על ידי מתן אפשרות לגילוי פגמים נדירים או עדינים בשושריות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת in vitro מתוקפשת ליצירה וכמות של פרוגניטורים המטופואטיים ושושלות בוגרות.
- מאפשר איסוף סטנדרטי וניתן לשחזור של כל הצאצאים הנגזרים מתאי ES עבור בדיקות המשך.
- תומך בקריאות כמותיות ובמדרגיות עבור זרימות עבודה של סריקת תרכובות או סריקה גנטית.
- משפר את מוכנות הבדיקה על ידי סילוק זיהום של תאי סטרומה באמצעות סימון פלואורסצנטי ומיון תאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מדמה התפתחות המטופואטית הרלוונטית למחלה לצורך גילוי ביומרקרים תרגומיים.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי שחזור דפוסי המטופואזה עובריים.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של מטרות מועמדות או התערבויות, בהתבסס על נתוניו דיפרנציאציה מקיפים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות למידול in vitro חסון של דיפרנציאציה המטופואטית, תיקוף מטרות ומחקרי גנומיקה תפקודית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים להגדרת שושלת המטופוייטית.
- סריקה: מספקת פלטיים כמותיים הניתנים לשחזור להערכת הפרעות גנטיות או כימיות.
- אנליזה: מספקת ספירת תאים, סמני שושלת וזיהוי של אוכלוסיות נדירות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מתאימה דפוסיה בידול in vitro עם המטופוייזה עוברית in vivo לצורך תיקוף של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית הניתנת לשימוש חוזר עבור צורכי סריקה ומחקר המטופוייטיים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות המטופה (hematopoietic target validation).
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בדיקות דיפרנציאציה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות יעילה יותר לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ויעילות הון על ידי אספקת נתוני דיפרנציאציה מקיפים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מטרות או התערבויות המטופה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאי גזע, דיפרנציאציה וציטומטריה של זרימה למיון תאים.
- נדרשת גישה לקווי תאי סטרומה מסומנים פלואורסצנטית ומכשור אנליטי מתאים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים לגבי טיפול בתאים, תזמון הדיפרנציאציה ופרוטוקולים לניתוח נתונים.
- ייתכן ויהיה צורך בהתאמות עבור קווי תאי ES שונים או מערכות מודל ספציפיות למינים.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות את הצורך בניטור קפדני של איכות הדיפרנציאציה וזיהום של תאי סטרומה.
