Name: השתנה ES / OP9 שותף לתרבות פרוטוקול מספקת שירותי אפיון משופר צאצאיהם hematopoietic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: למדו להבדיל תאי גזע עובריים של עכברים לתאים המטופויאטיים באמצעות שכבת תאי stromal מסומנים בפלואורסצנטית OP9. פרוטוקול זה מאפשר הערכה מלאה של כל הצאצאים הנגזרים מ-ES לחקר פיתוח תאי דם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים U. Ganapati להקמת ובדיקה של הקו OP9 mStrawberry התא. בנוסף, אנו מודים ח Shafifor הסיוע שלה עם התרבות המשותפת. HP נתמכת על ידי מענק מן הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (F31HL087714) (HP). התוכן של עבודה זו היא באחריות הבלעדית של המחבר ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של לב ריאה הלאומי, ודם המכון או המכון הלאומי לבריאות (NIH). Cytometry זרימה UCLA מתקן Core נתמכת על ידי NIH (CA-16042 ו-AI-28697), סרטן Jonsson מרכז האיידס UCLA המכון, ובית הספר לרפואה של UCLA.

1. הכנת תאים ES <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ES התרבות התאים על פי פרוטוקול סטנדרטי קו התא הספציפי שלך. הקפד להכין תאים ES מספיק על צלחת של תאים OP9 mStrawberry יום 0 (תאים ES יהיה מצופה ב 1x10 ^ 3 ס"מ 2 תאים לכל יום בו 0) </li></ol> 2. הכנת OP9 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני גדל OP9 תאים mStrawberry, להכין את OP9 התקשורת צמיחה OP-9 תרבית תאים בינוני <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מניות </td><td> סופי קונצרט כלשהו. </td><td> נפח (מ"ל) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS (OP-9 נבדק) </td><td> 100% </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 100x (200mm) </td><td> 2mm </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50 מ"ל </td></tr></tbody></table> חנות ב 4 ° C ושימוש בתוך שבוע הכנה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על mStrawberry OP9 תאים, התקשורת חייבת להיות שונה בכל 2 ימים תאים צריך להיות subcultured לפני תאים להגיע confluency (תת על 70-90% confluency). mStrawberry OP9 בתרביות תאים לא בוגרים מעבר ל -90% confluency כמו זו תגרום הבידול שלהם לתוך adipocytes. ראה איור 3. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים על ידי תאים תת כביסה 2X עם PBS (או 1x עם PBS% + 0.1 1x עם טריפסין-EDTA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טרום חימם 0.1% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (או עד תאים לנתק) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים יש מנותקת, להוסיף OP-9 בינוני צמיחה. העברת התאים שפופרת 50 מ"ל קונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה בשעה XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מחק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב טרי OP9 התקשורת mStrawberry צמיחה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים בצפיפות מינימום של 4 תאים 10 / 2 ס"מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול mStrawberry OP9 התאים confluency החל 3 ימים לפני יום הדרושים שיתוף culturing תאים ES (יום 0, יום 5, או Day8 / 9 של הניסוי) </li></ol></li></ol> 3. ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שותף תרבות התקשורת בידול <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מניות </td><td> סופי </td><td> נפח (מ"ל) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 100% </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 200mm </td><td> 2mm </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50 מ"ל </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> mStrawberry OP9 תאים (יום -3) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד תת OP9 תאים -3 הימים, כך שיש לך שכבות של ומחוברות OP9 תאים mStrawberry עבור 0 יום של תרבות משותפת. ראו תרשים 4 ב. פלייט mStrawberry OP9 תאים ב 1x10 4 / 2 ס"מ עבור confluency ב יום 0. הקפד תאים עודפים תת ליום 5 ויום 09/08 להמשך תרבות משותפת. </li></ol></li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> ES / mStrawberry OP9 שיתוף התרבות הגדרת (יום 0) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים ES 2x עם PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים ES עם 0.25% טרום חימם טריפסין-EDTA, דגירה של 5min @ 37 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת שותף לתרבות התקשורת בידול לתאי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה ES תאים ב 400xg, 5-7min, RT. בטל supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב Co-תרבות התקשורת בידול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה OP9 תאים mStrawberry </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת שותף לתרבות התקשורת בידול כדי צלוחיות mStrawberry OP9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 1x10 3 תאים ES / 2 ס"מ על בקבוק של OP9 תאים mStrawberry. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם לחות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> mStrawberry OP9 תאים (יום 2) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MStrawberry תת OP9 כך יש לך ומחוברות שכבות של תאים OP9 mStrawberry יום 5 של תרבות משותפת. פלייט mStrawberry OP9 תאים ב 1x10 4 / 2 ס"מ עבור confluency יום ב 5 (כמו בשלב 3.2). הקפד תאים עודפים תת ליום 8 / 9, במידת הצורך (כמו בשלב 2.2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות (יום 3) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות בינוני מתרבות שיתוף ולהחליף בינוני טרי משותף תרבות בידול </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות (יום 5) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בזהירות שיתוף תרבויות 2x עם PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים עם 0.25% טרום חימם טריפסין-EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבקבוק תאים עם שותף לתרבות התקשורת בידול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה בשעה 400xg, 7min, RT. מחק supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הוספת שותף לתרבות התקשורת בידול לתאים. השתמש מחט 21-מד bluntended resuspend אל התאים ולהבטיח להשעיה תא בודד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer. האם יש 100-150 גידול של פי מספר תאים ES מיום 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-זרע 6.48x10 4 / 2 ס"מ - 7.76x10 4 / 2 ס"מ שיתוף התרבות התאים על שכבה חדשה של ומחוברות, OP9 תאים mStrawberry </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5 מבחני-נותרת שיתוף התרבות תאים יכול לשמש עבור ניתוח תזרים cytometry, cytopreps (30K תאים), מבחני CHIP, וכו ' </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות (יום 8 / 9 ויום 12) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה בידול מן הבקבוק ולשמור. לשטוף monolayer 1x עם PBS להסיר תאים hematopoietic ההשעיה. לזרוק אל מחוץ לתאי hematopoietic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים חסיד עם 0.25% טרום חימם טריפסין-EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבקבוק תאים עם התקשורת בידול ES ולהוסיף תאים hematopoietic למצוא השעיה = </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה בשעה 400xg, 7min, RT. מחק supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף משותף תרבות בידול התקשורת או PBS לתאים. השתמש מחט 21-מד bluntended resuspend אל התאים ולהבטיח יחיד השעיית ספירת תאים תאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף התרבות ניתן נמשך 14 ימים כדי להעריך אבות hematopoietic יותר בוגרת מחדש על ידי זריעת שיתוף התרבות תאים על גבי שכבה חדשה של ומחוברות, OP9 תאים mStrawberry בכל יום 8 או 9 ואז שוב ביום 12. Re-תא זרע מספר אופטימיזציה המבוסס על התאוששות התא נדרש יום assay. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכה של הצאצאים ES-derived (יום 1-14). ES-derived הצאצאים ניתן להעריך בכל יום של תרבות משותפת על ידי זרימת מיון תאים שלילי mStrawberry (ES-derived הצאצאים). <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה בידול מן הבקבוק ולשמור. לשטוף monolayer 1x עם PBS להסיר תאים hematopoietic ההשעיה. אין להשליך החוצה תאים hematopoietic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים חסיד עם 0.25% טרום חימם טריפסין-EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבקבוק תאים עם שותף לתרבות התקשורת בידול ולהוסיף תאים hematopoietic למצוא השעיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים ב 400xg, 7min, RT. בטל supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend עם מחט 21-מד לספור bluntended ו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצאצאים ES-derived (תאים שלילי mStrawberry) יכול להיות זרימה של מיון mStrawberry OP9 תאים חיובית. הצאצאים ES-derived אז יכול להיות מאופיין על ידי ניתוח תזרים cytometry, cytopreps, מבחני CHIP, וכו ' </li></ol></li></ol> 4. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ES / mStrawberry OP9 משותף התרבות המערכת. המעבדה שלנו משתמשת במערכת במבחנה ES תא שיתוף התרבות לפיתוח מודל hematopoietic. במערכת שיתוף תרבות זו, תאים ES להבדיל, לתוך hemangioblasts ב Day5, כאשר הניח על שכבה של ומחוברות OP9 תאים mStrawberry. כמו שיתוף תרבות התמורה, מבשרי hematopoietic נוכחים יום 8, בעוד שושלות hematopoietic הבדיל סופני להופיע עד יום 14. החצים מצביעים על ימים של בידול כאשר passaging של הצאצאים ES-נגזר על שכבות ומחוברות חדש של תאים OP9 mStrawberry ב הצורך. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ES פרופר התמיינות תאים. לתאי גזע עובריים הם זורעים על שכבת ומחוברות של mStrawberry OP9 ב יום 0. ES-derived הצאצאים מתחילים להיות גלוי בכל יום 3 של בידול, עם ES-derived הצאצאים נראה כמו מקבץ של תאים עם גבול מוגדר או מתחילים ליצור דפוס במערבולת. Hemangioblasts, שהם מבשר mesodermal משותף השושלות האנדותל hematopoietic, אמור להופיע כמו נערמו דורים של תאים בכל יום 5. עבור שיתוף תרבות תקופות ארוכות יותר מחמישה ימים, ES-derived הצאצאים אמור להופיע כמו אשכולות של תאים hematopoietic. שניים עד ארבעה אשכולות תאיים, יום ב 6 / 7, אמורה להופיע ולצמוח לתוך צבירי תאים גדולים עד יום 09/08 של תרבות משותפת. הצאצאים ES אחרים הנגזרים מצויים גם קשור בחוזקה שכבת תאים חסיד סטרומה. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. הבחנה מוצלחת תא ES. תוצאות מתרבות שיתוף זה משקף הבחנה פסולה תא ES. שים לב איך הצאצאים ES-derived אינם מופיעים בדפוס במערבולת ב יום 5. היעדרם של תאים דפוס במערבולת מציין היווצרות hemangioblast פסולים. אם hemangioblast לא מתפתח כראוי, ולאחר מכן המשיך שיתוף תרבות תגרום בידול ננסיים השושלת hematopoietic. משותף עם היווצרות תרבויות hemangioblast פסולים אמור להיות מושלך. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. mStrawberry OP9 תא תרבויות. (א) תא mStrawberry OP9 הם subcultured בביתConfluency 70-90%. (ב) הבחנה נכונה, תאים ES ו ES-derived הצאצאים מונחות על שכבת ומחוברות מדי של תאים OP9 mStrawberry. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. נציג ES / mStrawberry OP9 שותף תרבות פרופיל זרימה. כל הצאצאים ES-derived הם תאים שלילי mStrawberry וניתן תזרים מיון מן OP9 תאים mStrawberry. תא mStrawberry שער שלילי נקבע באמצעות ES/OP9 המסורתית שיתוף תרבות.

<ol><li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+mammalian+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of mammalian hematopoiesis.</a> Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).</li>
<li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+patterning+of+the+mouse+embryo%3A+implications+for+hematopoietic+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation.</a> Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).</li>
<li>Baron, M. H., Fraser, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specification+of+early+hematopoiesis+in+the+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">The specification of early hematopoiesis in the mammal.</a> Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).</li>
<li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies%3A+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).</li>
<li>Ganapati, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+notch+signaling+in+normal+and+neoplastic+hematopoiesis%3A+global+gene+expression+profiling+in+response+to+activated+notch+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression.</a> Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).</li>
<li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHogan%2C+B+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1994).</li>
<li>Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+commitment+during+embryonic+stem+cell+differentiation+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture.</a> Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).</li>
<li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).</li>
<li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphohematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro.</a> Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).</li>
<li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+hematopoietic+system+from+mouse+embryonic+stem+cells%3A+a+new+approach+for+embryonic+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis.</a> Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).</li>
<li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1098 (1994).</li>
<li>Turksen, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurksen%2C+K+%22Embryonic+stem+cells+%3A+methods+and+protocols%22">Embryonic stem cells : methods and protocols</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. (2002).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

התמיינות תקינה של תאים ES ומחוברות על שכבה של תאים OP9 תוצאות mStrawberry בייצור Flk1 hemangioblasts + בכל יום 5 של תרבות משותפת. Hemangioblasts אמור להופיע כמו נערמו למעלה דורים של תאים, כפי שנצפה באיור 1. במשך שארית של תרבות משותפת, הצאצאים גלוי ES-derived אמור להופיע כמו אשכולות של תאים hematopoietic (איור 1). בשלב Day6 / 7 03:58 אשכולות התא אמור להופיע ולצמוח לתוך אשכולות תא גדול (הן חסיד ועל השעיה) על ידי ביום 8 / 9 של תרבות משותפת. הצאצאים ES אחרים הנגזרים מצויים גם הדוק בתוך שכבת התאים חסיד סטרומה. אמנם לא מופיע בפרוטוקול, חשוב לבדוק מראש FBS בשימוש במדיום ES צמיחה, mStrawberry OP9 התקשורת הצמיחה ES / mStrawberry OP9 התקשורת בידול. נבדק כראוי בסרום צריכה להבטיח צמיחה תקינה של תאים OP9 mStrawberry, כמו גם, התמיינות תקינה של תאים ES בתרבות המשותפת עד יום 5 של בידול. כחלופה או בנוסף OP9 תאים mStrawberry, OP9 תאים יכול להיות מוקרן, ב 8000 rads, לקראת זריעת ב confluency (7.8x10 4 תאים / ס&quot;מ 2). הקרנה של OP9 תאים מאפשר לחיסולה של צעדים replating חוזרות ונשנות, וכן, מאפשר ביטול כמעט מוחלט של הישן, זיהום OP9 תאים מבחני במורד הזרם. OP9 התאים היו שהונדסו חלבון mStrawberry ידי transducing OP9 תאים עם 3ug/mL של mStrawberry וקטור lentiviral להביע תחת שליטתו של מקדם CMV (pRRLsin-CMV וקטור, וקטור הליבה UCLA). תקן ES/OP9 שיתוף תרבות פרוטוקולים כרוך את המיקום של תאים ES על OP9 ומחוברות שכבת תאים, כמו גם, 5 היום צעד replating על מנת לצמצם ישנים, מזהמים OP9 תאים מעבר לתא. בנוסף, רק תאים hematopoietic למצוא ההשעיה יוסרו להערכת הצאצאים ES-derived. עם זאת, בצעד הן replating ואת קצירת של תאים ההשעיה רק ​​פוטנציאל מתגעגע מספר לא מבוטל של המתפתח בתאי גזע עובריים שמקורם hematopoietic. נושא זה הופך להיות חשוב לטפל כאשר מנסים לאפיין פגמים hematopoietic הקשורים קווי ES בנוקאאוט. כדי לעקוף בעיה זו המעבדה שלנו השתמשו שונה שיתוף התרבות, באמצעות mStrawberry-לבטא OP9 תאים. זה מבטיח כי כל הצאצאים ES מועברים להמשך שיתוף התרבות ביום 5, ועל היבול של הצאצאים ES-derived כל מבחני במורד הזרם. שינוי זה מספק כלים שימושיים בהערכת ואפיון של הצאצאים hematopoietic נגזר האדם והן ES קווי העכבר. זה ES-mStrawberry OP9 שיתוף התרבות המודל משחזר את השלבים השונים פרימיטיבי hematopoiesis סופי. בשנת לימוד בשלבים המוקדמים של הפיתוח hematopoietic, אנשים רבים להשתמש BL-CFC (הפיצוץ דמוי תא המושבה להרכיב) assay, אשר להעריך את התפתחות hemangioblast מהתא ES. בעוד assay BL-CFC הוא כלי שימושי כאשר חוקרת התפתחות hematopoietic מוקדם, mStrawberry-ES שיתוף התרבות מערכות תערוכות השירות להגדיל שכן היא מאפשרת להערכת hemangioblast, כמו גם, שושלות hematopoietic מבוגר יותר. עבודות קודמות באמצעות OP9/ES מסורתיים בידול פרוטוקולים EB הוכיחו כי גורמים נוספים הדרושים אולי, כמו overexpression של HoxB4, על מנת להפיק לטווח ארוך repopulating בתאי גזע hematopoietic במבחנה. עבודה נוסף יש צורך להעריך אם mStrawberry שלילית, מיון ES-derived אוכלוסיות מכילים נכון בתאי גזע hematopoietic.

OP-9 תחזוקה Cell בינוני במלאי רכיבי <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> אומגה מדעי </td><td> FB01 </td><td> טרום נבדק </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> 200nM </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA </td><td> תא גזע טכנולוגיות </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table> ES/OP-9 התמיינות תאים בינוני במלאי רכיבי <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td> טרום נבדק </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> 200mm </td></tr><tr><td> PBS (ללא Ca 2 + ו - Mg 2 +) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA </td><td> תא גזע טכנולוגיות </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table>

השתנה es / op9 שותף לתרבות פרוטוקול מספקת שירותי אפיון משופר צאצאיהם hematopoietic

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

התמיינות של תאים במבחנה ES כלפי גורל התא hematopoietic שימושי כאשר לומדים אוכלוסיות תאים שקשה גישה in vivo ו לאפיון גנים המוקדם מעורב hematopoiesis, מבלי להתמודד עם lethalities עובריים. ES/OP9 שיתוף התרבות מערכת תוכנן במקור כדי לייצר צאצאים hematopoietic, ללא ייצור של מעל מקרופאגים, כמו קו OP9 תא סטרומה נגזר מכסה הגולגולת של עכברים מוטנטים osteopetrosis כי חוסר פונקציונלי M-CSF. במערכת במבחנה שיתוף תרבות ES/OP9 ניתן להשתמש כדי לשחזר פיתוח hematopoietic מוקדם. כאשר תאים בתרבית על OP9 סטרומה, תאים עובריים להתמיין Flk-1 + hemangioblasts, אבות hematopoietic, ובוגרת ולבסוף, שושלות הבדיל סופניים. תקן ES/OP9 שיתוף התרבות פרוטוקול מחייב את המיקום של תאים ES על שכבת ומחוברות OP9 של תאים, כמו גם צעדים replating תקופתיות כדי להסיר את הישן, זיהום OP9 תאים. יתר על כן, פרוטוקולים הנוכחי לערב להעריך רק את התאים hematopoietic למצוא השעיה ולא מותאמים הערכה של הצאצאים ES-נגזר על כל יום של בידול. עם זאת, עם צעדים replating ואת קצירת של תאים ההשעיה רק ​​פוטנציאל מחמיץ חלק גדול של צאצאים ES-derived ופיתוח תאים hematopoietic. נושא זה הופך להיות חשוב לטפל כאשר מנסים לאפיין פגמים hematopoietic הקשורים קווי ES בנוקאאוט. כאן אנו מתארים שונה ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות, המאפשרת מניעת זיהום OP9 תאים מבחני במורד הזרם. שיטה זו מאפשרת הערכה מלאה של הצאצאים ES-derived כל כלל ימים של תרבות משותפת, וכתוצאה מכך דפוס בידול hematopoietic, אשר באופן ישיר יותר מתאים לדפוס בידול hematopoietic נצפתה בתוך העובר.

mStrawberry OP9 התאים מאפשרים הערכה מלאה של הצאצאים ES-derived כל מתרבות משותפת.

השתנה ES / OP9 שותף לתרבות פרוטוקול מספקת שירותי אפיון משופר צאצאיהם hematopoietic

הגבירה במבחנה (in vitro) של תאי ES לעבר גורל של תאי המטופואזה (hematopoietic cell fate) היא שימושית בעת חקר אוכלוסיות תאים שקשה להגיע אליהן בתוך הגוף (in vivo)...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לגזור תאי גזע עובריים של עכברים לשוורות המטופואטיות פרימיטיביות ודפיניטיביות שונות. כדי לאפיין את כל צאצאי תאי ה-ES, השגת בידול תאים המטופואטיים של עכברים מתבצעת על ידי הנחת תאי ES על שכבה של תאי סטרומה OP9 המסומנים פלואורסצנטית ב-M strawberry ובצפיפות גבוהה (confluent). כל יום של בידול או תרבית משותפת (co-culture) מייצג את השלבים השונים של ההתפתחות ההמטופואטית במועד הקצירה המתאים.ניתן להפריד תאי צאצאים של תאי ES מובחנים מקו תאי הססתומה M strawberry OP nine באמצעות מיון תאים. פרוטוקול בידול זה של תאי ES משחזר המטופואזה פרימיטיבית ודפיניטיבית כפי שנצפית in vivo, וניתן להשתמש בו לאפיון פגמים המטופואזיים הקשורים לקווי תאי ES עם נוק-אאוט ללא שימוש בעובריים. שלום, ברוכים הבאים למעבדתה של ד"ר Judith Gassen במרכז הסרטן המקיף ג'ונסון של UCLA.שמי הוא אליסיה פוז. היתרון העיקרי של הטכניקה שאציג בפניכם היום על פני שיטות קו-קלטור (co-culture) קיימות של ESO תשעה הוא שפרוצדורה זו מאפשרת את העברתו של כל תאי יום 5 ויום 8, וכן הפרדה מלאה של כל הצאצאים שנגזרו מתאי ES. מהסטרומה של תשעה, תאי OP תשעה גדלים במצע תרבית לתאי OP תשעה, שיש להחליפו מדי יומיים.יש לבצע תת-תרבית לתאי OP9 שלושה ימים לפני המועד שבו הם דרושים לתרבית משותפת. חשוב לציין כי במהלך התחזוקה, אין לשמור את תאי ה-OP9 בצפיפות העולה על 90% קונפלואנס. ראשית, שטפו את התאים פעמיים ב-PBS, ולאחר מכן הוסיפו 0.1% trypsin EDTA שחומם מראש למשך חמש דקות, עד שהתאים ניתקו. הוסיפו מצע גידול לתאי OP9 והעבירו את התאים למבחנה קונית של 50 מיליליטר.לאחר צנטריפוגציה, השקיעו את התאים במבחנה ב-300 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, השליכו את הנוזל העליון והשאיבו מחדש את התאים במצע תרבית תאים טרי מסוג M strawberry OP nine. זרעו את התאים בצפיפות מינימלית של 10⁴ cells cm⁻² ביום תחילת ניסוי התרבית המשולבת. תאי ה-OP nine שסובקלו לפני שלושה ימים צריכים להיות קונפלואנטיים. יש לתרבת את תאי ה-ES בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי עבור קו התאים הספציפי שלכם.שטפו את תאי ה-ES פעמיים ב-PBS, בצעו עיכול בתאי ה-ES באמצעות trypsin EDTA בריכוז 0.25% והדגירו למשך חמש דקות ב-37 °C. לאחר מכן, הוסיפו מצע דיפרנציאציה לתרבית משותפת (co-culture differentiation media) לתאי ה-ES והעבירו אותם למבחנות קוניות של 15 milliliter. השקיעו את תאי ה-ES ב-400 G למשך חמש עד שבע דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), השביה את תאי ה-ES במצע בידול לעוברית משותפת (co-culture differentiation media). השתמש במחט קהה בכילייב 21 כדי להשיג תליה של תאים בודדים. ספור את התאים באמצעות trypan blue והמוציטומטר.כעת הוציאו את הבקבוק של M strawberry. הוציאו תאי OP nine מהאינקובטור. הסירו את המצע מתאי ה-OP nine והוסיפו מצע דיפרנציאציה לתרבית משותפת (co-culture) לצלחת הבקבוק.הוסיפו 10³ תאי ES לכל סמ"ר לכל בקבוק של תאי M strawberry OP nine. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C, ב-5% carbon dioxide עם לחות. זהו היום האפס, והתרבית המשותפת צריכה להיראות כך. שלושה ימים לאחר תחילת תרבית ה-CO-culture של ES ומסוג M strawberry OP nine.נצפות בעיקר צבירים שטוחים וגדולים של צאצאים שנגזרו מתאי ES עם גבולות מוגדרים, וחלק ממערבולות התאים יחלו להיווצר. הסר בזהירות את המצע מהקו-קלטורה והחלף אותו במצע דיפרנציאציה טרי חמישה ימים לאחר תחילת הקו-קלטורה. דיפרנציאציה תקינה של תאי ES על שכבה מלאה (confluent) של תאי M strawberry OP nine אמורה להביא להיווצרות heman eblasts, הנראים כמערכות תאים נערמות.ההיבט הקריטי ביותר של הליך זה הוא הבטחת בידול תקין ביום החמישי של השיתוף-תרבית (co-culture). בנקודה זו, ניתן לראות את מושבות ה-heman eblast לא רק באופן מיקרוסקופי, אלא גם באופן מקרוסקופי. שטפו בזהירות את השיתוף-תרבית פעמיים עם PBS ובצעו טריפסין לתאי ה-ice באמצעות 0.25% trypsin EDTA, שטפו את התאים מהבקיתה (flask) עם מצע בידול ES והעבירו למבחנה; השקיעו את התאים ב-400 G למשך שבע דקות בטמפרטורת החדר.לאחר סנטריפוגציה, הסר את supernatant והוסף מצע גידול חדש. לאחר מכן, השתמש במחט קהה במידה 21 (21 gauge) כדי לסספנד מחדש את התאים, וכדי להבטיח סספנסיות של תאים בודדים, ספור את התאים באמצעות hemo cytometer; צפויה עלייה של פי 100 עד 150 במספר תאי ה-ES לעומת היום האפס. זרע מחדש את תאי ה-co-culture על שכבה חדשה של תאי M strawberry OP nine קונפלואנטים ביום השמיני או התשיעי, וביום ה-12 ספור את התאים שוב. הסר את מצע הגידול עם התאים ההמטופואטיים ושמור אותם.שטפו את השכבה החד-שכבתיות (monolayer) פעם אחת עם PBS. כדי להסיר תאי המטופואטיים בתגלוש (suspension) ולשמרם, הוסיפו 0.25%tripsin EDTA לבקבוק; לאחר היצמדות ה-trypsin, שטפו את התאים מהבקבוק באמצעות מצע בידול ES והוסיפו אותם לתאים ההמטופואטיים שנמצאו בתגלוש. צנטריפוגו את התאים ב-400 G למשך שבע דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, השביו את התאים באמצעות מחט בעלת קצה קהה (blunt end needle) בכיל 21 וספרו את התאים. התאים מוכנים כעת להזרעה מחדש או לשימוש בניסויים המשכיים.ניתן להשתמש במערכת השיתוף-תרבית של ES M strawberry OP nine כדי למדל את ההתפתחות ההמטופואטית שתוארה. להלן סקירה כללית של מהלך הזמן של השיתוף-תרבית, שבה מצוינים הימים שבהם יש להעביר את צאצאי ה-ES המובחלים לתאי M strawberry OP nine חדשים. בידוק תקין של תאי ES על שכבה מלאה (confluent) של תאי M strawberry OP nine יוביל לייצור של flick one positive.אנגיובלסטים ביום החמישי של תרבית משותפת. אוסטאובלסטים אנושיים הם קדמון מזודרמי נפוץ לשושלות האנדותליאליות וההמטופויטיות, ועליהם להופיע כערימות של תאים, כפי שמוצג בתמונה זו. עם התקדמות התרבית המשותפת, צפופים של שני עד ארבעה תאים אמורים להופיע ביום השישי או השביעי ולהתפתח לצבירי תאים גדולים יותר. ביום השמיני או התשיעי קדמונים המטופויטיים כבר נוכחים (החל מיום השישי), בעוד ששושלות המטופויטיות המובחנות סופית מופיעות ביום ה-14.לעומת זאת, תרבית משותפת עם התמיינות ESL לקויה תביא לצאצאים המופקים מ-ES שאינם מופיעים בתבנית עולמית (world pattern) ביום החמישי. היעדר תאים בתבנית עולמית מעיד על היווצרות לקויה של GIO blasts. תרבית משותפת עם היווצרות eblast לקויה תוביל בסופו של דבר להתמיינות מעוכבת של שושלת ההמטופואטית ויש להשליכה תחת פרוטוקול תרבית משותפת ES OP nine משופר זה.צאצאים שנגזרו מתאי ES הם שליליים ל-m strawberry וניתן למיינם באמצעות מיון זרימה (flow sorting) מהתאים החיוביים ל-M strawberry. ביום כלשהו של תרבית משותפת, יש לאסוף תשעה תאים להערכה. תוצאות מניסוי מייצג מוצגות כאן.תשעי פרוטוקולי תרביות-משותפות של ES OP שפורסמו בעבר התמקדו אך ורק בהעברה ובהערכה של התאים הצפים שאינם נצמדים. בפרוטוקול שונה זה, כל התאים שנגזרו מ-ES, הן תאים נצמדים והן תאים שאינם נצמדים, עוברים העברה וניתן להערכתם. הדבר מוביל לתנובה מוגברת של תאי המטופואזה, מאפשר זיהוי של אוכלוסיות תאים נדירות, ומספק מאפיין מלא של כל צאצאי ה-ES, הן ההמטופואטיים והן אלו שאינם המטופואטיים.

modified-es-op9-co-culture-protocol-provides-enhanced

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זה פרוטוקול הפרטים גזירת להשתלה בתאי גזע hematopoietic מתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) הזרקת הבאים שלהם לעכברים הנמען מוקרן קטלנית. בקצרה, הם ESC להבדיל גופים embryoid, אשר נגועים אז עם HoxB4 retroviral ושיתוף תרבותי עם OP9 תאים סטרומה וציטוקינים hematopoietic.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

סרטון זה מתאר את הטכניקה לתרבית משותפת דו-ממדית ארוכת טווח של תאי לוקמיה עם תאי סטרומה של מח עצם כדי לחקור את האינטראקציה שלהם עם מיקרו-סביבה של מח העצם. מודל ההתרבות הדו-ממדית משתמש בתאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה ובסטרומה או אוסטאובלסטים של מח העצם המשפיעים על פנוטיפ תאי הגידול. מחקר זה יתמוך בחקירת המנגנונים העומדים בבסיס הישרדות תאי לוקמיה הנתמכים על ידי מח עצם במהלך חשיפה לכימותרפיה.

תרבית דו-ממדית של תאים לוקמיים עם BMSCs: שיטה להשגת תת-אוכלוסיות של תאים לוקמיים

ניתן להתמיין בתאי גזע עובריים של עכבר לתאי T במבחנה באמצעות מערכת התרבות המשותפת OP9-DL1. הצלחה בהליך זה דורשת תשומת לב קפדנית לתחזוקת ריאגנט/תאים, ושלבים רגישים לטכניקה מרכזית. כאן אנו דנים בפרמטרים קריטיים אלה ומספקים פרוטוקול מפורט לעידוד אימוץ טכנולוגיה זו.

גזירה של תאי T במבחנה מתאי עכבר גזע העובריים

מתוארים הפרוטוקולים הנוכחיים לשמירה על תאי אב אוטיים רב-פוטנטיים (iMOP) אימורטליים והתמיינות אוטית.  תנאי תרבית וסמנים מולקולריים המצביעים על התמיינות לאפיתל חושי ונוירונים של גנגליון ספירלי (SGN) מודגשים.

ייזום בידול בתאי multipotent otic אב הונצחו

כאן, אנו מציגים pluripotent האנושי פרוטוקולים התרבות תאי גזע (hPSC), נהגו להבדיל hPSCs לתוך CD34+ אבות hematopoietic. שיטה זו משתמשת ספציפיות שלב מניפולציה של חגיגת הקנוני איתות לציין תאים באופן בלעדי לתוכנית או סופית או פרימיטיבי hematopoietic.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

כימות של תאי התורם-derived נדרש לעקוב אחר engraftment לאחר השתלת תא גזע בחולים עם פתולוגיות של המוגלובין. שילוב של מיון תא מבוססי cytometry זרימה המושבה היווצרות assay, לאחר מכן ניתוח של טנדם קצר חזרה ניתן להשתמש כדי להעריך את התפשטות ובידול של אבות בתוך התא erythroid.

זיהוי של התורם שיורית Erythroid ובתאים לאחר השתלת תא גזע Hematopoietic עבור חולים עם פתולוגיות של המוגלובין

פרוטוקול זה מתאר שימוש בתרבית העורקים-בלוטת המין-Mesonephros עבור הביטוי ניתוחים, יחידות המושבה יוצרי תרבות, הטחול ולאחר שיחזור לטווח ארוך כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים רגולטוריים, איתות המסלולים על גזע hematopoietic תא פיתוח. זה הוכח כמו מערכת יעילה ללמוד ביולוגיה של התא גזע hematopoietic ותפקוד.

היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros Explant התרבות Hematopoiesis התפתחותית

נדגים כיצד לזהות ולבודד 6 קבוצות משנה של אבות מיאלואידית ממח העצם מאתר באמצעות שילוב של מגנטי קרינה פלואורסצנטית מיון (מקינטוש ו- FACS). פרוטוקול זה יכול לשמש in vitro לקשרי תרבות מבחני (תרבויות methylcellulose או נוזל), ויוו המאמצת העברת הניסויים של RNA/חלבון ניתוחים.

זיהוי ובידוד של Oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית ממח העצם העכבר

פרוטוקול זה מתאר הליך להשראת התמיינות של תאי גזע וקדמון המטופואטיים אנושיים שמקורם בתאי מח עצם של המטופל ותאי דם חד-גרעיניים היקפיים. הבדיקה משתמשת במדיום תרבית חצי-מוצק התומך במחויבות לשושלת אריתרואיד ומיאלואידית ומשלבת מדדים סטנדרטיים לסיווג מושבות שניתן לשחזור לצורך אפיון תרופות פרה-קליני.

בדיקת יחידה ליצירת מושבות מותאמת לתאי מונו-גרעין בדם שמקורם במח עצם ובדם היקפיים שמקורם במטופל

למדו להבדיל תאי גזע עובריים של עכברים לתאים המטופויאטיים באמצעות שכבת תאי stromal מסומנים בפלואורסצנטית OP9. פרוטוקול זה מאפשר הערכה מלאה של כל הצאצאים הנגזרים מ-ES לחקר פיתוח תאי דם.

השתנה ES / OP9 שותף לתרבות פרוטוקול מספקת שירותי אפיון משופר צאצאיהם hematopoietic

גלה סרטונים נוספים