Name: השתנה Annexin V / Propidium אפופטוזיס יודיד Assay לקבלת הערכה מדויקת של מוות של תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: למד פרוטוקול משופץ לזיהוי מוות תאי באמצעות Annexin V ו-PI עם תיקון פורמלדהיד ופירוק RNA. השיטה מפחיתה דיווחי שווא ב-40% ומספקת הערכה מדויקת של אפופטוזה ונקרוזה בתאים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי למדעי הטבע וההנדסה המועצה של קנדה (NSERC) מחקר מענק החקלאות אלברטה המימון קונסורציום להעניק DRB. AMR נתמך באמצעות מלגת Vanier NSERC בוגר הקנדי, מאוניברסיטת אלברטה אסיסטנט הוראה לבין המלכה אליזבת השנייה מלגה לתואר שני.

הליך זה יכול להתבצע 500 צינורות siliconized μL או 6 פוליסטירן מ"ל מסביב לתחתית צינורות FACS. האחרון משמש בדרך כלל בעת ביצוע ניתוח הכדאיות יחד עם הליכים אחרים. כל הכרכים נתון במשך 6 פוליסטירן מ"ל מסביב לתחתית צינורות FACS. במשך 500 צינורות siliconized μL, לצמצם את כל הכרכים של 1 / 5. הריכוז האופטימלי עבור ניתוח cytometry זרימה הוא 2-4 x 10 6 תאים לכל נפח 200 μL. אובדן תאים עשויים לנבוע הליך זה ובכך אנו ממליצים מדגם זה מורכב 4 x 10 6 תאים בתחילת ההליך. 1. תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים קציר - מתייחסים להליכים מיוחדים שורות תאים המתאימים או isolations התא הראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות x 335 גרם במשך 10 דקות למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 2 פוספט x 1 מ"ל בופר סליין (PBS) - / - (לא סידן, מגנזיום, לא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות x 335 גרם במשך 10 דקות למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים 1 מ"ל 1 חיץ x V Annexin מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות x 335 גרם במשך 10 דקות למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 100 חיץ μL 1 x V Annexin מחייב. </li></ol> 2. יישום Annexin V / PI כתמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף Annexin V לפי ההמלצות של היצרן [למשל 5 μL Annexin V אלקסה פלואוריד 488 (בדיקות מולקולריות, A13201)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של 1 חיץ x V Annexin מחייב צינור כל תגובה. לא צריך להיות כ 200 μL בצינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μL של PI (Sigma, חתול # P-4864-10 מ"ל) כי כבר מדוללת 1:10 ב 1 חיץ x V Annexin מחייב (כלומר 1 PI μL עם 9 1 μL חיץ x V Annexin מחייב). זו תניב ריכוז לצרכן הסופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​במדגם אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL 1 x Annexin חיץ V מחייב לשטוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות x 335 גרם במשך 10 דקות למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 500 1 μL חיץ x V Annexin מחייב 500 פורמלדהיד 2% μL כדי ליצור פתרון 1% פורמלדהיד (מיצב). מערבבים צינורות ידי מצליף עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן דגימות קרח במשך 10 דקות. לחלופין, ניתן לאחסן דגימות לילה ב 4 ° C בחושך. אם שיטת האחרון נבחר, הקפד להיות עקבי לאורך כל הצינורות שכותרתו עם Annexin V / לצרכן (כולל בקרות פיצוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ"ל 1 x PBS - / - לדגום כל ומערבבים בעדינות על ידי מצליף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב 425 x גרם במשך שמונה דקות למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.10 ו - 2.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ידי מצליף את הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 16 μL של 1:100 בדילול RNase (Sigma, R4642) לתת הריכוז הסופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל. דגירה של 15 דקות בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ"ל 1 x PBS - / - ומערבבים בעדינות על ידי מצליף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב 425 x גרם במשך שמונה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות מוכנים כעת להיות מנותח. לחלופין, דגימות יכול לשמש הצעדים הבאים מכתים אם Annexin / PI מכתים מתבצע במקביל הליכים אחרים. </li></ol> 3. נציג תוצאות: דוגמאות של סוגי תאים שורות תאים בעלי דרגות שונות של צביעה חיוביות שגויות לצרכן מוצגות באיור 1. כדי להסביר את חיוביות שגויות אירועים, תאים תוקנו וטופלו לאחר מכן עם RNase A. התוצאה היא ירידה משמעותית במספר אירועי חיוביות שגויות, לעומת תאים שלא עברו טיפול RNase (תרשים 2B). איור 2C מראה תמונות נציג של תאים שעברו טיפול RNase, לעומת תאים לא היה טיפול RNase. איור 3 מראה כיצד Annexin שונה V / PI פרוטוקול, עם קיבעון צעדים RNase הטיפול, משפר עם פרוטוקולי קונבנציונלי על ידי הגבלת מספר חיוביות שגויות אירועים מכתים. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. קונבנציונלי יודיד propidium פרוטוקולים מכתים להביא מספר משמעותי של אירועים חיובי כוזב. יש לנו הערכה בעבר מידת מכתים חיובי כוזב על פני תאים ראשוניים במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים כמו גם במגוון רחב של שורות תאים 10. נציג להראות תמונות היקף מכתים חיובי כוזב בשלוש אוכלוסיות תאים ייחודיים (קו אחד התא הנפוץ - מקרופאגים RAW ושני תאים ראשוניים - Murine מח עצם מקרופאגים (BMM) ו העיקרית דגי זהב כליה מקרופאגים (PKM)). אירועים חיוביים אמנם צפוי להציג את שיתוף לוקליזציה בין PI ו DRAQ5 בתוך תא גרעיני (אזורים צהובים מתארים colocalization בין PI ו DRAQ5). DRAQ5 הוא membra מאודנה חדיר כתמי צבע במדויק תא גרעיני הן תאים חיים ומתים 10,11,12. לקביעת ויזואלי קל של colocalization DRAQ5 כתם קיבל pseudocolour ירוק. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. שיפור הדיוק של מכתים לצרכן גרעיני. (א) בחנו הדיוק של מכתים לצרכן גרעיני המבוסס על מידת הדמיון של מספר היטב המאופיינת בכתמים גרעיני (BrdU, 7-AAD ו DAPI) כדי DRAQ5. BrdU הוא nucleoside סינתטי משולב אל תוך הדנ"א של התאים מתרבים, וככזה יהיה רק ​​כתם בתוך תא גרעיני. 7-AAD יש זיקה גבוהה עבור דנ"א, בדומה לצרכן, לא יכול לעבור ללא פגע הממברנה הפלסמטית. DAPI יש גם זיקה חזקה דנ"א הוא הגרעין הנפוץ ביותר כתם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מידת הדמיון היה&gt; 99% בין BrdU, 7-AAD, DAPI ו DRAQ5, המדגיש את יכולתם במדויק כתם לגרעין התא ב 264.7 מקרופאגים RAW. לעומת זאת, מכתים לצרכן cytoplasmic מבוסס על פרוטוקולים קונבנציונאלי מוביל להפחתה ניכרת של דמיון אחוז מכתים יחסית DRAQ5. (ב) תוצאות דומות נצפו בשני תאים ראשוניים נבדק: Murine מח עצם מקרופאגים (BMM) ו העיקרית דגי זהב כליה מקרופאגים (PKM). התאגדות של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​RNase בשלב מסוים בתוך ההליך מסיר כתמים ללא גרעיני מכתים PI ו מגביר באופן משמעותי את מידת הדמיון ביחס מכתים DRAQ5. (ג) נציג תמונות של מקרופאגים כליה העיקרי להראות את מידת הדמיון של תאים עם או בלי טיפול RNase. לקביעת ויזואלי קל יותר של ההבדלים בין הטיפולים, DRAQ5 ניתנה ירוק. אזורים צהוב מתארים colocalization בין BrdU ו DRAQ5 ו PI ו DRAQ5. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. השתנה Annexin V / PI מפחית באופן משמעותי אפופטוזיס שווא / אירועים נמקי. ראשי כליה דגי זהב מקרופאגים (PKM) הוכתמו קונבנציונאלי שונה Annexin V / PI פרוטוקולים. Scatterplots לתאר את V Annexin / PI כתם PKM דגי זהב. Scatterplot משמאל מראה קונבנציונאלי Annexin V / PI מכתים (אין RNase) של תאים PKM. Scatterplot בצד ימין מראה תאים PKM מוכתמות Annexin שונה V / פרוטוקול PI (עם RNase). תוספת של תוצאות RNase לירידה הניכרת של מכתים לצרכן עקב הסרת כתמים חיובי כוזב. תאים PKM היו אז ניתחו מבוסס על אוכלוסיות שונות בתוך תרבויות מוקדמת אבות (EP), מונוציטים (מונו) ומקרופגים בוגרת (מאט מק). הירידה במספר האירועים החיוביים לצרכן, בשל הסרת אירועים חיוביים כוזבים הינה בולטת יותר גדול תאים macrophage בוגרת מאשר קטן ובתאים המוקדמות. מסקנות מבוסס על פרוטוקולים קונבנציונלי היה מציע בטעות מתאם חיובי במוות הסלולר עבור תת macrophage יותר בוגרת.

<ol><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of apoptotic cell death.</a> J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).</li>
<li>Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V+expression+in+apoptotic+peripheral+blood+lymphocytes%3A+An+electron+microscopic+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation.</a> Apoptosis. 7, 41-47 (2002).</li>
<li>Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytofluorometric+analysis+of+cell+cycle+distributions+using+propidium+iodide.+Properties+of+the+method+and+mathematical+analysis+of+the+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data.</a> J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).</li>
<li>Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+of+Annexin+V-binding+apoptotic+cells+is+highly+fragmented%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented.</a> Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+apoptotic+cells+measured+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 795-808 (1992).</li>
<li>Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+death%2Flife+regulator+in+apoptosis+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis.</a> Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).</li>
<li>Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+and+necrotic+cell+death+induced+by+death+domain+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors.</a> Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).</li>
<li>Faleiro, L., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+disrupt+the+nuclear-cytoplasmic+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier.</a> J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).</li>
<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+apoptosis+assays+using+propidium+iodide+generate+a+significant+number+of+false+positives+that+prevent+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death.</a> J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).</li>
<li>Edward, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+Use+of+DNA-specific+anthraquinone+dyes+to+directly+reveal+cytoplasmic+and+nuclear+boundaries+in+live+and+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells.</a> Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).</li>
<li>Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+of+the+DNA+targeting+bisalkylaminoanthraquinone+DRAQ5+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells.</a> Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

V Annexin / PI פרוטוקול המוצג כאן הוא גרסה שונה של פרוטוקולים קונבנציונאלי לוקח בחשבון את נוכחותם של רנ&quot;א בציטופלסמה שיש לה גם זיקה גבוהה עבור לצרכן. מבוא של RNase (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לאחר שלב 1% פורמלדהיד קיבעון מאוחר בהליך מכתים משפר משמעותית את הדיוק של מכתים לצרכן גרעיני. השפעות שליליות הן לא נצפתה מכתים לצרכן גרעיני או פלזמה קרום מכתים Annexin V. ללא טיפול RNase, עד 40% של תוצאות PI כתם יכול להוביל לאירועים חיובי כוזב, אשר מוביל השפעה משמעותית פוטנציאל שלילי על מסקנות במורד 10. שונה שלנו Annexin V / PI פרוטוקול מכתים הוא פשוט נעשה שימוש יעיל במגוון רחב של סוגי תאים (תאים ראשוניים: Murine מח עצם מאקרופאגים splenocytes; החזירים תושב לתאי ריאה, מקרופאגים ריאות מכתשיים, mesenteric צומת מבודד הלימפה, leukocytes דם היקפיים , splenocytes; blastoderm תאים עוף, דג זהב העיקרי מקרופאגים כליה; leukocytes קרפיון דם היקפיים; קווי נייד: RAW 264.7 מקרופאגים, Jurkat בתאי T, החזירים 3D4/31 מקרופאגים, CCL-71 fibroblasts סנפיר דג, שפמנון 3B11 B תאים 10). חשוב לציין כי התאים מושפעים באופן דיפרנציאלי על ידי מכתים שווא לצרכן חיובית, עם תאים ראשוניים בדרך כלל לאחר מספר גדול יותר של אירועים חיובי כוזב 10. ההבדלים לצרכן שווא מכתים חיובית בקרב אוכלוסיות אלה הסלולר ניתן לייחס בחלקו ההבדלים בגודל התא, אך יכול גם לנבוע הבדלים בתוכן RNA. כמו שילוב כזה, של הליך זה רלוונטי במיוחד עבור מערכות ניסיוניות לנצל, בין היתר, התאים העוברים מתח genotoxic, בתאים שטופלו מחזור התא תרופות כגון מעצר או thymidine hydroxyurea, תאים נגועים בנגיף, מחקרים על תאים עובריים שבהם התקדמות התפתחותית מאופיין על ידי שינויים בדידים בסינתזה RNA התאי.

<table><tbody><tr><td>1 x PBS-/-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 x חוצץ קישור ל-Annexin V</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>פרופידיום יודיד (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 מ"ג/מ"ל ב-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>2% פורמלדהיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1268</td><td></td></tr><tr><td>RNase A מלבלב בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>סטטוס ביולוגי</td><td>DR50050</td><td>דלל ביחס של 1:60 ב-1 x PBS</td></tr></tbody></table>

השתנה annexin v / propidium אפופטוזיס יודיד assay לקבלת הערכה מדויקת של מוות של תאים

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

מחקרים של אפופטוזיס הסלולר כבר מושפע באופן משמעותי מאז כניסתה של cytometry שיטות מבוססות זרימה. יודיד Propidium (PI) נעשה שימוש נרחב בשיתוף עם Annexin V כדי לקבוע אם התאים קיימא, אפופטוטיים, נמקי או באמצעות ההבדלים שלמות קרום פלזמה ו 1,2 חדירות. V / PI Annexin פרוטוקול היא גישה הנפוץ לחקר תאים אפופטוטיים 3. PI משמש לעתים קרובות יותר מאשר כתמים גרעיני אחרים כי זה חסכוני, יציבה אינדיקטור טוב של כדאיות התא, המבוססת על יכולתה להוציא לצבוע בתאים חיים 4,5. היכולת של PI לחדור לתא תלויה החדירות של הממברנה; לצרכן לא להכתים תאים אפופטוטיים לחיות או מוקדם בשל נוכחותם של קרום פלזמה שלם 1,2,6. בשנת תאים אפופטוטיים, נמקי מאוחר, את שלמות פלזמה ו ממברנות הגרעין פוחתת 7,8, המאפשר לצרכן לעבור דרך הממברנות, intercalate לתוך חומצות גרעין, ולהציג אדום פלואורסצנטי 1,2,9. למרבה הצער, אנו מוצאים כי קונבנציונאלי Annexin V / PI פרוטוקולים להביא מספר משמעותי של אירועים חיובי כוזב (עד 40%), אשר משויכים מכתים לצרכן של RNA בתוך תא cytoplasmic 10. תאים ראשוניים שורות תאים במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים מושפעים, עם תאים גדולים (הגרעין: יחסי cytoplasmic &lt;0.5) מראה את המופע הגבוהה ביותר 10. בזאת, אנחנו מדגימים שונה Annexin V / PI שיטה המספקת שיפור משמעותי להערכה של מוות של תאים בהשוואה לשיטות קונבנציונליות. פרוטוקול זה מנצל שינויים בחדירות התא הסלולרי במהלך תיקון כדי לקדם את כניסתם של RNase לתאים הבאים מכתים. גם עיתוי וריכוז RNase מוטבו להסרת RNA cytoplasmic. התוצאה היא שיפור משמעותי לעומת המקובל Annexin V / פרוטוקולי PI (&lt;5% עם אירועים מכתים cytoplasmic PI).

שיטה מדויקת להערכת מוות של תאים מתואר. פרוטוקול משפר עם קונבנציונאלי Annexin V / propidium (PI) פרוטוקולים יודיד, אשר להציג עד חיוביות שגויות אירועי 40% בשורות תאים תאים ראשוניים מתוך מגוון רחב של מודלים של בעלי חיים.

השתנה Annexin V / Propidium אפופטוזיס יודיד Assay לקבלת הערכה מדויקת של מוות של תאים

מחקרים על אפופטוזה תאית הושפעו באופן משמעותי מאז החדרתן של שיטות המבוססות על ציטומטריה זרימה. פרופידיום יודיד (PI) נמצא בשימוש נרחב...

המטרה הכוללת של הניסוי היא להתגבר על בעיות נוכחיות בטכניקות הצביעה המקובלות של Annexin five ו-Propidium iodide להערכת מוות תאי באמצעות אפופטוזיס ו/או נמק. מצאנו כי גישות צביעה קונבנציונליות למגוון רחב של שורות תאים ותאים ראשוניים גורמות לעד 40% מאירועי חיובי שגוי. אירועים חיוביים שגויים אלו נובעים מצביעה של RNA ציטופלזמי.לעומת זאת, הפרוטוקול שלנו מפחית באופן משמעותי את מספר מקרים של תוצאות חיוביות שגויות על ידי הכנסת שלבי קיבוע ופירוק RNA בשלבים ספציפיים. בהליך הצביעה, ראשית צובעים את התאים ב-X in five וב-propidium iodide כדי לזהות מוות תאי בהתאם לנהלים המקובלים. לאחר מכן, מקבעים את התאים ב-1% formaldehyde, אשר מגביר את חדירות קרום הפלזמה. לבסוף, מטפלים בתאים המקובעים ב-RNAs A כדי לפרק RNA ציטופלזמי, ובכך למנוע צביעת propidium iodide הגורמת לתוצאות חיוביות שגויות.בדומה לביולוגים של תאים רבים, השתמשנו בשיטות קונבנציונליות של ציטומטריה של זרימה עם nexin five ופרופידיום יודיד לצורך זיהוי מוות תאי אפופטוטי ונקרוטי. לרוע המזל, גילינו לאחרונה כי שיטה זו מובילה למספר משמעותי של אירועים חיוביים שגויים, עד 40%, במגוון של קווי תאים ותאים ראשוניים. שיטה מעודכנת זו פותרת מגבלות אלו.הגישה שלנו מנצלת קיבוע תאים ועיכול RNA בשלבים ספציפיים לאורך הפרוצדורה כדי להסיר באופן סלקטיבי RNA ציטופלזמי, צביעה שמובילה ישירות לאירועים אלו של חיוביים שגויים. אספו את התאים שיינתחו עבור הניסוי. בסרטון זה, אנו משתמשים במקרופאגים גולמיים. כדוגמה, צנטריפוגו את הדגימות ב-335 Gs למשך 10 דקות ב-4 °C, שפכו את העלייה ותלו את התאים ב-2 mL של 1X PBS.לאחר מכן, שטפו את התאים שוב תחת אותם תנאים. הפעם, השהו מחדש את התאים ב-1 mL של 1X NX ו-5 binding buffer. לאחר סבוב של הדגימות בצנטריפוגה ושפיכת הנוזל העליון (supernatant), השהו שוב את התאים בנפח סופי של 100 µL של 1X NX ו-5 binding buffer.הוסיפו Xin five לכל דגימת תא בהתאם להמלצות היצרן. לדוגמה, בסרטון זה, מתווספים 2.5 µL של Xin five zi לכל מבחנה עגולה בעלת בסיס פוליסטירן. דגרו את המבחנות בחושך למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של 1X NX in five binding buffer לכל מבחנה של תגובה. כעת צריכים להיות בערך 200 µL של תמיסה בכל מבחנה. בשלב הבא, הכינו דילול של 1:10 של propidium iodide או PI ב-1X NX in five binding buffer. הוסיפו 4 µL של ה-PI המדולל לכל מבחנה, כך שתתקבל ריכוז סופי של 2 µg/mL של pi בכל דגימה.דגרו את המבחנות שוב בחושך למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר תקופת דגירה זו, שטפו את התאים עם 500 µL של binding buffer בריכוז 1X NX5, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-335 ×g למשך 10 דקות ב-4 °C ושפכו את הנוזל העליון. השעיקו את התאים ב-500 µL נוספים של binding buffer בריכוז 1X NX5 עם 500 µL של 2% formaldehyde.ליצירת תמיסת formaldehyde בריכוז 1%, ערבבו את המבחנות באמצעות נקישות עדינות. קבעו את הדגימות על קרח למשך 10 דקות לאחר הקיבוע. הוסיפו 1 mL של 1X PBS לכל דגימה וערבבו בעדינות באמצעות נקישות; סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-425 Gs למשך שמונה דקות בטמפרטורה של 4 °C, שלוש פעמים במהלך השטיפה.הכינו מהילול של 1:100 של RNA A ב-1X PBS, השביתו את המשקע על ידי נקישה על המבחנות והוסיפו 16 µL של תמיסת ה-RNAs A המהולת כדי להגיע לריכוז סופי של 50 µg/mL. לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך 15 דקות ב-37 °C. לאחר מכן, שטפו את התאים ב-1 mL של 1X PBS וערבבו בעדינות על ידי נקישה, ולאחר מכן צנטריפוגו את המבחנות ב-425 ×g למשך שמונה דקות ב-4 °C.הדגימות מוכנות כעת לניתוח. לחלופין, ניתן להשתמש בדגימות לשלבי צביעה עוקבים אם צביעת N-X-M-P-I מבוצעת במקביל להליכים אחרים. תמונות מייצגות מציטומטר זרימה (flow cytometer) מסוג image stream מראות את מידת הצביעה החיובית השגויה בשלוש אוכלוסיות תאים ייחודיות.שורה אחת של תאי מקרופאגים גולמיים נפוצים ושתי שורות תאים ראשוניים המשקפות מקרופאגים של מוח העצם ומקרופאגים ראשוניים של כליה מדגי goldfish. השימוש במקרופאגים ראשוניים של goldfish מדגיש את הישימות של טכניקה זו במגוון פלטפורמות תאיות. אירועי חיוביים אמיתיים מראים קולוקליזציה צפויה בתוך המדור הגרעיני בין PI לבין drac.Five, צבע בעל חדירות ממברנה גבוהה הצובע במדויק את המדור הגרעיני של תאים חיים ומתים, כפי שמעיד הצביעה הצהובה. כאן, דיוק הצביעה הגרעינית של PI נבחן על סמך מידת הדמיון שלו ל-D dr five BRDU seven A.A D DPI, כאשר DRAC five הפגינו דמיון של יותר מ-99% ביכולתם לצבוע במדויק את הגרעין בקו תאי המקרופאגים raw 2 64 0.7. לעומת זאת, צביעת PI ציטופלזמית המתרחשת בעת שימוש בפרוטוקולים קונבנציונליים הובילה לירידה ניכרת באחוז הדמיון של הצביעה הגרעינית ביחס ל-d dr five.באיור זה ניתן לראות כי שילוב של 50 µg/mL של RNase A מסיר את צביעת ה-PI שאינה גרעינית ומגדיל משמעותית את דרגת הדמיון לצביעת ddr5 בתאי מורפולוגיה של מח עצם (murn), מקרופאגים של מח עצם ומקרופאגים ראשוניים של כליה של דג זהב. תמונות מייצגות של מקרופאגים ראשוניים של כליה באיור זה מראות את אובדן צביעת ה-RNA במדור הציטופלזמי בעקבות טיפול ב-RNase A. תרשימי פיזור אלו של מקרופאגים ראשוניים של כליה של דג זהב מראים הפחתה משמעותית של אירועים אפופטוטים-נמקרוטיים שגויים בתאים שהוכנו באמצעות פרוטוקול nexin PI המשופר.הפרוטוקול החדש מראה כי 84.9% מהתאים חיוניים. השערים (Gates) נקבעו על בסיס דגימות זרימת תמונות מקבילות המעריכות מאפיינים פלואורסצנטיים ומורפולוגיים. בדוגמה אחת, מונוציטים פרוגניטורים מוקדמים ומקרופאגים בוגרים נצבעו באמצעות פרוטוקול ה-NX המותאם ב-five PI המתואר בסרטון זה, או בשיטה הקונבנציונלית עבור איור זה; תאים שנצבעו בפרוטוקול המותאם הראו הפחתה ויזואלית במספר אירועי ה-PI החיוביים, הודות להסרת אירועים חיוביים שגויים באמצעות טיפול ב-RNAs.יתרה מכך, השפעה זו הייתה בולטת יותר בתאי מקרופאג בוגרים וגדולים מאשר בתאי פרוגניטור מוקדמים וקטנים יותר. מסקנות המבוססות על פרוטוקולים קונבנציונליים היו עשויות להצביע בטעות על מתאם חיובי במוות תאי עבור תתי-האוכלוסיות של מקרופאגים בוגרים יותר. לאחר הליך צביעה זה, ניתן לבצע שלבים נוספים כגון צביעה תוך-תאית או צביעת פני שטח כדי לענות על שאלות ספציפיות לגבי תתי-האוכלוסיות בתוך בידוד התאים שלך. הרלוונטיות של טכניקה זו חורגת משאלות מבוססות חיסון; לדוגמה, היא רלוונטית גם למערכות ניסוייות המשתמשות בתאים החווים עקה גנוטוקסית, תאים שטופלו בחומרים המעכבים את מחזור התא, תרופות כגון thymidine או hydroxyurea, ומחקרים על תאים עובריים שבהם התקדמות התפתחותית מאופיינת בשינויים בדידים בסינתזת RNA תאית.

modified-annexin-vpropidium-iodide-apoptosis-assay-for-accurate

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

את ההשפעות של הפעלה של קינאז isozymes חלבון C (PKC) על תפקוד המיטוכונדריה קשורים בנשימה וזרחון חמצונים ועל כדאיויות תא מתוארות. הגישה מסתגלת טכניקת adenoviral סלקטיבי overexpress isozymes PKC בתרבית תאים ראשוניים ומגוון של מבחנים כדי לקבוע פונקציות המיטוכונדריה ומצב אנרגיה של התא.

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת הקישור של Annexin V כדי למדוד את מידת האריפטוזיס, מוות תאי מתוכנת של אריתרוציטים, באמצעות צביעת Annexin V פלואורסצנטית. אריתרוציטים אפופטוטיים מדגימים טרנסלוקציה של פוספטידיל-סרין מהעלון הפנימי לעלון החיצוני של קרום התא, מה שגורם ל-Annexin V המתויג כפלואורופור להיקשר לפוספטידיל-סרין המועבר, ובכך לפלוט אות פלואורסצנטי.

Annexin V Binding Assay: טכניקה מבוססת פלואורסצנטיות לזיהוי אריתרוציטים אפופטוטיים באמצעות תיוג פוספטידיל-סרין

תרכובות טיפוליות לעתים קרובות נבחנות ראשון במבחנה עם מבחני כדאיות. ספירת תאים עיוורת על ידי צופה אנושי יכולה להיות רגישה מאוד לשינויים קטנים במספר תאים, אבל לא להעריך את התפקוד. מבחני כדאיות ממוחשבים, כפי שמתואר כאן, יכולים להעריך גם מבנה ותפקוד באופן אובייקטיבי.

מבחני כדאיות לתאים בתרבית

מבחני זמנית יכולים לספק מידע מועיל למנגנונים תאיים בסיסיים ולמנוע בזבוז של חומרים כימיים וניסויים חוזרים מיותרים. אנו מתארים כאן assay פעילות זמנית caspase-3/7, תוך שימוש בשיטות ניאון ומבוסס זורח, כדי לקבוע כדאיות תא במודל ההיפותלמוס במבחנה הבאה אתגר חמצוני עם חומצה פלמיטית.

שימוש בcaspase ריבוב Assay לקביעת אפופטוזיס בדגם נייד ההיפותלמוס

המונח אנסטאזיס מתייחס לתופעה שבה תאים גוססים הופכים תהליך התאבדות של תאים בשלב מאוחר, מתקנים את עצמם ובסופו של דבר שורדים. כאן אנו מדגימים פרוטוקולים לאיתור ומעקב אחר תאים שעוברים אנסטאזיס.

אסטרטגיות למעקב Anastasis, תופעת הישרדות תא שהיפוך אפופטוזיס

זרימת עבודה באמצעות צנטריפוגה לזרום cytometry או דיפרנציאלית מפותחת לזהות, לבודד את הגופות אפופטוטיים להיפגע מן דוגמה אפופטוטיים להיפגע טוהר גבוהה לכמת.

זיהוי ובידוד של מוות לגופים טוהר גבוהה

הפרוטוקול מתאר תפוקה מהירה, גבוהה, אמינה, זולה, ובלתי משוחדת, לקביעת יעילות של הכדאיות הסלולרית. תסה זו שימושית במיוחד כאשר המיטוכונדריה של התאים נפגעה, מה שמפריע לאסות אחרות. ההסתה משתמשת בספירה אוטומטית של תאים המוכתמים בשני צבעים גרעיניים – Hoechst 33342 ו-propidium iodide.

תסיסה אוטומטית של כתמים גרעיניים דיפרנציאליים לקביעה מדויקת של ציטוקוקסיות מיטוקאן

אפופטוזיס יכול להיות מאופיין על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה של סמנים ביולוגיים אפופטוטיים מוקדמים ומאוחרים. קו תאי סרטן צוואר הרחם, SiHa, נותח עבור סמנים ביולוגיים אפופטוזיס לאחר טיפול עם Actinomycin D באמצעות ציטומטר זרימה benchtop.

ניתוח ציטומטרי זרימה של סמנים ביולוגיים אפופטוטיים בתאי סרטן צוואר הרחם SiHa שטופלו ב- Actinomycin D

פרוטוקול זה מבוסס על LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. אנו משתמשים בציטומטריית זרימה כדי לנתח צביעה כפולה של Annexin V ו-7-AAD כדי לזהות מוות תאי, תוך שימוש בתא כולו ושימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לצפות במורפולוגיה של קרום התא.

LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA ותיקופו

Pyrosequencing (R) היא אחת מהשיטות יסודית ביותר עד כה פשוט עד כה נעשה שימוש כדי לנתח פולימורפיזמים. שיטה זו הובילה הערכה נוקלאוטיד יחיד מהיר ויעיל פולימורפיזם כולל פולימורפיזמים רלוונטיות קלינית רבים. הטכניקה והמתודולוגיה של Pyrosequencing הוא הסביר.

Pyrosequencing: שיטה פשוטה genotyping מדויק

למד פרוטוקול משופץ לזיהוי מוות תאי באמצעות Annexin V ו-PI עם תיקון פורמלדהיד ופירוק RNA. השיטה מפחיתה דיווחי שווא ב-40% ומספקת הערכה מדויקת של אפופטוזה ונקרוזה בתאים שונים.

השתנה Annexin V / Propidium אפופטוזיס יודיד Assay לקבלת הערכה מדויקת של מוות של תאים

גלה סרטונים נוספים