Dissection ו 2-Photon הדמיה של בלוטות לימפה הפריפריה עכברים
23 באוגוסט 2007
שני הפוטונים הדמיה חשף תנועתיות הלימפוציטים אינטראקציות הסלולר בתוך הצומת לימפה בתנאי הבסיס, במהלך תגובה חיסונית 1. הנה, אנחנו מדגימים העברת המאמצת של תאים T, בידוד של בלוטות הלימפה, ועל תנועתיות הדמיה של CD4 + T תאים בתוך הצומת לימפה explanted.
שלום, שמי מלאני מתיו. אני מהמעבדה של מייקה הלן באוניברסיטת קליפורניה ארווין. והיום אנו נוציא קשרי לימפה מעכבר לצורך דימיון פוטוניהה-סיטו (insitu to photon imaging).
תהליך זה כולל הסרה של קשרי הלימפה המפשריים (inguinal lymph nodes), קשרי הלימפה הבתיים (axillary lymph nodes) וקשרי הלימפה הצוואריים (cervical lymph nodes). שש קשרי לימפה פריפריים הנגישים בקלות בעכבר. כדי להחדיר תאים פלואורסצנטיים לקשרי הלימפה של העכבר שלנו, ובמטרה לבצע הדמיה באמצעות הדמיה דו-פיתונית (two botton imaging), עלינו לבצע תחילה העברה מאמצת (adoptive transfer) של תאים המסומנים פלואורסצנטית.
לכן עבור ניסוי זה, אני אראה לכם תחילה את ההעברה האדופטיבית. הנה מזרק אינסולין בכילוי 28. אני אטען אותו עם תאים או תאים.
ראשית, אני רוצה לשחרר את חסימת המזרק כדי שיזרום בקלות. לאחר מכן, אטען את התאים בזהירות. אשתדל ככל הניתן לא לגעת בדפנות המבחנה עם מזרק האינסולין, שכן הדבר עלול להקהות את המחט ולהקשות על ביצוע ההזרקה לווריד הזנב של העכבר.
אם ישנן בועות אוויר, עליכם להוציא אותן על ידי נקישה, כדי להרחיקן מהדרך. נקישו אותן החוצה כאן. וכך סיימנו.
כעת אנו מוכנים להזריק את התאים הללו לווריד הזנב. אוקיי, הנה עכבר C 57 black six שלנו. נחליק אותה באיטיות ובזהירות לתוך המזריק לווריד הזנב.
עכברים רבים אינם אוהבים זאת, אך הדבר מונע מהם לקפוץ בזמן ההזרקה עצמה ולפגוע בעצמם, או גורם למניעת דריסה של המחט בבשרכם. לכן, יש לקבע את העכבר בפנים באיטיות רבה. כעת, חפשו את וריד הזנב לאורך דפנותיו של זנב העכבר.
עורק גדול עובר לאורך החלק העליון. ובכל אחד מצדדי זנב העכבר, ישנם שני ורידים ארוכים וברורים. המשיכו כלפי מטה עד לקצה.
כעת קחו את המחט והתחילו בחלק התחתון של הזנב וחפשו וריד. אני יכולה לראות שם וריד. ארטיב אותו מעט עם ethanol, זה יכול להפוך אותו לברור יותר לצפייה.
כעת נבצע הזרקה לווריד הזנב, וחשוב להקפיד ששיפוע המחט יהיה פונה כלפי מעלה. כלומר, שהקצה הפתוח של המחט יופנה למעלה, ולהניע אותה כמעט במקביל לזנב.
אין להכניס את המחט בזווית מכיוון שהורידים נמצאים ממש למעלה. יש להחליק את המחט לתוך וריד הזנב באיטיות רבה. תוך כדי הפעולה, עם רכישת ניסיון, תהיו מסוגלים להרגיש את כניסת המחט.
אך בפעמים הראשונות כדאי לדחף את הנוזל כדי לבדוק אם יש התנגדות. אם אין התנגדות, אתם נמצאים בוריד הזנב ויכולים לבצע הזרקה מהירה וקלה, כפי שעשיתי כעת. לאחר מכן ניתן להוציא את המחט באיטיות.
אישור נוסף לכך שאתם נמצאים בתוך הווריד הוא הופעתו של טיפת דם קטנה כתוצאה מזרימה לאחור. לכן, זרימה קלה של דם מאתר ההזרקה תאשר שאתם אכן נמצאים בווריד הזנב. הדימום של העכבר אמור להפסיק זמן קצר לאחר ההזרקה.
בסדר, הנה עכבר ה-black six שלנו. אנחנו עומדים להוציא קשרי לימפה מהעכבר מהמפשעות (inguinal flanks), שנמצאות כאן, וכאן מתחת לבית השחי, שם נמצאים הקשרי הלימפה האקסילריים (axillary nodes). וגם בצד השני כאן. לאחר מכן, את קשרי הלימפה הצוואריים השטחיים (superficial cervical nodes), שנמצאים כאן למעלה בגרון, כאן וכאן, אחד בכל צד.
שלום. כעת אנו מוכנים לנשוף את העכבר. אתחיל בהצמדת העכבר ללוח הנשוף באמצעות סיכות. ואני פשוט אצמיד את העכבר. כן.
יש לוודא שהקיבוע בסיכות בטוח. הדבר יאפשר לנו לחשוף טוב יותר את קשרי הלימפה ההיקפיים. לכן, אני בדרך כלל מקבע את ארבע כפות הרגליים.
אינני דואג לגבי הזנב. יש המעדיפים להצמיד גם את הזנב. לאחר מכן, כדי למנוע מפרווה להיכנס לאזור שבו אנו מבצעים את הניתוח ולהיסPutting על קשרי הלימפה והמכשירים שלנו, אנו מרססים את העכבר ב-70% ethanol.
כעת, לאחר שהעכבר הופעל באתנול, אבצע חתך בקו האמצע. אני עושה זאת על ידי משיכת הפרווה הרחק מהגוף. ניתן לראות שאני יכול למשוך את העור למעלה וליצור מעין אוהל קטן.
וזה ימנע ממך לחתוך את הפריטונאום, דבר שאינך רוצה לעשות במקרה זה. אוקיי, אז אתחיל בחתך בקו האמצע כאן למעלה. אני מבצע חתך קטן ומוודא שאינני חודר אל הפריטונאום.
ניתן לראות את הפריטונאום (peritoneum) מתחת. אני מחליק את המספריים מתחת לחתך ובצורה איטית אני מפריד את העור מהפריטונאום, תוך ביצוע חתכים קטנים תוך כדי התקדמותי, מכיוון שאנו עומדים להוציא את קשרי הלימפה הצוואריים. אני אגזור כל הדרך עד לקו הלסת של העכבר, בזהירות רבה ובאיטיות, תוך כדי וידוא שאיני פוגע בכלי דם מרכזיים.
מכיוון שאנו מוציאים את קשרי הלימפה המפשעיים (inguinal lymph nodes), שנמצאים בחלק התחתון של השמflap העורי, אבצע חתך בקו האמצע כל הדרך למטה עד לבסיס הזנב. וכך זה עולה. זהו חתך בקו האמצע שיያרה את המטרה.
כעת אפריד את העור מהפריטונאום. אבצע זאת בעדינות בעזרת פינצטה, תוך משיכת העור הרחק מהפריטונאום תוך כדי תנועה. כך אחשוף את קשרית הלימפה הראשונה שנבצע לה נתיחה.
זהו קשרי הלימפה המפקירי (inguinal lymph node) כאן למטה בשflap העורי התחתון. כעת, לאחר שהרחקתי שflap עורי מגופו הראשי של העכבר, אני אקבע אותו בעזרת סיכות כדי לחשוף את קשרי הלימפה המפקירי. כעת יש חשיפה טובה יותר של קשרי הלימפה המפקירי, שתאפשר לנו לבצע דיסקציה נקייה שלו.
כאן אנו רואים את קשרי הלימפה המפשעיים (inguinal lymph node) חשופים לאחר קיבוע. הם נמצאים בדרך כלל בתוך מקפלת העור, מעל הרגל. ניתן לאתר אותם על ידי חיפוש צומת של כלי דם בצורת Y העוברים מעליהם.
והנה הוא. הוא שקוע בתוך מעט רקמה שומנית, כאשר כלי הדם עוברים מעליו. כעת, אני אסיר את קשרי הלימפה המפשעיים.
אני מעביר את הפינצטה לאורך שני צדי קשרי הלימפה כדי להפריד אותם מהשומן. איננו רוצים שומן; בדימות הדו-פוטוני שלנו, השומן יעכיר את חדירות הלייזר לרקמה.
בואו נראה. חשוב להסיר את כל השומן מסביב לקשרית הלימפה, וכן לשמור על קליפת קשרית הלימפה שלמה. בסדר, הנה זה.
הנה קשרי הלימפה של ה-iena שלנו. אני אשים אותם במצע שלנו, והדרך הטובה לדעת אם הסרתם את כל השומן היא אם קשרי הלימפה שוקעים. ברגע שתניחו אותם במצע, הם ישקעו ישר לתחתית.
אם יש שומן, הוא יצוף. כעת, אני עומד להוציא את קשרי הלימפה העזרים. הם ממוקמים בבית השחי של העכבר, ממש לצד כלי דם מרכזי.
לעתים זה עשוי להיות מורכב, כיוון שעלול להתרחש דימום רב שיסתיר את הקשרית. אך אראה לכם כיצד אני פועל, ובתקווה שלא יהיה דימום הפעם. ראשית, אני משחרר את זהות העור, ובפועל אני משחרר את הזרוע לצד הקשרית שאני מעוניין להוציא.
זה מאפשר לי להרחיק את העור במיומנות רבה יותר באמצעות אצבעותיי, תוך כדי החזקת השריר הזה העובר מעל בית השחי, ומשיכה עדינה אמורה להוביל להופעת קשרית בבית השחי. אני אחפש אותה כעת. והנה היא.
זה נמצא שם, בבית השחי, לאורך כלי דם מרכזי. כעת אני עומד להוציא את קשרית הלימפה האקסילרית (הבית שחי); ניתן להצמיד שוב את העור בעזרת סיכות או להחזיקו עם האצבעות, לפי מה שנוח לכם יותר. אך אני מעדיף לעבוד עם זה בזהירות.
יש מעט מאוד שומן מסביב לקשריה לימפה זה, מה שהופך אותו לנוח לדמיון, אך הוא סמוך לכלי דם ראשי, לכן ניתן לאבד אותם לעיתים אם לא נזהרים. לכן, עבור הקשרית האקסילרית, אני תופס את רקמת החיבור שסביבה ומפריד אותה באיטיות מכלי הדם. ובסדר, הנה זה.
הנה קשרי הלימפה האקסילריים שלנו. כך, הם נמצאים ממש שם. זהו קשרית לימפה ארוכה ושטוחה ויפה.
אני אוחז מעט מרקמת החיבור שנותרה בצד של הקשרית כדי שלא נגרום נזק לקשרית עצמה. אנו נבצע דימות כדי לשמור על לחות קשריות הלימפה. לפני ביצוע הדימות במוסד, אנו מניחים אותן במצע שאינו תלוי CO2 בתאים נפרדים, כך שנוכל לעקוב אחר קשריות הלימפה המפקיעות (inguinal), הביתית (axillary) והצווארית (cervical).
ניתן לדעת אם הכנת קשרי הלימפה בוצעה כהלכה אם הם שוקעים לתחתית לאחר השליפה. המשמעות היא שיש מעט מאוד שומן בקשרי הלימפה. כעת אסיר את קשרי הלימפה הצוואריים, השכמיים.
ואני עושה זאת, אני מתחיל בהצמדה מחדש מהשלב שבו הוצאתי את קשרי הלימפה הבטים, כדי לחשוף את רקמת הצוואר בצורה טובה יותר. קשרי הלימפה הצוואריים נמצאים ליד שרירי הלסת של העכבר. למעשה, לאורך הצד.
אלו הם אותם קשריים לימפטיים שניתן להרגיש כאשר חולים. אלו הם הקשריים שנמצאים כאן, ואותם יבדוק הרופא במידה ויש לכם צינון. כדי לבצע זאת, אני נוהג להחדיר את האצבע מתחת לרקמה כדי למשוך אותה מעט קדימה, בעוד אני מעביר את הפינצטה לאורכה של הצד.
אני אמור לראות קשר לימפה שבולט החוצה. אה, הנה הוא. הוא נמצא שם למעלה ברקמה.
הנה זה. כך שקיים קשר לימפה צווארי שטחי. יש להיזהר לא להסיר את בלוטות הרוק.
לא תמצאו תאי T בבלוטות הרוק שלכם. לעומת זאת, קשרי לימפה ספציפיים אלו מכילים תאי T חיוביים ל-CD4 המסומנים ב-CFSC. לכן, נראה לכם סרטוני in situ של תאי T אלו נעים בתוך הרקמה.
כעת אני הולך להדביק את קשרי הלימפה לכיסוי פלסטיק בלתי שביר, כדי שנוכל לקבע אותם לתחתית במה של דימוי in situ. באופן זה, נמנע מתזוזה של הרקמה או מסחף רקמה בזמן שנדמה את תאי ה-T. לפניי נמצאים כיסויי הפלסטיק הבלתי שבירים.
הדבר הראשון שאעשה הוא לגזור את אחד מהם לגודל המתאים עבור קשרי הלימפה שלנו. לכן, אני פשוט לוקח את המספריים וגוזר כאן ריבוע קטן. אוקיי, עכשיו אני אמרח עליו דבק.
זו כמות קטנה של דבק. מרחו אותה מסביב לחתיכת הזכוכית שחתכנו. לאחר מכן, אשתמש בנייר ניגוב מסוג Kimwipe כדי לספוג חלק מהדבק.
זהו דבק שיכסה את הקשר. אנו מעוניינים בשכבה דקה מאוד כדי שלא תסתיר את הדימות. כעת אוציא קשר לימפה מהתמיסה.
נתחיל עם קשרי הלימפה הראשון שלנו כאן, ונוציאו אותו מהתווך. יש לנהוג בעדינות; חשוב להימנע מפגיעה בקורטקס של הקשרית.
אני אחזיק רק את הפינה שלו ואדביק אותו לסלייד על ידי נגיעה עדינה של פינת קשרי הלימפה בסלייד תחילה, ולאחר מכן משיכה של קשרי הלימפה לאורך הסלייד כדי לקבע אותם אליו. השתמשתי במעט השומן שנותר על קצה קשרי הלימפה כדי לבצע זאת, כך שאיני פוגע למעשה בקורטקס של הקשרית.
לאחר מכן אני לוקח את קשרי הלימפה, וכדי להקשות את הדבק, אני טובל אותם באותה השקע ממנה הוצאתי אותם. לכן, אני הופך אותם ואטבול אותם בעדינות במדיום המכיל את הדבק. אני מסיר מעט מדבק ה-exo שהתקשה עליהם.
זהו זה. כעת יש לנו קשרי לימפה המוכנים לדימוי בשיטת פוטון כפול. כך מכינים קשרי לימפה לדימוי פוטון כפול in situ.
כעת נעביר אותם למיקרוסקופ שלנו, נגדיר אותו ונשיג תמונות נהדרות של תאי T שהעברנו באופן אדופטיבי. כאן אנו רואים תאי T המסומנים ב-CFSE נעים בתוך קשרית לימפה מגרית. סרטון זה מואץ פי 500 בערך, וניתן לראות כי התאים בעלי יכולת תנועה גבוהה.
הם מוגדלים בערך פי 20 עם עדשת המטילה למים שלנו ב-20 x. זוהי דוגמה לתנועת תאי T בלבד. לא ביצענו צביעה של התאים מסביב.
בדרך כלל, בניסויי צילום דו-פלוורסנציה מתקדמים יותר, ניתן להשתמש בתאי דנדריטים צבועים, בתאי B ותאי T צבועים שמעמידים אינטראקציה עם תאי NK צבועים. ניתן לסמן כמעט כל סוג תא שאתם מצפים לראות בתוך קשרי הלמפה ולהמשיך לצילומו. וזהו עבור פרוטוקול צילום קשרי הלמפה של המכון שלנו.
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את תהליך ההעברה האדופטיבית של תאי T ואת הדמיית הניידות של תאי CD4+ T בתוך קשרי לימפה באמצעות הדמיית שני פוטונים. המחקר מספק תובנות לגבי אינטראקציות של לימפוציטים במהלך תגובות חיסוניות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
רקע
- דימות דו-פוטוני הוא טכניקה רבת עוצמה להדמיית דינמיקה תאית in vivo.
- קשרי הלימפה ממלאים תפקיד קריטי בתגובה החיסונית על ידי קידום אינטראקציות בין לימפוציטים.
- הבנת התנהגות תאי T חיונית לפיתוח אימונותרפיה.
- מחקר זה מתמקד בניידות של תאי T מסוג +CD4 בקשרי לימפה.
מטרת המחקר
- לבחון את הניידות של תאי CD4+ T בבלטות לימפה בתנאים בסיסיים ובמהלך תגובות חיסוניות.
- להדגים את המתודולוגיה לבידוד בלטות לימפה ולביצוע דימוי דו-פוטוני.
- להעמיק את ההבנה של אינטראקציות בין תאי T בתוך מערכת הלימפה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- העברה אדופטיבית (Adoptive transfer) של תאי T המסומנים פלואורסצנטית לעכברים.
- הוצאה (Dissection) של קשרי לימפה פריפריים מעכברים.
- דימוי דו-פוטוני להדמיית ניידות של תאי T.
- שימוש במזרקים ובטכניקות ספציפיות להזרקה מדויקת לווריד הזנב.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של קשרי לימפה ממרכז המפשעה (inguinal), בית השחי (axillary) והצוואר (cervical) מעכברים.
- הדמיה של ניידות תאי CD4+ T בתוך קשרי הלימפה.
- הדגמה של טכניקת העברה אימונית (adoptive transfer) של תאי T.
- תובנות לגבי הדינמיקה של אינטראקציות בין לימפוציטים במהלך תגובות חיסוניות.
מסקנות
- המחקר מספק מסגרת לשימוש בדימות דו-פוטוני לבדיקת התנהגות תאי T בקשרי לימפה.
- הבנת ניידות תאי T היא קריטית לקידום המחקר האימונולוגי.
- ניתן ליישם את השיטות המפורטות כדי לחקור לעומק תגובות חיסוניות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי דו-פוטוני של תאי T מסומנים פלואורסצנטית שהועברו באופן אדופטיבי לקשרי לימפה של עכברים מאפשר ויזואליזציה ישירה של ניידות תאי חיסון ושל אינטראקציות ביניהם ברקמה שלמה. יכולת זו תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרות עבור גילוי תרופות ממוקדות אימונולוגיה, ומספקת ביטחון חיזוי באסטרטגיות של מודולציה חיסונית בשלבים מוקדמים. גישה זו ממוקמת במפגש שבין ביולוגיה של גילוי לאימונולוגיה תרגומית, ומסייעת בקבלת החלטות לגבי פורטפוליו של נכסים המכוונים למערכת החיסון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מבצע ויזואליזציה ישירה של דינמיקה ואינטראקציות של תאי מערכת החיסון בסביבות רקמה טבעיות.
- מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות חיסוניות באמצעות כימות של ניידות ותמיכה מרחבית (localization) של תאי T.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת התנהגויות תאיים בתנאים בסיסיים ובתנאי גרייה.
- מאפשר בדיקת השערות לגבי מעורבות של מסלולים חיסוניים ונקודות התערבות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מבסס מערכות ex vivo מתוקשפות עבור בדיקות כמותיות מבוססות דימוי.
- מספק תוצאים בעלי תוכן גבוה וניתנים לשחזור של תנועת תאי חיסון ומיקום ברקמה.
- מאפשר סטנדרטיזציה של פרוטוקולי העברה אדופטיבית (adoptive transfer) ודימות לצורך סריקה בשלבים הבאים.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה למחקרי תפקוד של תאי מערכת החיסון.
מחקרe טרנסלציונלי ופרה-קליני
- מתאימה מדדי ניידות של תאי מערכת החיסון להקשרי רקמות הרלוונטיים למחלה.
- מקשר בין ממצאי גילוי למודלים פרה-קליניים על ידי שימור הארכיטקטורה הפיזיולוגית של הרקמה.
- מסייע בקידום מותאם-סיכון של מועמדים לאימונומודולציה על בסיס התנהגות תאית in situ.
- מספק רצף לפיתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים במחקר בתחומי האימונו-אונקולוגיה והמחלות האוטואימוניות.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית וישירה של התנהגות תאי חיסון ברקמה לימפואידית שהוצאה מהגוף לאחר העברה אדופטיבית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בחקירה מונחית-השערות של דינמיקת תאי חיסון ומעורבות של מטרות (target engagement).
- סריקה: מספקת פלטי דימות כמותיים וניתנים לשחזור עבור ניידות ומיקום של תאי חיסון.
- אנליטיקה: מספקת נתוני וידאו תלת-ממדיים בעלי תוכן גבוה (high-content) לצורך ניתוח השוואתי של תגובות תאיות.
- מחקר טרנסלציונלי: שומרת על ההקשר הרקמתי לצורך התאמה למודלים של מחלות ואסטרטגיות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר למגוון מחקרים של מעקב פונקציונלי ומעקב אחר תאי חיסון.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזויי בתיקוף של מטרות חיסוניות ואת ההבנה המכניסטית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי העברה אדופטיבית (adoptive transfer) ודימוי לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go) עבור תוכניות המכוונות למערכת החיסון, בהתבסס על ראיות תאיות ישירות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של נכסי אימונולוגיה באמצעות נתונים פונקציונליים ברמת הרקמה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים בעכברים, העברה אדופטיבית (adoptive transfer) וטכניקות דימוי מתקדמות.
- מחייב גישה למיקרוסקופיה דו-פוטונית ולתשתית לסימון פלואורסצנטי.
- מצריך סטנדרטיזציה קפדנית של הפרוטוקול לצורך שחזור בין צוותים שונים.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור סוגים שונים של תאי מערכת החיסון או הקשרים רקמתיים שונים.
- עומק הדימוי ואיכות הכנת הרקמה עלולים להגביל את עקביות הנתונים.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
6:42
Removing the Inguinal Lymph Nodes
8:48
Removing the Axillary Lymph Nodes
0:41
Tail Vein Injection for Adoptive Transfer of CFSE-labelled T Lympho
0:13
Introduction
3:45
Removal of Lymph Nodes
15:36
2-photon Imaging of Lymph Nodes in Situ
11:24
Removing the Cervical Lymph Nodes
0:00
Title
13:07
Preparation of Lymph Nodes for In Situ Imaging
