Name: Lineage תיוג של תאים דג הזברה עם לייזר Uncagable והעמסת dextran (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: למד שיטת תיוג שושלת תאים בזברה דניו רריו באמצעות לייזר UV ופלואורסצין כלואה. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר גורל תאים ספציפיים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אימונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות דן קרלין לעזרה בקבלת והעמסת בכלוב. בנוסף אנו רוצים להודות מקורות המימון הבאים: אוניברסיטת ונדרבילט תוכנית בית הספר לרפואה של גרנט לביולוגיה התפתחותית הכשרת הומ&quot;ת, ו-NIH HD054534to JTG.

1. סינתזה של Caged והעמסת dextran <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את 3.5-4 מ"ג aminodextran ולהוסיף לתוך צינור Invitrogen-סיפקה כהים המכיל 1 מ"ג של CMNB-בכלוב והעמסת SE. בידיים שלנו יחס זה נותן טעינה ממוצע של 2.5 ~ מולקולות צבע לכל dextran. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של 0.1 M Na 2 B חיץ O 7 (borate נתרן) 4 אל הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי ו מערבולת למשך 30 שניות לפרק את aminodextran והעמסת בכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו להגיב על לילה מערבל vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוויסט את הסגר התחתון על עמודה ספין זבה ו לשחרר את הפקק. סמן נקודה על הטור עם עט. המקום עמודה צינור 15 מ"ל קונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 1000 2 דקות עם נקודה מול מרכז של הרוטור. השתמש בעמודה מיד לאחר הדחיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום עמודה דחוסה בתוך שפופרת 15 מ"ל חדש חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובה בריכת תערובת ולהעביר למרכז המיטה עמודה דחוסה שרף. החלף כובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 1000 2 דקות עם נקודה מול מרכז של הרוטור. אחרי ספין, eluent וחלקו העליון של הטור יהיה בערך באותו גוון של צבע צהוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את eluent צהוב (~ 350 μL) אל צינור 1.5-מ"ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize כדי יובש speedvac. מכסים את speedvac בנייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את התוצאה ~ 2-3 מ"ג של קצף צהוב בהיר במים לריכוז סופי של 1% w / v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הפתרון הזה ב -20 ° C בנייר מכוסה צינורות. זה רעיון טוב aliquot הפתרון dextran למנוע להקפיא הפשרת חוזרות. </li></ol> 2. הזרקה של Caged והעמסת dextran לעוברי דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 1% w / v מלאי בכלוב והעמסת dextran 1:05 או 1:10 ב 0.2M KCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 0.5 - 1.0nL של פתרון והעמסת בכלוב בחלמון של שלב אחד עוברים באמצעות תא לחץ ההזרקה. הזריק פעם, מצמדים של עוברים חייב להישמר בחושך על 28.5 מעלות צלזיוס כדי להפחית את הלא ספציפית משחררות רפרוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה ידנית chorions מעוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עוברים tricaine 4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים יהיה רכוב agarose 0.8% בצלחת פטרי 35mmx10mm, מכוסה ואחר כך עם מים ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן agarose נמס גוש חום 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה זכוכית, לצייר את אחד העובר על כמות מינימלית של מים ולשחרר אותו לתוך הערה agarose:. חשוב לקרר את הצינור של agarose ביד למשך כ 30 שניות לפני לשים את העובר לתוך הצינור כדי למנוע להרוג את העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה העובר מהצינור, יחד עם כ 50μL של agarose ו להוציא את התוכן על גבי במרכז צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לכוון את העובר באמצעות חוט ניילון עם התאים להיות שברחה מכלוב פונה כלפי מעלה. הערה: agarose עם מגניב כל כך מהר להיות פזיז עם המכוונת את העובר. עוברים עלולים להינזק אם מניפולציות לאחר agarose הופך נוקשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose כדי לחזק לחלוטין (זה לוקח כמה דקות) ולמלא את שני שליש צלחת מלאה במים ביצה המכיל tricaine 4% ו PTU 0.003%. </li></ol> 3. לייזר משחררות רפרוף של והעמסת dextran <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המיקרוסקופ משמש משחררות רפרוף חייב להיות אובייקטיבי 40X טבילה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים מכשירים Photonics לייזר עם תא לצבוע 365 ננומטר לבין 70% / 30% במראה לפצל dichroic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני משחררות רפרוף, הלייזר חייב להיעשות parfocal במטרה ואת נחלש לשלטון המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למקד את הלייזר, במקום שקופיות הזכוכית תחת שיקוף המטרה ולמקד את המטרה עד שריטות בשקופית גלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם לייזר מחליש עד הלייזר יכול לייצר מאפס לעין במראה עם דופק אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המיקוד אובייקטיבית מעלה ומטה. אם הלייזר יכול לייצר מאפס, כאשר המטרה היא מתוך המיקוד, ולהתאים את המיקוד לייזר ¼ פונים כלפי מעלה או מטה. חזור על הפעולה עד הלייזר יכול לגרד את המראה רק כאשר המטרה היא ממוקדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום רכוב העובר תחת המטרה ולהתמקד בתחום להיות שברחה מכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי uncage, להתמקד תא עניין הדופק הוא 10-20 פעמים בשעה 2-3 הרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר משחררות רפרוף, העובר חינם על ידי קילוף agarose משם עם מלקחיים ומכניסים אותם במים ביצה המכיל PTU 0.003%. בואו עוברים לפתח בתיבה אור חזק עד שהם קבועים. </li></ol> 4. נוגדן סימון וזיהוי של שברחה מכלוב והעמסת dextran <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן עוברים Ab מקבע (paraformaldehyde 4%, 0.3mm CaCl 2, סוכרוז 8%, פוספט 1X שנאגרו pH מלוחים, 7.3) במשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר (RT) או לילה (O / N) בשעה 4 ° C. שמור עוברים בקופסת אור חזק או עטוף בנייר אלומיניום צינור עבור כל הצעדים תיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע ולהחליף MeOH 100%, להשאיר למשך 10 דקות ב RT, להסיר MeOH ו replace עם MeOH 100% טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן MeOH ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. הערה: ניתן לאחסן MeOH עד שבועיים לפני epitopes להתחיל להשפיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם עוברים עם 5 דקות על RT שוטף של פוספט MeOH/1X 75% שנאגרו מלוחים עם 0.1% Tween 20 (1X PBSTw), ואז 50% 1XPBTw MeOH/50%, אז 25% MeOH/75% 1X PBSTw. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות בתוך 1XPBSTw. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הם עוברים&gt; 24 שעות הישן, permiabilize עוברים עם 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​proteinase K ב 1XPBSTw. זמן Permiabilization תלויה על הבמה. חמש דקות בתוך proteinase K מספיק אם הם עוברים בין 24 ו 48 שעות לאחר ההפריה (hpf). יותר זמן שיידרש, אם עבור הזחלים יותר. Re-לקבע Ab מקבע במשך 20 דקות ב RT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חמש פעמים במשך 5 דקות בתוך 1XPBSTw ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פתרון לחסום (1XPBS, x100 טריטון 0.1%, כבשים בסרום 10%, 10% חלבון בסרום שור, sulfoxide דימתיל 1%) עבור 1-2 שעות RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים הראשי (אנטי והעמסת בתוספת נוגדנים כנגד תאים מסוג סמנים ספציפיים) בחסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים דגירה O / N ב 4 ° C בתמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ארבע פעמים במשך 20 דקות ב 1XPhosphate בופר עם x100 טריטון 0.1% (PBSTx) בשעה RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל fluorescently שכותרתו נוגדנים משני (בדרך כלל 1:300) בחסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה O / N ב 4 ° C בתמיסה המכילה נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ארבע פעמים במשך 20 דקות ב 1XPBSTx ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים נקה 1XPBS 50% glycerol/50% לפחות שעתיים RT, ולאחר מכן להסיר גליצרול / תערובת PBS ולהוסיף גליצרול 100% ולתת לעמוד O / N ב 4 ° C. </li></ol> 5. נציג תוצאות: לאחר immunolabeling, צריך להיות אזור להעשיר של מכתים בתאים שהיו שברחה מכלוב (Figure.1). אין זה יוצא דופן לראות אות גבוה יחסית יחס רעש דג הזברה 48&gt; שעה הישן, בשל משחררות רפרוף ספונטנית של והעמסת את. <img src="/files/ftp_upload/2672/2672fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תיוג שושלת של מורכבות האצטרובל דג הזברה. בגיל 24 hpf, חלק anlage האצטרובל הקדמי, שמסומן על ידי foxd3:. ביטוי של GFP, היה שברחה מכלוב באמצעות פעימות לייזר UV) על ידי 48hpf, מקבץ של צד שמאל של תאים הקרוי parapineal (עיגול אדום) התפתחה מן שברחה מכלוב תחום (עיגול לבן). B) שברחה מכלוב אות והעמסת מועשר במעגל (parapineal אדום) ואת איבר האצטרובל (עיגול לבן).

<ol><li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Precursors+Can+Give+Rise+to+All+Major+Cell-Types+of+the+Frog+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina.</a> Science. 239, 1142-1145 (1988).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+fluorescent+tracers+to+study+neural+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages.</a> Development. , Suppl 2. 1-8 (1991).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuC%3AKaede%2C+a+useful+tool+to+label+neural+morphologies+in+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo.</a> Genesis. 44, 136-142 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+Fluorescent+Probes+and+Research+Chemicals%22">Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals</a>. , 9th Edition, 707-711 (2002).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+%28caged%29+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo%2C+Lytechinus+variegatus%2C+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כפי שתואר, פרוטוקול זה מספק תיוג מהיר יחסית השושלת דג הזברה השיטה בנויה על טכניקות נפוץ של microinjection, מיקרוסקופיה, ו immunofluorescence. מצאנו כי הלייזר משחררות רפרוף להיות הדרך היעילה יעיל ביותר עלות uncage והעמסת באופן מקומי. שיטה זו יכולה לשמש תווית השושלת עם נקודות הקצה ניסיוני מאוחר ככל DPF 4. עם זאת, כפי התאים מתחלקים, ריכוז בכלוב-והעמסת לכל תא בסופו של דבר מקטין מעבר רמות לגילוי. בנוסף, היו דיווחים של משחררות רפרוף ספונטנית הלא ספציפית, והעמסת של זחלים ב 11 ...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2672">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran</a>. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to: Ilya A. Shestopalov and James K. Chen instead of: Ilya Shestopalov and James Chen

A correction to the article Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran was made.

Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<table><tbody><tr><td>CMNB-caged fluorescein SE</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>אמינו-דקסטראן, 10kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>עמודי ספין להסרת מלחים מסוג Zeba</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן עיזים נגד פלואורסצאין</td><td>Invitrogen</td><td>A11095</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חמור אנטי-עז מסוג Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21082</td><td></td></tr><tr><td>צלחוני פטרי 35 מ"מ x 10 מ"מ</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קומפאוונד אנכי עם עדשת אובייקטיב עם טבילה במים של 40x</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM6000B</td><td></td></tr><tr><td>מערכת MicroPoint להארה בלייזר ידנית</td><td>מכשור פוטוני</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פנילתיאוריאה (PTU)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>פרוטינאז K</td><td>קבוצת Roche</td><td>03115836991</td><td></td></tr><tr><td>חוט פלסטיק</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>מערבל וורטקס (Vortex)</td><td>VWR international</td><td>Vortex Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>מזרק לחץ</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr></tbody></table>

lineage תיוג של תאים דג הזברה עם לייזר uncagable והעמסת dextran

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

הבעיה המרכזית בביולוגיה התפתחותית היא להסיק את מקורם של סוגי התאים הרבים המצויים חוליות כפי שהם נובעים מבשרי מובחן. חוקרים בשיטות שונות של תיוג השושלת, כגון תיוג DiI 1 ו הזרקה בלחץ של אנזימים למעקב 2 לגורל התא לברר בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות במערכות מודל. מפות גורל הראשון דג הזברה (Danio rerio) הורכבו על ידי הזרקת iontophoretic של צבעי ניאון, כגון rhodamine dextran, לתוך תאים בודדים באזורים נפרדים של העובר וכן מעקב גורל התא מסומן לאורך זמן 3-5. בעוד יעיל, שיטות אלו תובענית מבחינה טכנית דורשים ציוד מיוחד ולא נפוץ למצוא דג הזברה מעבדות. לאחרונה, חלבוני ניאון photoconvertable, כגון Eos ו קאךה, אשר באופן בלתי הפיך לעבור מירוק פלואורסצנטי אדום בעת חשיפה לאור אולטרה סגול, רואים שימוש מוגבר דג הזברה 6-8. בהירות אופטית של העובר דג הזברה ואת הקלות היחסית של transgenesis הפכו כלים אלה אטרקטיבי במיוחד עבור תיוג השושלת כדי לבחון את ההגירה של תאים in vivo 7. למרות השירות שלהם, חלבונים אלה יש כמה חסרונות לעומת לצבוע בתיווך שיטות תיוג השושלת. החשוב ביותר הוא הקושי שמצאנו בהשגת ברזולוציה גבוהה 3-D במהלך photoconversion של החלבונים האלה. לאור זאת, אולי את השילוב הטוב ביותר של ההחלטה וקלות השימוש עבור תיוג השושלת של דג הזברה עושה שימוש בכלוב והעמסת dextran, צבע פלואורסצנטי כי הוא מחויב לקבוצה מרווה כי מסכות 9 הקרינה שלה. לצבוע אז יכול להיות &quot;שברחה מכלוב&quot; (שוחרר מהקבוצה מרווה) בתוך תא ספציפי באמצעות אור UV ממנורת לייזר או כספית, המאפשר ויזואליזציה של הקרינה שלה או immunodetection. שלא כמו שיטות iontophoretic, והעמסת בכלוב ניתן להזריק עם מנגנוני זריקה סטנדרטיים שברחה מכלוב עם מיקרוסקופ epifluorescence מצויד חריר 10. בנוסף, נוגדנים נגד והעמסת לזהות רק את הטופס שברחה מכלוב, ו epitope שורד קיבעון גם 11. לבסוף, והעמסת בכלוב יכול להיות מופעל עם רזולוציה של 3-D גבוהות מאוד, במיוחד אם מיקרוסקופיה שני הפוטונים מועסק 12,13. פרוטוקול זה מתאר שיטת תיוג השושלת על ידי והעמסת בכלוב משחררות רפרוף לייזר. Subsequenctly, שברחה מכלוב והעמסת מזוהה בו זמנית על ידי סימון עם נוגדנים עם epitopes אחרים, כגון ה-GFP.

פרוטוקול זה מתווה דרך התווית להתחקות אחר גורלו של קבוצות קטנות של דג הזברה עוברים התאים באמצעות UV-משחררות רפרוף של והעמסת בכלוב, ואחריו הר שלם immunolabeling כדי להגביר את האות והעמסת את שברחה מכלוב.

Lineage תיוג של תאים דג הזברה עם לייזר Uncagable והעמסת dextran

בעיה מרכזית בביולוגיה התפתחותית היא הסקת המקור של סוגי התאים הרבים הקיימים בחולייתנים בעת שהם נוצרים מתאים לא מובחנים...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא סימון שורת ייחוס (lineage labeling) של תאים בעובר של דג זבוב. הדבר מושג תחילה על ידי סינתזה של פלואורסצאין כלוב (caged fluorescein) והזרקתו לעוברי דג הזבוב. לאחר מכן, העוברים מותקנים באגרור (agarro) כך שהתאים המיועדים לסימון יהיו נגישים.בשלב הבא, נעשה שימוש בלייזר UV כדי להפעיל את הפלואורסצאין הכלוא בתאים נבחרים של העובר. לבסוף, העוברים נאספים לאחר שהתפתחו לשלב הרצוי, והתאים המסומנים מזוהים ביחס לסמנים של שושלות תאים ספציפיות. בסיכום, ניתן להשיג תוצאות המראות את גורלם של תאים נבחרים בעוברים באמצעות שחרור פוטו-כימי (photo uncaging) ומיקרוסקופיה אימונו-פלואורסצנטית.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון המרה פוטוכימית של Cade, הוא שפלואורסצנציה אימונו-צבועה רב-גוונית יכולה לזהות פלואורסצאין ששוחרר מהכלוב (uncaged) בנוסף לנוגדנים ספציפיים לסוגי תאים אחרים. כדי להזריק דקסטראן-פלואורסצאין כלוב לעוברי דגי זבrafish, תחילה יש לסנתז אותו ולהכין תמיסת Stock בריכוז 1% משקל לנפח. יש להכין מנות (aliquots) בהתאם לפרוטוקול הכתוב המצורף.בשלב הבא, הכינו מנת דילוול, ביחס של 1:5 או 1:10 ב-0.2 molar potassium chloride. לאחר מכן, הזריקו 0.5 עד 1 nanoliter של תמיסת caged fluorescein לחלמון שלו של עוברי בשלב תא אחד. לאחר ההזרקה באמצעות מדחק בלחץ, יש לשמור את קבוצות העוברים בחושך בטמפרטורה של 28.5 °C כדי להפחית שחרור לא ספציפי (non-specific uncaging) עד לשלב ההתפתחותי הרצוי.הסר ידנית את ה-choon מהעוברים, הרדם את העוברים ב-4% trica כדי להכינם להרכבה, והשג שיהיו בשיווי משקל ב-0.8% aros מומס בבלוק חימום של 50 degree Celsius למשך 15 דקות לפחות. לאחר מכן, קרר את המבחנה בידך למשך כ-30 שניות. לפני הוספת העוברים, שאב באמצעות פיפטת זכוכית עובר אחד בכמות מינימלית של מים ושחרר אותו אל ה-aros. שאב את העובר מהמבחנה יחד עם כ-50 microliters של aros והזרק את התוכן למרכז של Petri dish בגודל 35 millimeter על 10 millimeter.באמצעות חוט פלסטיק, כוון במהירות את העובר כך שהתאים המיועדים לשחרור (uncaging) יפנו כלפי מעלה. אפשר לאגרוס להתמצק לחלוטין ולמלא את הצלחת. מלא את הצלחת עד לשני שלישים במי ביצים המכילים 4% trica ו-0.003% PTU, ושמור את העוברים בתוך קופסה חסומה לאור עד לביצוע השחרור.כדי לבצע שחרור בלייזר (laser uncaging) של פלואורסצאין דקסטראן, השתמשו במיקרוסקופ תרכוב עם עדשה אובייקטיבית בעוצמה של 40x עם טבילה במים. אנו משתמשים בלייזר של photonics instruments עם תא צבע של 365 ננומטר ומראה דיכרואי בפיצול של 70%30% לפני השחרור. יש לוודא שהלייזר נמצא במיקוד (par focal) עם העדשה האובייקטיבית ולהחליש אותו לעוצמה המתאימה כדי למקד את הלייזר.הניחו זכוכית עם מראה מתחת לעדשה והתמקדו בעדשה עד ששריטות בזכוכית יהיו גלויות. כווננו את מפחית עוצמת הלייזר עד שהלייזר ייצר שריטה הנראית בבירור במראה באמצעות פולס בודד, תוך כיוונון מיקוד העדשה למעלה ולמטה. אם הלייזר יכול לייצר שריטה כאשר העדשה אינה ממוקדת, כווננו את מיקוד הלייזר ברבע סיבוב.העלו או הרדו את המיקום. חזרו על הפעולה עד שהלייזר יוכל לשרוט את המראה. רק כאשר העדשה ממוקדת, הניחו את העובר המורכב תחת העדשה ומקדו את האזור המיועד לשחרור (uncaging) כדי לבצע את השחרור.התמקדו בתא הרלוונטי ובצעו 10 עד 20 פולסים בתדר של שני עד שלושה הרץ. לאחר השחרור מהכלוב (uncaging), שחררו את העובר על ידי קילוף ה-aeros באמצעות פינצטה והעבירו אותם למים לביצים המכילים 0.003% PTU. קבעו את העוברים במקבע נוגדנים למשך שתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.הסיר את המקבע והחלף אותו ב-100% methanol. דגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את ה-methanol והחלף אותו ב-100% methanol טרי.אחסן את העוברים במתנול בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. ניתן לאחסן במתנול עד שבועיים לפני שהאפיטופים יתחילו להתפרק. בצע רהידרציה לעוברים באמצעות שטיפות של חמש דקות בטמפרטורת החדר ב-75% Methanol ו-25% one x phosphate buffered saline עם 0.1% tween 20, לאחר מכן ב-50% methanol ו-50% one XPBS tween 20, ואז ב-25% methanol ו-75% one XPBS tween 20, ולבסוף שלוש שטיפות של חמש דקות ב-one XPBS tween 20.אם העוברים בני יותר מ-24 שעות, חדירו אליהם 10 µg/mL של Proteinase K ב-XPBS tween 20. זמן החדירה תלוי בשלב ההתפתחותי של העובר. חמישה דקות של חשיפה ל-protease K מספיקות.אם העוברים נמצאים בין 24 ל-48 שעות לאחר ההפריה, ייתכן שיידרש זמן רב יותר עבור זחליים מבוגרים יותר. קבעו שוב עם מקבע נוגדנים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את העוברים חמש פעמים למשך חמש דקות ב-one XPBS tween 20 בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, דגרו בתמיסת חסימה למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר. דללו את הנוגדנים הראשוניים בתמיסת החסימה. לאחר מכן, דגרו את העובריים למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C בתמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים; למחרת בבוקר, שטפו את העובריים ארבע פעמים ב-1X PBS Triton X-100. דללו נוגדנים שניים המסומנים פלואורסצנטית בתמיסת חסימה.דגרו את העוברים למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C בתמיסה המכילה נוגדנים משניים. לאחר שטיפה ארבע פעמים ב-1X PBS Triton X 100, בצעו שקיפות של העוברים ב-50% glycerol ו-50% 1X PBS למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסירו את תערובת ה-glycerol PBS והוסיפו 100% glycerol לדגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.תוצאות מייצגות עבור ביקורת ועבור זחלים שעברו שחרור פוטו-כימי (photo uncaging) מוצגות בצורה של היטלי קונפוקל. עוברים של קבוצת הביקורת הוזרקו עם פלואורסצין כלוב (caged fluorescein) אך לא הוכפפו לשחרור פוטו-כימי 48 שעות לאחר ההפריה. העובר של קבוצת הביקורת מראה סימון GFP במכלול האבזור (pineal complex).ניכר סימון רקע נקודתי, אך לא ניתן לזהות הצטברות מקומית של פלואורסצאין מסומן. עוברים שעברו שחרור פוטו-כימי (photo uncaged) מראים הצטברות ברורה של פלואורסצאין משוחרר בחלק מהתאים המסומנים ב-GFP. אלו הם צאצאיהם של התאים שהיו יעד לפוטו-שחרור 24 שעות קודם לכן, עם שינויים קלים.ניתן להשתמש בפרוצדורה זו לסימון שושלת של כמעט כל רקמה בעובר דג הזברה לפני 48 שעות לאחר ההפריה.

lineage-labeling-zebrafish-cells-with-laser-uncagable-fluorescein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

תאים מתים נמתחים מרקמות אפיתל על ידי התכווצות מתואמת של תאים שכנים מבלי לשבש תפקוד מחסום. בהירות אופטית של דג הזברה מתפתח מספק מערכת מצוינת להמחיש שחול לחיות epithelia. כאן אנו מתארים שיטות לגרום ו שחול התמונה האפידרמיס דג הזברה הזחל ברזולוציה הסלולר.

הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

פונקציה-Spacer-ליפידים (FSL) בונה לאפשר את תכונות פני השטח של תאים חיים virions להיות שונה ללא אובדן חיוניות. השיטה דורשת מגע פשוט רק פתרון לבנות FSL עם תא / virion ושילוב משטח יציב ספונטנית מתרחשת.

FSL בונה: שיטה פשוטה שינוי Cell / Virion משטחים עם מגוון רחב של סמנים ביולוגיים מבלי להשפיע ליכולת הקיום שלהם

ההתפתחות של דג הזברה יכולה להיות אחרי על פני ימים עם מיקרוסקופיה גיליון אור כאשר עוברים מוטבעות בצינורות פולימר ברורים אופטי עם agarose ריכוז נמוך.

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

מניפולציות ממוקדות לגרימת מתח מכוון או מוות בתאים בודדים היו קשות יחסית לביצוע. כאן, מתוארת גישת אבלציה ברזולוציה של תא יחיד ללחץ סלקטיבי ולהרוג תאים בודדים בתרבית תאים ובבעלי חיים על בסיס לייזר UV קונפוקלי סטנדרטי.

מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ Confocal הקונבנציונלי UV הליזר

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

אבלציה בלייזר היא טכנולוגיה ישימה לחקר התחדשות במערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מתאר שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר לאבלציה בלייזר והדמיית זמן-לשגות של התחדשות תאים interneuromast בקו רוחבי של דגי הזברה.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון חלבונים עם תג חלבון פלואורסצנטי בזחלי דג הזברה, מערכת in vivo שפותחה לאחרונה ושונתה שימושית במיוחד להדמיית חלבונים בשפע נמוך בדג הזברה.

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

למד שיטת תיוג שושלת תאים בזברה דניו רריו באמצעות לייזר UV ופלואורסצין כלואה. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר גורל תאים ספציפיים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אימונית.

Lineage תיוג של תאים דג הזברה עם לייזר Uncagable והעמסת dextran

גלה סרטונים נוספים