Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans

ההליך מבצע הגבלה תזונתית על הצלחת הסטנדרטית באלגנטיות ים כדי לחקור את השפעתה על אריכות ימים, רבייה וחילוף חומרים. זה מושג על ידי מדידה מדויקת תחילה של ריכוז החיידקים שישמשו כמקור מזון. השלב השני של ההליך הוא לדלל כראוי את תרבית החיידקים לריכוזים מתאימים.

לאחר מכן הכינו לוחות SDR מבוססים עם חיידקים הרוגים. לבסוף הגדר ניסויי SDR עם אוכלוסיית תולעים מסונכרנת גיל. תוצאות של מדידות ייצור צאצאים ותוחלת חיים יכולות להראות עיכוב וירידה בייצור צאצאים כמו גם תוחלת חיים ממוצעת מוגברת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני 60 שיטות כמו דיאן במדיום AZA, הוא שכל הניסוי ייעשה על משחק מבוסס AGA מוצק סטנדרטי המשמש את רוב המעבדות החמות לניסויי הגבלה תזונתית ולראות אלגנטיות לקבוע עקומות כיול נפרדות לכל זן חיידקים המשמש כמקור מזון. בחר מושבה אחת של חיידקי אי קולי OP 50 מפס טרי על אגר lb וחסן שלושה מיליליטר של תרבית מרק lb נוזלית בשייקר של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הכן דילול כפול סדרתי של תרבית הלילה.

לאחר מכן מדוד את הספיגה של כל דילול ב-600 ננומטר על ידי ספקטרופוטומטר בשלוש עותקים. בהמשך כל תרחיף חיידקים, פי מיליון זרע באופן שווה 0.4 מיליליטר של תרחיף חיידקים מכל דילול על צלחת חקלאית של 100 מילימטר פאונד ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 24 שעות. ספרו את מספר מושבות החיידקים הגדלות על כל צלחת על מנת לחשב יחידות יוצרות מושבה למיליליטר עבור כל דגימה.

כעת שרטט OD 600 כפונקציה של ריכוז החיידקים ובצע ניתוח רגרסיה ליניארית כדי לקבוע את הקשר בין ערכי OD 600 שנמדדו לריכוזי חיידקים של OP 50. עבור שיטה זו, ריכוז חיידקים של 1 פעמים 10 עד 11 CFU למיליליטר משמש במצב האכלה אד לידו ואחד כפול 10 עד ה-CFU השמיני למיליליטר כתנאי ההזנה האופטימלי של DR. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בארבעה עד שישה ריכוזי חיידקים שונים כדי לבסס קשר תלוי מינון מלא.

עבור SDR ותגובותיו. הכינו חיסון עם מושבה אחת של חיידקי אי קולי OP 50 בשלושה מיליליטר מרק LB נוזלי, מתורבת בשייקר של 37 מעלות צלזיוס למשך שש עד שמונה שעות. מעבירים את תרבית ה-OP 50 לבקבוק חדש המכיל 500 מיליליטר מרק LB וגדלים בן לילה כדי שהחיידקים יגיעו לרוויה במידת הצורך.

הכן דילול מתאים של תרבית OP 50 למדידת ספיגה ב-OD 600. כדי לקבוע את ריכוז החיידקים, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב-1500 גרם למשך 20 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את החיידקים לריכוז של אחד כפול 10 מתוך ה-12 CFUs למיליליטר.

כעת, הכינו תרביות חיידקים של 10 מיליליטר בשישה ריכוזים שונים, הנעים בין אחד כפול 10 של ה-12 ל-1 כפול 10 של ה-CFU השביעי למיליליטר פיפטה. כוון שני מיליליטר של תרבית חיידקים למרכז צלחת N GM מוצקה של 60 מילימטר. הימנע מלגעת במשטח הצלחת עם קצה הפיפטה מכיוון שחריצים על פני השטח מאפשרים לתולעים להתחפר לתוך המאווררים.

מניחים את הצלחות בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן יש למרוח 10 מיקרוליטר של 100 מיליגרם למיליליטר סוין פחמני ו -10 מיקרוליטר של 50 מיליגרם למיליליטר יכול מיצין על כל צלחת לגידול מנוחה של החיידקים. אחסן צלחות עם ריכוזים שונים של חיידקים שנהרגו באנטיביוטיקה בארבע מעלות צלזיוס לשימוש עתידי עד חודש.

חשוב להכין ולאחסן מספיק צלחות, רצוי אותה אצווה לכל הצמח. ערכו ניסוי לפחות יום עד יומיים מראש כדי לוודא את כדאיות החיידקים. מגרדים כמה חיידקים מלוחות ה-SDR ומורחים אותם על צלחת N GM ריקה עם פחמן, סיין ואנטימיצין.

הניחו את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שש עד שמונה שעות ואשרו את היעדר צמיחת החיידקים. עבור רוב המחקרים הקשורים ל-SDR, כגון ניתוח תוחלת חיים ופרופיל ייצור צאצאים, הכנת אוכלוסיית תולעים מסונכרנת גיל היא חיונית. השתמש בקוטף תולעי פלטינה כדי להעביר 20 עד 30 בוגרים פעילים ברבייה על מספר צלחות NGM רגילות.

עם OP 50. בהתאם למספר הביציות הנדרשות לניסויים, ייתכן שיהיה צורך במבוגרים נוספים. השאירו את הצלחות בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות כדי לאפשר הטלת ביצים.

מוציאים את המבוגרים מהצלחת ובודקים חזותית את הצלחות לאיתור ביצים. המשיכו לדגור על הלוחות ב-20 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לצאצאים להתפתח לשלב הבוגר המאוחר של ארבעה ימים. בדרך כלל זה לוקח שלושה ימים ל-N שתי תולעים מסוג בר ב-20 מעלות צלזיוס.

לניתוח תוחלת חיים. העבירו תולעים בוגרות של 10 עד 12 יום לצלחת SDR כדי להתחיל את ההגבלה התזונתית. כדי להשיג כוח סטטיסטי מספיק, השתמש בסך הכל ב-60 עד 100 תולעים עבור כל תנאי SDR.

ציין את הכדאיות של כל תולעת כל יומיים-שלושה עד שכל התולעים מתות. חשוב לציין, העבירו את התולעים לצלחות SDR טריות כל יומיים כדי למנוע רעב. עקומת כיול זו מתווה ריכוז OP 50 ביחס ל-OD 600.

המשוואה שנוצרה על ידי ניתוח רגרסיה ליניארית יכולה לשמש לכל החישובים העתידיים של ריכוזי חיידקי OP 50. מחקר זה בודק את ההשפעה של טיפולי SDR כרוניים על תוחלת החיים הממוצעת של זני תולעים שונים בהשוואה לתגובה תלוית מינון רגילה של תולעים מסוג בר ל-SDR. השפעת תוחלת החיים של SDR מדוכאת חלקית על ידי ביטוי יתר של DR 2 בעוד שלמוטציה DAF 16 MU 86 אין השפעה על הארכת תוחלת החיים הנגרמת על ידי SDR.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את דיאן במשחק המבוסס על AGA סטנדרטי באלגנטיות ים.