Name: Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: למדו פרוטוקול להגבלת תזונה ב־Caenorhabditis elegans על צלחות מוצקות עם חיידקים מתים. שיטה זו מאפשרת לחקור השפעות על תוחלת חיים, רבייה ומטבוליזם בנמטודות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרס טייס ממרכז הלם נתן (P30 AG13283) ומענק R01 (R01 AG028516) מן המכון הלאומי להזדקנות (NIA) ל-A-LH

1. הקמת עקומת כיול עבור להערכת ריכוזי חיידקים סעיף זה מתאר שיטה להערכת ריכוז החיידקים עבור כל זן חיידקי מסוים (למשל OP50, HT115) אשר ישמשו כמקור מזון עבור ניסויים הגבלה תזונתיים ב C. elegans. עקומות כיול נפרדת יש להקים לכל זן חיידקים המשמשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של E. coli OP50 חיידקים שנקטפו פס חדש של חיידקים על אגר LB LB במרק 3 מ"ל נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> OP50 המקום והתרבות 37 ° C שייקר ולאפשר לחיידקים לגדול בין לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת סידורי 2 פי דילולים של ההשעיה חיידקים מתרבות הלילה (2x, 4x, 8x, 16x, 32x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ספיגת (צפיפות אופטית) של דילול זה ב 600 ננומטר על ידי ספקטרופוטומטר בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לדלל כל השעיה חיידקי 1,000,000 פי (1000 פי דילול פעמיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים 0.4 מ"ל של חיידקי ההשעיה של דילול באופן שווה על כל צלחת LB 100 מ"מ אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום צלחות LB עם OP50 ב 37 ° C חממה 18-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבות חיידקים גדל על כל צלחת. ספירת המושבה משמשים כדי לחשב CFU (יחידת המושבה להרכיב) לכל מ"ל עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקשר בין מדד OD 600 ערכים OP50 ריכוזי חיידקים ניתן הוקמה על ידי התוויית OD 600 כפונקציה של ריכוז חיידקי (CFU / mL) ואת ביצוע ניתוח רגרסיה ליניארית (איור 1). </li></ol> פתרונות: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> מרק לוריא (LB), 1 ליטר: </td></tr><tr><td> 10 גרם </td><td> Bacto-tryptone </td></tr><tr><td> 5 גרם </td><td> תמצית שמרים </td></tr><tr><td> 10 גרם </td><td> NaCl </td></tr></tbody></table> מוסיפים מים כדי deionized 1L. החיטוי ולאחסן בטמפרטורת החדר. 2. הכנת מוצק צלחת מבוססי (SDR) צלחות תזונתיים הגבלה סעיף זה מתאר את הכנת צלחות לשימוש מוצק צלחת מבוסס (SDR) ניסויים תזונתיים הגבלה. בדרך כלל, אנו רואים ריכוז חיידקים של 1 x 10 11 CFU / mL כתנאי כרצונך מודעה האכלה 1 x 10 8 CFU / mL כתנאי DR אופטימלי האכלה עבור שיטה זו. עם זאת, 4-6 ריכוזי חיידקים שונים ייתכן שיהיה צורך ליצור מערכת יחסים שלמה מינון תלויי עבור SDR ותגובות שלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של E. קולי OP50 חיידקים 3 מ"ל מרק נוזלי LB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תרבות OP50 ב 37 ° C שייקר ולאפשר לחיידקים לגדול במשך 6-8 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התרבות OP50 כדי בבקבוק חדש המכיל 500 מ"ל מרק LB, והמקום תרבות OP50 בחזרה 37 ° C שייקר לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600 של התרבות OP50 כדי לקבוע את ריכוז החיידקים (ריכוז מחושב באמצעות עקומת כיול שנוצר חלק 1). דילולים מתאים עשוי להיות נחוץ עבור מדידה מדויקת של ספיגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה OP50 חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 1500 גרם במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חיידקים בריכוז של 1 x 10 12 CFU / mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ"ל התרבות חיידקים בשישה ריכוזים שונים: 1 x 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10, 8 10 7 CFU / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 0.2 מ"ל של התרבות חיידקים למרכז מ"מ 60 הקרושה צלחת NGM. הימנע מנגיעה את פני השטח של צלחת עם פיפטה קצה, כמו ניקס על פני השטח מאפשרים תולעים להתחפר לתוך צלחות אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום צלחות 37 ° C החממה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 10μL של 100mg/mL carbenicillin ו 10 μL של kanamycin 50mg/mL על כל צלחת לעצור את הצמיחה של החיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות צלחות עם ריכוזים שונים של אנטיביוטיקה, הרג חיידקים על 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי (עד חודש). חשוב להכין ולאחסן צלחות מספיק הניסוי המתוכנן כולו לפחות 1-2 ימים קדימה. באמצעות אצווה זהה של הצלחות הניסויים כולו עדיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את הכדאיות של חיידקים, חיידקים לגרד כמה מתוך צלחות SDR ופרש אותה על צלחת ריקה NGM עם carbenicillin ו kanamycin. מניחים את צלחת 37 ° C בחממה במשך 6-8 שעות ולאחר מכן לבדוק צמיחה של חיידקים (אין צמיחה חיידקים יש לשים לב). </li></ol> פתרונות <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> צמיחה נמטודות מדיה (NGM), 1 ליטר: </td></tr><tr><td> 3 גרם </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 2.5 גרם </td><td> Bacto-Peptone </td></tr><tr><td> 20 גרם </td><td> אגר </td></tr></tbody></table>ove_content "&gt; החיטוי במשך 40 דקות ולתת להתקרר 65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1 מ"ל </td><td> 1 מ 4 MgSO </td></tr><tr><td> 1 מ"ל </td><td> 1 M CaCl 2 </td></tr><tr><td> 1 מ"ל </td><td> 5 מ"ג / מ"ל ​​כולסטרול </td></tr><tr><td> 25 מ"ל </td><td> אשלגן פוספט 1M, 6.0 pH </td></tr></tbody></table> מיד NGM לשפוך נוזל על 60 מ"מ x 15 מ"מ בצלחות פטרי ב 10 מ"ל aliquots 3. הגדרת ניסויים SDR עבור רוב SDR-הקשורים ללימודים, כגון ניתוח תוחלת החיים ואת פרופיל פוריות, הכנת האוכלוסייה בגיל מסונכרן של תולעים היא חיונית. עבור מחקרים אחרים, פשוט להעביר תולעים מצלחת לצלחת OP50 קבוע SDR כדי ליזום את הגבלת תזונתיים. בסעיף זה, פרוטוקול להקים ניתוח תוחלת החיים של בעלי חיים SDR מתוארת כדוגמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בורר תולעת פלטינה להעביר 20-30 מבוגרים reproductively פעיל על מספר הצלחות NGM קבוע עם OP50. בהתאם למספר הביצים הדרוש הניסויים, מבוגרים יותר עשוי להיות נחוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לאפשר ההטלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המבוגרים מן הצלחת. צלחות יש לבדוק ויזואלית את הביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס ולאפשר הצאצאים לפתח לשלב Late-L4/day 1 מבוגר. בדרך כלל זה לוקח 3 ימים תולעים N2 סוגי בר ב 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מספר מתאים של 1 מבוגרים יום לצלחת SDR כדי ליזום את הגבלת תזונתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח תוחלת החיים, להקים סך של 6-8 צלחות עם 10-20 תולעים לכל צלחת עבור כל תנאי SDR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון את הכדאיות של כל תולעת כל 2 ימים עד שכל התולעים מתו. זה קריטי, כי תולעים יועברו צלחות SDR טריים כל 12-48 שעות כדי למנוע קיפוח מוחלט של מזון. </li></ol> 4. נציג תוצאות: שמוצג באיור 1 היא מזימה של עקומת כיול עבור נציג להערכת ריכוז OP50 ביחס OD 600. המשוואה שנוצר על ידי ניתוח רגרסיה אניה יכול לשמש עבור כל החישובים העתיד של OP50 ריכוזי חיידקים. שמוצג באיור 2 הוא דוגמה assaying את ההשפעה של טיפולים SDR כרונית על תוחלת החיים הממוצעת של זנים שונים של תולעים. הקו הכחול מייצג תגובה נורמלית מינון תלויי של wild-type תולעים SDR. הקו האדום מציין כי ההשפעה של תוחלת החיים SDR מודחק חלקית על ידי drr OE-2, בעוד daf-16 (mu86) אין כל השפעה על הארכת תוחלת החיים SDR-Induced. פירוט השיטה לביצוע ניתוח תוחלת החיים ב C. elegans מתואר בספרות 1-3 הקודמת. <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. התוצאה נציג של עקומת כיול עבור להערכת ה OP50 קולי ריכוז. OP50 ריכוז זממו כפונקציה של מדד OD 600 ערכים. ברים שגיאה = התרבות חיידקים SD לילה היה מדולל 8x 1.5x, 2x, 4x, 16x, 32x לפני מדידת ספיגת ו בדילול עוד 1,000 x פעמיים לפני המדידה CFU. <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. התוצאה נציג של C. הניסוי elegans תוחלת החיים השוואת N2 סוג חיות בר (כחול) עם שתי מוטציות שונות (ירוק ואדום) בתגובה SDR (איור מתוך צ'ינג et al. 4). ברים שגיאה = SEM

<ol><li>Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aging+and+age-related+disease+by+DAF-16+and+heat-shock+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor.</a> Science. 300, 1142-1145 (2003).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lifespan+by+sensory+perception+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 402, 804-809 (1999).</li>
<li>Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((drr-2+encodes+an+eIF4H+that+acts+downstream+of+TOR+in+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Aging Cell. 9, 545-557 (2010).</li>
<li>Weindruch, R., Walford, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeindruch%2C+R+%22The+Retardation+of+Aging+and+Disease+by+Dietary+Restriction%22">The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction</a>. , Thomas. (1988).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield+history%3A+caloric+restriction%2C+slowing+aging%2C+and+extending+life%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Aging+Knowledge+Environ%22%5BJournal%5D)">Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life.</a> Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+caloric+restriction+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Overview of caloric restriction and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).</li>
<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenic+growth+up-regulates+mass-specific+metabolic+rate%2C+stress+resistance%2C+and+extends+life+span+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).</li>
<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+reduction+of+metabolic+rate+in+food+restricted+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Bishop, N. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+neurons+mediate+diet-restriction-induced+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans.</a> Nature. 447, 545-549 (2007).</li>
<li>Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHA-4%2FFoxa+mediates+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Nature. 447, 550-555 (2007).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).</li>
<li>Kaeberlein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+complete+removal+of+food%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food.</a> Aging Cell. 5, 487-494 (2006).</li>
<li>Greer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans.</a> Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הגבלה תזונתיים (DR) ידוע להגדיל את תוחלת החיים ואת לעכב את התחלתה של מחלות הקשורות לגיל שונים במגוון רחב של מינים, כולל יונקים 5-7. מניפולציות הן סביבתיים וגנטיים שימשו מודל DR ב C. elegans, כולל תולעים culturing במדיום למחצה מוגדרים נוזל 8,9, דילול של מקור מזון חיידקים במדיום נוזלי 10-12, ושימוש מוטנטים התנהגות להאכיל בקצב איטי יותר 13. עם זאת, מחקה הגנטי של DR עשויה לייצר פנוטיפים שאינן קשורות ל DR, ואילו תולעים culturing בתוו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Duchefa Biochemie </td><td> C0109.25 </td><td> מומס במים. </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> רוש </td><td> 10106801001 </td><td> מומס במים. </td></tr><tr><td> Bacto-peptone </td><td> בקטון, דיקינסון החברה </td><td> DF0118072 </td><td></td></tr><tr><td> Bacto-tryptone </td><td> בקטון, דיקינסון החברה </td><td> DF0123075 </td><td></td></tr><tr><td> Bacto-תמצית שמרים </td><td> בקטון, דיקינסון החברה </td><td> DF0127071 </td><td></td></tr><tr><td> אגר </td><td> בקטון, דיקינסון החברה </td><td> DF00145170 </td><td></td></tr><tr><td> תרבות סטרילי צינור </td><td> ארה&quot;ב מדעי </td><td> 1485-0810 </td><td></td></tr><tr><td> ספקטרופוטומטר </td><td> Amersham Biosciences </td><td> ג&#39;ין קוואנט הפרו </td><td> Amersham הוא כעת חלק GE Healthcare. </td></tr><tr><td> הביתור מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> STEMI 2000 </td><td></td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Beckman Coulter </td><td> Accuspin FR </td><td></td></tr></tbody></table>

solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב caenorhabditis elegans</em

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

הפחתת צריכת המזון ללא רעב או תת תזונה ידוע להגדיל את תוחלת החיים ואת לעכב את התחלתה של מחלות הקשורות לגיל שונים במגוון רחב של מינים, כולל יונקים. זה גם גורם לירידה במשקל הגוף, פוריות, כמו גם רמות נמוכות של גלוקוז בדם, אינסולין, IGF-1 אצל בעלי חיים אלה. טיפול זה המכונה לעתים קרובות מגבלה תזונתיים (DR) או הגבלה קלורית (CR). Caenorhabditis elegans נמטודות התפתחה אורגניזם מודל חשוב עבור מחקר על הביולוגיה של ההזדקנות. מניפולציות הן סביבתיים וגנטיים שימשו מודל DR ו הראו כדי להאריך את תוחלת החיים ב C. elegans. עם זאת, רבים דיווחו DR מחקרים ב C. elegans נעשו על ידי הפצת חיות בתקשורת נוזלי, בעוד רוב המחקרים הגנטיים בתחום הזדקנות נעשו על אגר מוצק רגיל צלחות פטרי. כאן אנו מציגים פרוטוקול DR באמצעות תקן NGM אגר מוצק מבוססי צלחת עם חיידקים נהרג.

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הגבלה מוצק צלחת מבוססי תזונתיים<em&gt; ג elegans</em&gt; עם חיידקים נהרג.

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

ידוע כי הפחתת צריכת מזון ללא תת-תזונה או הרעבה מאריכה את תוחלת החיים ומעכבת את הופעתן של מחלות שונות הקשורות לגיל במגוון...

הפרוצדורה מבצעת הגבלה תזונתית על מצע סטנדרטי ב-sea elegance כדי לבחון את השפעתה על אריכות ימים, רבייה ומטבוליזם. הדבר משיג תחילה על ידי מדידה מדויקת של ריכוז החיידקים שישמשו כמקור מזון. השלב השני של הפרוצדורה הוא דילול נאות של תרבית החיידקים לריכוזים מתאימים.לאחר מכן, הכין מצעי SDR מבוססי ג'ל עם חיידקים שהורגו. לבסוף, הקם ניסויי SDR עם אוכלוסיית תולעים בעלת גיל מסונכרן. תוצאות של מדידות ייצור צאצאים ואורך חיים עשויות להראות ייצור צאצאים מושהה ומופחת, וכן עלייה בממוצע תוחלת החיים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות כגון Dian במצע AZA, הוא שכל הניסוי יבוצע על מצע AGA מוצק סטנדרטי המשמש במעבדות רבות. עבור ניסויי הגבלה תזונתית, קבעו עקומות כיול נפרדות עבור כל זן חיידקים המשמש כמקור מזון. בחרו מושבה בודדת של חיידקי e coli OP 50 ממריחה טרייה על lb agar והחדירו אותה לשלושה מיליליטר של תרבית נוזלית lb broth במנער בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה.לאחר מכן, מדדו את הבליעה של כל דילול באורך גל של 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר, בשלוש חזרות. דללו שוב כל תרחיף חיידקים פי מיליון, והזרקו באופן שווה 0.4 מיליליטר של תרחיף חיידקים מכל דילול על צלחת LB-agri בקוטר 100 מילימטר, והדגירו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 24 שעות. ספרו את מספר מושבות החיידקים שגדלו בכל צלחת על מנת לחשב את מספר היחידות יוצרות מושבות (CFU) למיליליטר עבור כל דגימה.כעת שרטטו את ה-OD 600 כפונקציה של ריכוז החיידקים ובצעו ניתוח רגרסיה ליניארית כדי לבסס את הקשר בין ערכי ה-OD 600 שנמדדו לבין ריכוזי חיידקי OP 50. בשיטה זו, נעשה שימוש בריכוז חיידקים של 1×10¹¹ CFUs למילליטר בתנאי הזנה ad lido וב-1×10⁸ CFU למילליטר כתנאי הזנה אופטימלי של DR. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בארבעה עד שישה ריכוזי חיידקים שונים כדי לבסס קשר מלא התלוי במינון.עבור SDR ותגובותיו. הכין תמים עם מושבה בודדת של חיידקי e coli OP 50 בשלושה מיליליטר של מצע LB נוזלי, שגודלו בקוצצץ בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך שש עד שמונה שעות. העבר את תרבית ה-OP 50 לבקראך חדש המכיל 500 מיליליטר של מצע LB וגודל למשך הלילה כדי שהחיידקים יגיעו לרוויה, במידת הצורך.הכינו דילול מתאים של תרבית ה-OP 50 למדידת בליעה ב-OD 600. כדי לקבוע את ריכוז החיידקים, השקיעו את החיידקים על ידי סנטריפוגציה ב-1500 Gs למשך 20 דקות. הסירו את העליון (supernatant) ותלו את החיידקים מחדש לריכוז של 1 × 10¹² CFUs למילליטר.כעת, הכינו תרביות חיידקים של 10 מיליליטר בשש ריכוזים שונים, הנעים בין 1 × 10⁷ CFU למיליליטר ועד 1 × 10¹² CFU למיליליטר בעזרת פיפטה. טפטפו 0.2 מיליליטר של תרבית החיידקים למרכז פלטת N GM מוצקה בקוטר 60 מילימטר. הימנעו ממגע של חוד הפיפטה עם פני השטח של הפלטה, שכן חריצים על פני השטח מאפשרים לתולעים לחדור לתוך האגראות.הנח את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסף לכל צלחת 10 µL של carbonic soin בריכוז 100 mg/mL ו-10 µL של can mycin בריכוז 50 mg/mL כדי לעצור את צמיחת החיידקים. אחסן את הצלחות עם ריכוזים שונים של אנטיביוטיקה שהרגו את החיידקים בטמפרטורה של 4 °C לשימוש עתידי למשך עד חודש אחד.חשוב להכין ולאחסן מספיק צלחות, רצוי מאותה סדרה עבור הצמח כולו. בצעו ניסוי לפחות יום אחד עד יומיים מראש כדי לוודא את חיוניות החיידקים. גרדו מעט חיידקים מתוך צלחות ה-SDR ופזרו אותם על צלחת N GM ריקה עם carbonic, sein ו-antimycin.הניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שש עד שמונה שעות ואשרו את היעדרם של צמיחת חיידקים. עבור רוב המחקרים הקשורים ל-SDR, כגון ניתוח תוחלת חיים ואפיון ייצור צאצאים, הכנת אוכלוסיית תולעים מסונכרנת גיל היא חיונית. השתמשו בבחור תולעים מפלטינה כדי להעביר 20 עד 30 בוגרים פעילים רבייתית למספר צלחות NGM רגילות.עם OP 50. בהתאם למספר הביצים הדרושות לניסויים, ייתכן שיהיה צורך במספר רב יותר של בוגרים. השאירו את הצלחות הפטריות בטמפרטורה של 20 °C למשך ארבע שעות כדי לאפשר הנחת ביצים.הסיר את הבוגרים מהצלחת ובצע בדיקה ויזואלית של הצלחות כדי לאתר ביצים. המשך לדגור את הצלחות בטמפרטורה של 20 °C כדי לאפשר לצאצאים להתפתח לשלב L4 מאוחר או ליום הראשון של שלב הבגרות. בדרך כלל תהליך זה אורך שלושה ימים עבור תולעי N2 מסוג wild type בטמפרטורה של 20 °C.לניתוח תוחלת חיים. העבירו 10 עד 12 תולעים בוגרות בנות יום אחד לצלחת SDR כדי להתחיל את ההגבלה התזונתית. כדי להשיג עוצמה סטטיסטית מספיקה, השתמשו בסך כולל של 60 עד 100 תולעים עבור כל תנאי SDR.דרג את החיוניות של כל תולעת מדי יומיים עד שלושה ימים עד שכל התולעים ימותו. חשוב להעביר את התולעים למצעי SDR טריים מדי יומיים כדי למנוע הרעבה. עקום כיול זה מציג את ריכוז ה-OP 50 ביחס ל-OD 600.ניתן להשתמש במשוואה שהופקה מניתוח רגרסיה ליניארית עבור כל החישובים העתידיים של ריכוזי חיידקי OP 50. מחקר זה בוחן את ההשפעה של טיפולי SDR כרוניים על תוחלת החיים הממוצעת של זני תולעת שונים, בהשוואה לתגובה תלויית-מינון רגילה של תולעי סוג פרא (wild type) ל-SDR. ההשפעה של SDR על תוחלת החיים מדוכאת חלקית על ידי ביטוי יתר של DR two, בעוד שלמוטציה DAF 16 MU 86 אין השפעה על הארכת תוחלת החיים המושרה על ידי SDR.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלולים להבנה טובה של אופן ביצוע Dian במשחק סטנדרטי המבוסס על AGA ב-sea elegance.

solid-plate-based-dietary-restriction-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Elegan &lt;em&gt; Caenorhabditis &lt;/ em&gt; הוא מודל שימושי כדי לחקור את הפונקציות של חומצות שומן רב בלתי רוויות בפיתוח ופיזיולוגיה. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להשלמת ג &lt;em&gt; elegans &lt;/ em&gt; דיאטה עם חומצות שומן רב בלתי רוויות.

תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה בעוברי elegans Caenorhabditis. בעוד כמה פרוטוקולים מתארים כיצד חלוקת תאי תמונה בעובר המוקדם, פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה מתפתחת במהלך embryogenesis אמצע סוף.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

כאן, אנו מציגים assay Caenorhabditis elegans- Specific שנועד להעריך שינויים התנהגות הנטייה נחושת ואת היכולת לאתר מקור מזון משותף, כמו האורגניזם מתקדמת ממצב תזונה רעב עד כדי רעב.

א<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion

כאן, אנו מציגים מסגרת להתייחס הגבלות תזונתיות מגוון רחב ביטוי גנים ואת תוחלת החיים. אנו מתארים פרוטוקולים עבור הגבלות תזונתיות מגוון רחב, הדמיה כמותית של ביטוי גנים תחת הפרדיגמה הזו. אנחנו עוד חלוקה לרמות ניתוחים חישובית לחשוף שבבסיס תכונות עיבוד המידע של מעגלים גנטי מעורב חישה מזון.

כימות של מידע מקודד על ידי גנים ביטוי רמות במהלך תוחלת החיים אפנון תחת הגבלת תזונה מגוון רחב C . elegans

פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר חלבונים גרעיניים התקה תחת עומס חום באמצעות של זריחה ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון כסמן ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. דאפי מכתים פרוטוקול מהיר ושומר את האותות לוקליזציה subcellular GFP וחלבון.

גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר שיטה לגידול בקנה מידה גדול Caenorhabditis elegans במדיה מוצק. כחלופה תרבית נוזלית, פרוטוקול זה מאפשר קבלת הפרמטרים של סולמות שונים המעובדים המבוסס על צלחת. פעולה זו מגדילה את comparability של תוצאות על-ידי השמטת את ההבדלים מטבולית מורפולוגיים בין תרבות המדיה נוזלי ומוצק.

מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת

ירידה פרוטאוסטלית היא סימן היכר של הזדקנות, להקל על תחילת מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד באופן כנותב פרוטאוסטזיס בשתי רקמות אלגנים שונים Caenorhabditis באמצעות ביטוי הטרולוגי של פוליגלוטמין חוזר התמזג לכתב פלואורסצנטי. מודל זה מאפשר ניתוח גנטי מהיר של פרוטאוסטזיס.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

הפרוטוקול הבא מתאר את הפיתוח והאופטימיזציה של זרימת עבודה בתפוקה גבוהה עבור גידול תולעים, הדמיה פלואורסצנטית ועיבוד תמונה אוטומטי כדי לכמת אגרגטים של פוליגלוטמין כהערכה של שינויים בפרוטאוסטזיס.

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

זוהי שיטה נפוצה עבור דיסקציה של גונאד C. elegans ואחריה סדק הקפאה, אשר מייצרת דגימות germline עבור immunofluorescence באמצעות צביעת נוגדנים, או עבור צביעת DAPI פשוטה כדי לדמיין DNA. פרוטוקול זה זכה להצלחה עבור סטודנטים לתואר ראשון במעבדת מחקר ובהתנסות מחקרית לתואר ראשון מבוססת קורסים.

ג. אלגנס גונד דיסקציה והקפאת סדק לאימונופלואורסצנציה וצביעת DAPI

פרוטוקול זה מתאר בדיקה לכימות קצב ההזנה של Caenorhabditis elegans בהתבסס על מדידת פינוי החיידקים בתרבית נוזלית.

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

למדו פרוטוקול להגבלת תזונה ב־Caenorhabditis elegans על צלחות מוצקות עם חיידקים מתים. שיטה זו מאפשרת לחקור השפעות על תוחלת חיים, רבייה ומטבוליזם בנמטודות.

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans

גלה סרטונים נוספים