Name: זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: למדו לזהות תחמוצת חנקן וסופרוקסיד בתאים באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה אלקטרונית פאראמגנטית ומלכודות ספין. השיטה מאפשרת זיהוי מדויק של מיני חמצון בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי המוסד הלאומי לבריאות הלב, ריאות ודם המכון מענק RO1 HL81248.

1. התרבות של תאים אבי העורקים שור אנדותל (BAEC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טכניקות אספטיים ראויים היו במעקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב בינוני אמבטיה, מים חמים ללא אנטיביוטיקה ב 37 ° C. </li></ol> הערה: בינוני מורכב בינוני פנול חינם שונה Dulbecco של הנשרים (DMEM) עם 4.5 גלוקוז-D גר '/ ל', 4 מ"מ L-גלוטמין, 1% לא חיוניות חומצות אמינו, בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו - 2.5 מ"ג / ל 'צמיחה האנדותל גורם. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את T75 תאים בקבוק שהכיל מן החממה ולנקות את פני השטח של הבקבוק עם אתנול 70% לפני הצבתו בתוך מכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום הישן באמצעות aspirator ולשטוף פעמיים עם 5 מ"ל של חיץ פוספט Dulbecco של מי מלח (DPBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ"ל של טריפסין ולחכות 4-5 דקות עבור תאים לנתק תוך מעת לעת לבדוק תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ"ל של מדיום שוב ושוב מערבבים בעזרת פיפטה כדי לא נפרדהוא התאים וליצור אפילו השעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 מ"ל של מדיום עם טריפסין לצינור 15 מ"ל ו - 121 גרם צנטריפוגות ב 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant באמצעות aspirator. הוסף 5 מ"ל של DPBS ומערבבים היטב. סרכזת ב 121g במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate supernatant מחדש להשעות את התא גלולה ידי הוספת 6 מ"ל של המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על צלחת 6-היטב, להוסיף 1 מ"ל של תרחיף תאים זה טוב ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של המדיום. מערבבים את ההשעיה באמצעות פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתייג את הצלחת דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 2 א. זיהוי של NO עם תא BAEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טכניקות אספטיים ראויים היו במעקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת 6-היטב החממה ואת לשאוב מבאר בינוני 1. שוטפים את התאים פעמיים עם 1 DPBS מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 210 של 1.9 mM heptahydrate ברזל סולפט (ב) (4 FeSO 0.7 H 2 O, להכין טרי על ידי המסת 0.8 מ"ג1 DPBS מ"ל עם CaCl 2 ו MgCl 2) ו 210 μl של N-methyl-D-glucamine אמוניום dithiocarbamate (MGD, להכין טרי על ידי המסת 2.7 מ"ג ב -500 DPBS μl עם CaCl 2 ו MgCl 2) באמצעות יחס של 1:07 . (הערה:. זה היחס שבו MGD עודף משמש הועסק כמקובל להכנת Fe 2 +-MGD מורכבת בשל העובדה כי התשואה עבור Fe 3 +-MGD מוגדל בנוכחות MGD עודף תוספת של ascorbate בפתרון לייצב את Fe 2 +-MGD אין צורך מאז 3 NO-Fe +-MGD נוצר מצטמצם endogenously כדי להבחין EPR NO-Fe 2 +-MGD ידי ascorbate, הידרוקינון, או ציסטאין עם יעילות המרה של עד ל 99.9% .. ספין נמוך diamagnetic מדינת Fe 2 + מאפשר איתור של NO באמצעות תאים שטוח או צינור נימי ללא צורך במכשיר בטמפרטורה נמוכה) 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת ההשעיה וכתוצאה מכך גם ולהוסיף 4.6 μאני ionophore של סידן (Cai) (מוכן מפתרון מלאי של mM 1.9 ידי המסת 1 מ"ג 1 מ"ל DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון מערבולת שוב דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 36 דקות על מנת להמשיך לאפשר הפחתה של NO-Fe 3 +-MGD כדי להבחין EPR NO-Fe 2 +-MGD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant (425 μl) בצינור Eppendorf והעברת לתא EPR שטוח (או צינור נימי 50 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרים EPR הרכישה הם: תדר מיקרוגל: 9.8 GHz, מרכז המגרש: 3427 G, אפנון אמפליטודה: 6.0 G, רוחב סריקה: 100 גרם; רווח מקלט: 1 x 10 5: כוח מיקרוגל: 10 mW, המספר הכולל של סריקות: 121; זמן סריקה: 10 שניות, וזמן קבוע: 20 ms (הערה: מאז פרמטרים משתנים ממכשיר אחד למשנהו תנאי הניסוי, אם כן, רק את מרכז המגרש, תדירות אפנון משרעת הם הפרמטרים החשובים ביותר שיש להביא בחשבון.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את ספקטרום בטמפרטורת החדר ספקטרה 2-D היו integדורג להפחית את רעשי הרקע ואת הבסיס לתקן באמצעות Bruker WinEPR תוכנת עיבוד נתונים או תוכנה אחר לעיבוד נתונים. על כימות של היווצרות adduct, מגרשים סטנדרטיים של ריכוז העוצמה מול אות (או אזור) ניתן לבנות באמצעות SNAP NO התורם. </li></ol> 2B. אינס ניסוי שיחררה את סוגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת 6-היטב החממה ואת לשאוב מבאר בינוני 2 ולשטוף פעמיים עם 1 DPBS מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התורם peroxynitrite, 5-אמינו-3-(4-morpholinyl) -1,2,3-oxadiazolium כלוריד (SIN-1) שימש ניתקת אינס 16. הוסף 100 μl של 0.5 מ"מ Sin-1 (M-R 206.6 g / mol, מפתרון 10 mM המניות מוכן טרי על ידי המסת 1 מ"ג SIN-1 ב 500 μl של PBS עם יוני אין CA / מ"ג) כדי לדלל 2 מ"ל עם DPBS ו 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת מן החממה ולשטוף פעמיים עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 210 של2.8 מ"מ FeSO 4 0.7 H 2 O ו - μl 210 מ"מ 19.6 MGD מוכן טרי על פי הנוהל הנ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון לערבל ומוסיפים 4.6 μl של צאי mM 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון מערבולת שוב דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 36 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant (425 μl) בצינור Eppendorf והעברת לתא שטוח EPR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרים EPR הרכישה הם: תדר מיקרוגל: 9.8 GHz, מרכז המגרש: 3427 G, אפנון משרעת: 6 G, רוחב סריקה: 100 גרם; רווח מקלט: 1 x 10 5: כוח מיקרוגל: 10 mW, המספר הכולל של סריקות: 121; זמן סריקה: 10 שניות, וזמן קבוע: ms 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את ספקטרום ו ספקטרה 2-D שולבו כדי להפחית את רעשי הרקע ואת הבסיס לתקן כאמור לעיל. </li></ol> 3. זיהוי של O 2 • - מ נויטרופילים Polymorphonuclear (PMNs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נויטרופילים בודדו דגימת דם האדם כפי שתואר קודם לכן 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את פתרון מלאי של 1 M DMPO * ב PBS המכיל 0.1 מ"מ diethylenetriamine-pentaacetic חומצה (DTPA). DMPO יש נקודת התכה של 25-29 מעלות צלזיוס כל כך נוח יותר פיפטה DMPO נוזלי (~ 1.02 גרם / מ"ל צפיפות של 25 מעלות צלזיוס) כדי בקבוקון זכוכית (הערה: אין להשתמש צלוחיות פלסטיק במשקל מאז DMPO טהור מגיב עם פלסטיק). קפוא DMPO ניתן נמס על ידי מים זורמים פושר על הבקבוקון (הערה: לא להפעיל את המים החמים כמו DMPO עלול להתפרק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב להשתמש טוהר DMPO גבוהה (&gt; 99%) מאז כמה מלכודות ספין זמינים מסחרית מכילים זיהומים פאראמגנטיים, ועל כן, חובה להפעיל מגוון EPR של פתרון פשוט DMPO בלבד (10 מ"מ במקרה זה). זה קריטי, כי אין אות הרקע ניכר (ראה איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות (1 מ"ג / מ"ל) של phorbol-12-myristate אצטט-13 (PMA) ב DMSO. הפוך את aliquots ידי דילול הפתרון מיקרוגרם 10 / מ"ל ​​ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 1.5 מ"ל צינור Eppendorf, להכין את הפתרון עם נפח כולל של 0.6 מ"ל על ידי ביצוע רצף בנוסף: ~~~HEAD=NNS 10 6 תאים לכל מ"ל של PMN, D-גלוקוז (1 מ"ג / מ"ל) ואלבומין (1 מ"ג / מ"ל), 10 DMPO mM ו 0.2 מיקרוגרם / מ"ל של PMA. (הערה: PMA הוא activator הרדיקלי יש להוסיף אחרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון לתא שטוח EPR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EPR רכישה תנאי פרמטרים: תדר מיקרוגל: 9.8 GHz, מרכז המגרש: 3486 G, אפנון אמפליטודה: 0.5 G, רוחב סריקה: 100 גרם; רווח מקלט: 5 X 10 5, המספר הכולל של סריקות: 10, זמן סריקה: 30 שניות ; כוח מיקרוגל: 20 mW, וזמן קבוע: ms 81. על כימות של היווצרות adduct, מגרשים סטנדרטיים של ריכוז העוצמה מול אות (או אזור) ניתן לבנות באמצעות nitroxides יציבים כגון קצב או 3-carboxylic חומצה PROXYL. </li></ol> * הערה חשובה על השימוש DMPO: באמצעות תא שטוחה, ניתן להגדיל את צפיפות התאים ועל ידי כך להגדיל את האותעוצמת adduct ספין אבל מחצית חיים של O 2 • - adduct של DMPO קצר (t 1/2 ~ 1 דק '), אשר מתפרק כדי DMPO-OH. DMPO ניתן להחליף באמצעות ריכוזים של אותו EMPO, BMPO או DEPMPO אשר זמינים מסחרית ליציבות adduct מוגברת עם T 1/2 ~ 8 ו - 14 דקות, בהתאמה. 4. נציג תוצאות ספין לכידה של NO הרדיקלי בוצעה באמצעות Fe 2 +-MGD. איור 2a ו-2b להראות שום סימן EPR מ Fe 2 +-MGD או תערובת של Fe 2 +-MGD עם קאי, המציין כי אין אות NO רקע מקורו ריאגנטים אלה. BAEC על גירוי עם צאי משחרר NO אשר מגיב עם Fe 2 +-MGD ליצירת adduct ספין, NO-Fe 2 +-MGD, ומראה אות שלישיה אופיינית עם פיצול הערך hyperfine (hfsc) קבוע של 12.66 = N ו - G G-גורם של G = 2.040. (איור 2 ג). HFערך SC נקבע באמצעות תוכנת סימולציה WINSIM שניתן להורדה באתר NIEHS EPR מסד נתונים תוכנה. Hfsc הניסוי עולה בקנה אחד עם הערך בספרות של N = 12.70 G ו-G = 2.041 18 עבור NO-Fe 2 +-MGD adduct. כמו כן, ההשפעה של SIN-1 על BAEC הוריד את ייצור NO בשל אינס קשירה והתרה כפי שמוצג באיור 2 ד. מלכודת DMPO ספין שימש O 2 • - זיהוי. DMPO לבד לא נתן אות כפי שמוצג באיור 3 א המאשרת כי במלכודת הספין הוא ללא זיהומים פאראמגנטיים. איור 3 ב הוא הספקטרום של DMPO ו PMNs בלבד, כמו כן, אין כל סימן לזיהוי המצביע על כך DMPO אינו גורם הפעלת האנזים NADPH אוקסידאז. איור 3 ג מראה את האות EPR שנצפה על ידי גירוי של PMN PMA. הערכים hfsc לאות זה נקבעו להיות N = 14.71 G, A &amp;בטא;-H = 11.40 G ​​ו-H γ = 1.25 G, עולים בקנה אחד עם ערכי הספרות של N = 14.3 G, β-H = 11.7 G ו-H γ = 1.3 גרם 19 עבור DMPO-O 2 H adduct. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תרשים זרימה לצורך זיהוי של רדיקלים של נויטרופילים BAEC באמצעות השמנה ספין EPR. (א) PMNs היו מעורבים עם DMPO ו PMA, ואת התערובת וכתוצאה מכך הועבר לתא שטוח EPR לרכישת נתונים. (ב) BAEC גדלו על צלחת, ושטפה עם DPBS. מלכודת ספין פה (MGD) 2 נוספה יחד עם קאי. הפתרון היה מעורב באופן יסודי מודגרות. תערובת הועבר לתא שטוח EPR לרכישת נתונים EPR. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור EPR זיהוי של NO מ-BAEC. (א) ספקטרום של Fe 2 +-MGD רק (ב) ספקטרום של Fe 2 + +-MGD צאי בלבד. (ג) קשת שלישיה כתוצאה השמנה NO על ידי Fe 2 +-MGD באמצעות צאי, גירוי התאים. (ד) ספקטרום מראה ירידה בייצור NO בשל 0.5 מ"מ SIN-1 טיפול של תאים. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> 3. איור EPR זיהוי של DMPO-O 2 H מ נויטרופילים הופעלו. (א) ספקטרום של DMPO 10 מ"מ בלבד. (ב) ספקטרום של PMN לבד בנוכחות DMPO 10 מ"מ. (ג) ספקטרום של PMN מופעל על ידי PMA בנוכחות DMPO 10 מ"מ.

<ol><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconciling+the+chemistry+and+biology+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol+chemistry+and+specificity+in+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Thiol chemistry and specificity in redox signaling.</a> Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Oxygen%2C+Gene+Expression%2C+and+Cellular+Function%22">Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function</a>. Clerch, L. B., Massaro, D. J. , (1997).</li>
<li>Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants%3A+Molecules%2C+medicines%2C+and+myths%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Antioxidants: Molecules, medicines, and myths.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).</li>
<li>Sumimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+regulation+and+evolution+of+Nox-family+NADPH+oxidases+that+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species.</a> FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).</li>
<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIgnarro%2C+LJ+%22Editor+Nitric+Oxide%3A+Biology+and+Pathobiology%22">Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (2009).</li>
<li>Moreau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+alkyl-+and+arylguanidines+on+the+stability+and+reactivity+of+inducible+NOS+heme-dioxygen+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes.</a> Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).</li>
<li>Vasquez-Vivar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+generation+by+endothelial+nitric+oxide+synthase%3A+the+influence+of+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).</li>
<li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+by+EPR+spin+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping.</a> Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).</li>
<li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping+of+superoxide+and+hydroxyl+radical%3A+practical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects.</a> Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).</li>
<li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+%28DEPMPO%29%3A+a+new+phosphorylated+nitrone+for+the+efficient+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Soc.%2C+Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).</li>
<li>Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3%2C4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide%3A+Evaluation+of+the+spin+trapping+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide: Evaluation of the spin trapping properties.</a> Free Radical. Biol. Med. 28, 403-408 (2000).</li>
<li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+radical+trapping+and+spin+adduct+decay+of+5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+%28BocMPO%29%3A+kinetics+and+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Soc.%2C+Perkin+Trans%22%5BJournal%5D)">Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis.</a> J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).</li>
<li>Tsuchiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide-forming+reactions+of+the+water-soluble+nitric+oxide+spin-trapping+agent%2C+MGD%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD.</a> Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).</li>
<li>Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+iron-dithiocarbamates+ensure+detection+of+nitric+oxide+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues.</a> Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).</li>
<li>RojasWahl, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decomposition+mechanism+of+3-N-morpholinosydnonimine+%28SIN-1%29%3A+A+density+functional+study+on+intrinsic+structures+and+reactivities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Model%22%5BJournal%5D)">Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities.</a> J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).</li>
<li>Klempner, M. S., Gallin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+functional+characterization+of+human+neutrophil+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations.</a> Blood. 51, 659-669 (1978).</li>
<li>Pou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping+of+nitric+oxide+by+ferro-chelates%3A+kinetic+and+in+vivo+pharmacokinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).</li>
<li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping.+Kinetics+of+the+reaction+of+superoxide+and+hydroxyl+radicals+with+nitrones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones.</a> J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).</li>
<li>Britigan, B. E., Rosen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin-trapping+and+human+neutrophils.+Limits+of+detection+of+hydroxyl+radical%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical.</a> J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).</li>
<li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-%28Diethoxyphosphoryl%29-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide%3A+A+new+efficient+phosphorylated+nitrone+for+the+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).</li>
<li>Snyrychova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+sensitivity+of+EPR+spin+trapping+in+biological+systems+by+cyclodextrins%3A+A+model+study+with+thylakoids+and+photosystem+II+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles.</a> Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).</li>
<li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+beta-cyclodextrin+cyclic-nitrone+conjugate%3A+Synthesis+and+spin+trapping+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies.</a> J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).</li>
<li>Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+spin+trapping+properties+by+beta-cyclodextrin-cyclic+nitrone+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate.</a> J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).</li>
<li>Hardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+characterization%2C+and+decay+kinetics+of+ROS+and+thiyl+adducts+of+mito-DEPMPO+spin+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap.</a> Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).</li>
<li>Kim, S. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+reactivity+of+a+cyclic+nitrone-calix%5B4%5Dpyrrole+conjugate+with+superoxide+radical+anion%3A+Theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

השמנה EPR ספין כבר המועסקים במגוון רחב של יישומים ביו לכימות וזיהוי רדיקלים חופשיים. השמנה ספין הוא רגיש במיוחד, מסוגל לאתר רדיקלים בריכוזים הנעים בין ננומטר ל מיקרומטר ובכך מתאים ליישום במערכות ביולוגיות. היווצרות adduct פאראמגנטיים, NO-Fe 2 +-MGD, הוא הבסיס של זיהוי באמצעות NO EPR. Fe 2 +-MGD מגיב עם מס &#39;18 במהירות בשיעור של 10 ~ 6 מ -1 s -1. NO-Fe 2 +-MGD adduct יש זמן מחצית החיים הוא stab...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (לא חובה) </td></tr><tr><td> פנול בינוני ללא DMEM גלוקוז גבוה 1X </td><td> GIBCO </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין-EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP379-100 </td><td></td></tr><tr><td> ממ ללא חומצות האמינו החיוניות </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> אטלנטה ביולוגיות </td><td> S11550 </td><td></td></tr><tr><td> צמיחה האנדותל גורם </td><td> Millipore </td><td> 02-102 </td><td></td></tr><tr><td> צאי </td><td> אנזו מדעי החיים </td><td> A-23187 </td><td> להמיס DMSO </td></tr><tr><td> SIN-1 </td><td> אנזו מדעי החיים </td><td> BML-CN245-0020 </td><td></td></tr><tr><td> DMPO </td><td> Dojindo מעבדות </td><td> D048-10 </td><td></td></tr><tr><td> FeSO 4 0.7 H 2 O </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 215422-250 גרם </td><td> להמיס PBS עם Ca ו Mg </td></tr><tr><td> MGD </td><td> אנזו מדעי החיים </td><td> ALX-400-014-M050 </td><td> להמיס PBS עם Ca 2 + ו - Mg 2 + </td></tr><tr><td> BAEC תאים </td><td> מערכות תא </td><td> 2B2-C75 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP231-100 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS עם CaCl 2 ו MgCl 2 </td><td> סיגמאldrich </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> Phorbol-myristate אצטט (PMA) </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 79346-במינון של 1 </td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

חנקן מגיב / מינים חמצן (ROS / RNS) בריכוזים נמוכים יש תפקיד חשוב בוויסות תפקוד התא, איתות, ואת התגובה החיסונית, אך בריכוזים לא מוסדרים ופוגעים כדאיות התא 1, 2. בעוד מערכות החיים התפתחו עם מנגנוני ההגנה אנדוגני נוגדי חמצון תזונתיים להסדרת ROS דור, ROS מיוצרים ללא הרף טבעי תוצרי לוואי של חילוף החומרים הנורמלי של חמצן יכול לגרום נזק חמצוני ביומולקולות וכתוצאה מכך אובדן תפקוד החלבון, מחשוף ה-DNA, או שומנים בדם peroxidation 3, ובסופו של דבר סטרס חמצוני שמוביל לפציעה או מוות התא 4. אניון קיצוני superoxide (O 2 • -) הוא המבשר העיקרי של כמה מינים ביותר ביותר חמצון הידועים קיימות במערכות ביולוגיות כגון peroxynitrite ו הידרוקסיל הרדיקלי. דור של O 2 • - מסמל הסימן הראשון של פרץ חמצוני, ולכן, אניTS ו איתור / או התפיסה במערכות ביולוגיות חשוב. בהפגנה זו, O 2 • - נוצר מ נויטרופילים polymorphonuclear (PMNs). באמצעות גירוי chemotactic עם phorbol-12-myristate אצטט-13 (PMA), PMN מייצר O 2 • - באמצעות הפעלת nicotinamide אדנין מונואמין פוספט (NADPH) dinucleotide 5. תחמוצת החנקן (NO) synthase אשר מגיע בשלושה isoforms, כמו מושרה-, עצבי ו-האנדותל-NOS, או אינוס, nNOS או אינס, בהתאמה, מזרז את ההמרה של L-ארגינין ל L-Citrulline, באמצעות NADPH לייצר NO 6 . הנה, אנחנו שנוצר NO מתאי אנדותל. בתנאי סטרס חמצוני, אינס למשל יכול לעבור מייצור אין O 2 • - בתהליך הנקרא שיחררה את סוגר, אשר ככל הנראה נגרם על ידי חמצון של heme 7 או שיתוף גורם, tetrahydrobiopterin (BH 4) 8. יש רק מעטיםשיטות אמינות לגילוי של רדיקלים חופשיים במערכות ביולוגיות, אלא מוגבלים על ידי סגוליות ורגישות. השמנה ספין משמש בדרך כלל לצורך זיהוי של רדיקלים חופשיים כרוך התגובה תוספת של קיצוני במלכודת הספין ויוצרים adduct ספין מתמשך, אשר ניתן לאתרם באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה אלקטרונים (EPR) פאראמגנטיים. את adducts קיצוניים שונים מציגים מגוון ייחודי אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות את הרדיקלים הנוצרים והוא יכול לספק מידע רב על הטבע ועל קינטיקה של ייצור רדיקלי 9. Nitrones את מוט ההיגוי, 5,5-דימתיל-pyrroline-N-אוקסיד, DMPO 10, DEPMPO phosphoryl-להחליף 11, אסתר, להחליף, EMPO 12 ו BMPO 13, היה בשימוש זמן רב כמו מלכודות ספין - הספין האחרון מלכודות להציג עוד מחצית חיים של O 2 • - adduct. ברזל (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD) 2 &lt;/&gt; תת הוא נפוץ ללכוד NO בשל שיעור גבוה של היווצרות adduct ויציבות גבוהה של adduct ספין 14.

פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה (EPR) ספקטרוסקופיה הועסק לזהות תחמוצת החנקן מתאי אנדותל העורקים שור ו אניון קיצוני superoxide של נויטרופילים האדם באמצעות ברזל (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD)<sub&gt; 2</sub&gt; ו - 5,5-דימתיל-1-pyroroline-N-אוקסיד, DMPO, בהתאמה.

מיני חנקן וחמצן רהאיביים (ROS/RNS) בריכוזים נמוכים ממלאים תפקיד חשוב בבקרת תפקודי תא, באיתות ובתגובה חיסונית, אך ב...

אני פרדריק דינה, פרופסור חבר לפרמקולוגיה כאן באוניברסיטת אוהיו סטייט. בהדגמה זו, נראה את הגילוי של חנקן חמצני (nitric oxide) וסופראוקסיד מתאים באמצעות EPR ושיטת לכידת ספין (Spin Trapping).מיני חמצן וחנקן רהאיביים מעורבים בפיתוחן של מחלות שונות, ולכן גילוים במערכות ביולוגיות הוא בעל חשיבות עליונה. רק מספר קטן של שיטות אמינות לגילוי מינים רהאיביים יושמו במערכות ביולוגיות, אך הן מוגבלות מבחינת ספציפיות ורגישות. עם זאת, שיטת ה-Spin trapping נפוצה לזיהוי של ROS והיא כוללת תגובת הוספה של רדיקל למלכודת ספין ניטרו או לקומפלקסים של מתכת היוצרים תוצר ספין יציב, שניתן לזהותו באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה פאראמגנטית אלקטרונית או EPR; תוצרי ההוספה הרדיקליים השונים מראים ספקטרום ייחודי שבו ניתן להשתמש כדי לזהות את הרדיקלים הנוצרים, והוא יכול לספק מידע רב על טבען ועל קינטיקת הייצור של הרדיקלים.האנזים Nitric oxide Syntase מקטליז את המרת L-arginine ל-L citruline באמצעות N-A-D-P-H כדי לייצר nitric oxide. בתנאים של עקה חמצונית, ENA יכול לעבור מייצור של nitric oxide לייצור של superoxide בתהליך הנקרא uncoupling, אשר נחשב כנגרם מחמצון של heme או של ה-cough factor המעכב את ה-nitric oxide. ויסות של nitric oxide במערכות ביולוגיות הוא חשוב, שכן הוא ממלא תפקיד קריטי באיתות תאי המוביל לתפקודי פיזיולוגיים מועילים כגון vaso dilation, אך ייצור יתר שלו קשור לעיתים קרובות למצבים דלקתיים. לכן, גילוי של nitric oxide במערכות ביולוגיות הוא בעל חשיבות.סוג חשוב נוסף של מולקולות איתות במערכות ביולוגיות הן מיני חמצן רב-פעילים כגון חנקן חמצני; מיני חמצן רב-פעילים בריכוזים נמוכים ממלאים תפקיד חשוב בוויסות תפקודי התא, באיתות ובמענה חיסוני, אך בריכוזים שאינם מווסתים הם עלולים להוביל לנזק חמצוני תאי הגורם לעקה חמצונית. האניון הרדיקלי של superoxide הוא אחד ממיני החמצן הרב-פעילים החשובים ביותר והוא המקדים העיקרי לכמה מהמינים בעלי יכולת החמצון הגבוהה ביותר הידועים במערכות ביולוגיות, כגון superoxide nitrite ורדיקל ההידרוקסיל. לכן, גילוי ו/או סקווסטרציה של superoxide במערכת ביולוגית הם חשובים, שכן היווצרותו מסמנת את הסימן הראשון להתפרצות חמצונית לפני תחילתה.פרוטוקול זה מתאר את תהליך הטרייפסינציה של תאי אנדותל מאורטה של בקר שגודלו בתרבית, כפי שמתואר בהליך הכתוב. העבירו את התאים לפלטת שש בארות מסומנת והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 לאחר ההדגרה.הוצא את הפלטה בעלת שש הבארות מהאינקובטור ושאב את המדיום מהבאר הראשונה. שטוף את התאים פעמיים עם 1 mL של תמיסת DPBS. הכן תמיסת ברזל סולפט heptahydrate בריכוז 1.9 mM על ידי הוספה של 0.8 mg ברזל סולפט ל-1 mL של DPBS עם calcium chloride ו-magnesium chloride.יש להכין תמיסת MGD על ידי הוספת 2.7 milligrams של ammonium MGD ל-500 microliters של DPBS עם calcium chloride ו-Magnesium chloride. יש להוסיף 210 microliters של 1.9 millimolar iron sulfate hep dehydrate שהוכן טרי, ו-210 microliters של MGD שהוכן טרי ביחס מולרי של אחד לשבעה, ולערבב את התסמין שהתקבל. יש להוסיף 4.6 Microliters של calcium ion four ולערבב שוב את התמיסה באמצעות שאיבה והזרקה חוזרת עם פיפט.לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך 36 דקות. אספו את supernatant ששקע לתוך מבחנה מסוג Eppendorf. הזינו את פרמטרי הרכישה של ה-EPR: שדה מרכזי של 3427 gauss, אמפליטודת מודולציה של 6 gauss ותדר של 9.8 GHz.מכיוון שהפרמטרים ישתנו ממכשיר אחד וממצב ניסויי אחד למשנהם, אנא עיינו בטקסט עבור פרמטרים אחרים שנעשה בהם שימוש בציוד זה. העבירו את הנוזל העליון לתא EPR שטוח, אטמו באמצעות פראפין והניחו בחלל ה-EPR. רשמו את הספקטרה למשך כ-21 דקות ב-121 סריקות ו-10.4 שניות לסריקה לאחר הרצת הניסוי.השתמש בתוכנת העיבוד brucker WIN EPR לתיקון קו הבסיס (baseline) ולאינטגרציה של ספקטרא ה-2D, דבר המפחית את רעשי הרקע. יש לציין כי זמן הסריקה ומספר הסריקות עשויים להשתנות מניסוי אחד למשנהו. כמו כן, השיטות לתיקון קו הבסיס עשויות להשתנות בין תוכנה אחת לשנייה.כדי להתחיל בביטול הצימוד של Enos, הסר את המצע מהבאר השנייה מתוך פלטת שש הבארות ושטוף את התאים פעמיים עם 1 Milliliter DPBS. לאחר מכן, הוסף 100 microliters של תמיסת Syn one 0.5 millimolar שהוכנה, והשלם את הנפח לשני milliliters עם DPBS המכיל 10%FBS. דגור את התאים למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5%CO2. לאחר הדגירה.שטפו את התאים עם DPBS פעמיים. לאחר מכן, הוסיפו 210 µL של ברזל סולפט הפטהידרט בריכוז 2.8 mM שהוכן טרי, ו-210 µL של MGD בריכוז 19.6 mM שהוכן טרי בהתאם לפרוטוקול הקודם. לאחר מכן, הוסיפו 4.6 µL של יוני סידן בריכוז 1.9 mM, וערבבו את התמיסה שוב.כמו קודם לכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 36 דקות. לאחר 36 דקות, אספו את העלייה (supernatant) ששוקעה בתוך מבחנה מסוג Eppendorf והעבירו אותה לתא שטוח של EPR. רשמו את ספקטרומי ה-EPR באמצעות אותם פרמטרי רכישה כפי שבוצעו קודם לכן לאחר הרכישה.עבד את הנתונים באותו אופן לפני תחילת פרוטוקול זה. הכן תמיסת מלאי של DMPO בריכוז one molar ותמיסת PBS המכילה 0.1 millimolar DTPA. לאחר מכן, הכן תמיסה בריכוז one milligram per milliliter של four by 12.הכינו אליקוטים של 1 ml מתמיסת המלאי של PMA (Myristate 13 acetate ב-DMSO) על ידי דילולו לריכוז של 10 µg/ml ב-PBS בתוך מבחנה מסוג Eppendorf המכילה 1 mg/ml D-glucose ו-1 mg/ml Albumin. הכינו תרחיף של 5 עד 6 מיליון תאי PMN למל באמצעות פיפוט מעלה ומטה במבחנת Eppendorf של 1.5 ml. הכינו תערובת בנפח סופי של 60 µl המכילה כ-1.6 × 10⁶ תאי PMN, 10 mM DMPO ו-0.2 µg/ml של PMA.בניסוי זה, נשתמש בספקטרומטר Bruker ESP 300 X band. העבירו את התמיסה לתא EPR שטוח, ולאחר מכן הניחו את התא השטוח בחלל ה-EPR. הזינו את פרמטרי הרכישה של ה-EPR: שדה מרכזי של 3, 486 goss, אמפליטודת מודולציה של 0.5 goss, ותדר של 9.8 gigahertz.מכיוון שהפרמטרים משתנים ממכשיר למכשיר וממצב ניסויי אחד למשנהו, אנא עיינו בטקסט עבור שאר הפרמטרים ששימשו בניסוי זה לרכישת ספקטרום. בהדגמה זו, אנו מראים את הזיהוי של חנקן חמצני (nitric oxide) ורדיקלי סופר-אוקסיד באמצעות שתי מלכודות ספין שונות: iron MGD ו-DNPO.אנו מראים כי גרייה של תאי אנדותל באמצעות calcium ion four מייצרת nitric oxide, וטיפול עם seen one, תורם perine nitrite, יכול להפחית את ייצור ה-nitric oxide; עם זאת, גרייה של נויטרופילים באמצעות PMA בנוכחות nitro spin trap מניבה hydroxyl radical ADDA במקום S oxide, וזאת בשל חוסר היציבות של ה-superoxide adda שנוצר בתחילה. בעוד שמנגנוני ה-spin trapping על ידי iron mg d nitros הם באופן בסיסי זהים, הוספת nitric oxide ל-iron MGD כרוכה ב-pass rate of reaction, וצורת ה-iron MGD nitric oxide add היא יציבה מאוד.למעשה, ניתן להקפיא את התמיסה בטמפרטורה של 80°C- לצורך רכישת ספקטרום EPR מאוחרת יותר, ללא ירידה משמעותית בעוצמת אות ה-EPR שלו. מאידך, גילוי של oxide באמצעות מלכודת הספין nitro הוא איטי. דבר זה מחייב ריכוזים גבוהים יותר של מלכודת הספין בהשוואה למקבילה שלה, iron MGD, לצורך גילוי nitric oxide.נעשה שימוש במספר גישות כדי לזהות בהצלחה את צורת התוצר של הסופראוקסיד, אותן לא הדגמנו יותר בסרטון זה. שימוש בתא שטוח, למשל, עשוי להניב עוצמת אות גבוהה יותר של תוצר הסופראוקסיד הודות לצפיפות תאים גבוהה יותר. אני ממליץ לעיין בטקסט בנושא זה.בנוסף, במקום להשתמש ב-DMPO, ניתן להשתמש במלכודת ספין מאושרת כגון BMPO ו-VMP או ב-Nitro DAP MPO מפוספור, אשר עשויים להניב תוצרי תוספת של פראוקסיד SU עמידים יותר. השימוש בציקלודקסטרין הועסכן אף הוא כדי לייצב את תוצרי תוספת פראוקסיד SU בעת שימוש במלכודות ספין לזיהוי US. מומלץ מאוד לבצע רכישה מיידית של ספקטרום ה-EP לאחר יצירת סופראוקסיד SU.לפיכך, גילוי של nitric oxide באמצעות iron MGD הוא יעיל הרבה יותר, והאתגר המרכזי העומד כעת בפני לכידת ספין של superoxide באמצעות PR הוא השגת המאפיינים שנצפו ביצירת iron MGD nitric oxide addoch. כלומר, ריאקטיביות מהירה ל-superoxide ויצירת add יציבים; מאמצים לפיתוח מלכודות ספין בעלות ריאקטיביות מהירה ל-superoxide ויצירה של spin יציב ADD מבוצעים כעת במעבדה שלנו ועל ידי קבוצות אחרות אף הן.

detection-nitric-oxide-superoxide-radical-anion-electron-paramagnetic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה הדמיה תלת ממדי מיקרון בקנה מידה של ריכוז החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים במיקרוסקופ על ידי ספין האלקטרון תהודה.

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן

ספין השמנה ספקטרוסקופיה שקיעת דם שימש ללמוד את ההשפעה של נוגדי החמצון ליקופן צמח, פיקנוגנול ותמצית זרעי ענבים על הדחה גז שלב הרדיקלים החופשיים בעשן הסיגריות.

פרוטוקול לאיתור גז הדחה בשלב רדיקלים חופשיים עשן סיגריות רגילה

ייצור אנדוגני של תחמוצת החנקן (NO) מסדיר מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים. מתברר יותר ויותר כי שיבוש או dysregulation של איתות NO מבוסס מעורב מחלות אנושיות רבות. שיטות לכמת רלוונטי מטבוליטים אינו רשאי לספק סמנים ביולוגיים מנבא אבחון או הרומן של מחלות אנושיות.

טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן

במאמר זה נתאר שיטה קלה מותאמת יחסית באמצעות צבע פלואורסצנטי diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2da) ו dihydroethidium (DHE) לגילוי סימולטני אן-פאס וויזואליזציה של תחמוצת חנקן תאית (NO) אניון סופראוקסיד (O 2 .- ) בהתאמה, טרי מבודד aortas השלם של מודל עכבר להשמנה.

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

תהודה מגנטית אלקטרונית חדשה (EPR) שיטה, מהירה סריקה EPR (RS-EPR), מודגם הדמיה מרחבית רפאים 2D אשר עדיפה על גל מתמשך המסורתית (CW) טכניקה ופותח מקומות חדשים בתחום ההדמיה vivo. תוצאות הם הפגינו ב 250 MHz, אבל הטכניקה ישימה בתדירות כלשהי.

ראפיד סריקת אלקטרונים פאראמגנטיים תהודה פותחת אפיקים חדשים עבור פרמטרים חשובים מבחינת פיזיולוגית ההדמיה<em&gt; In vivo</em

ספקטרוסקופיית פאראמגנטיים תהודה (EPR) היא שיטה ברורה וחד משמעית למדוד בחינם רדיקלים. השימוש של הגששים ספין סלקטיבי מאפשר זיהוי של רדיקלים חופשיים בתאים הסלולר שונה. אנו מציגים שיטה מעשית ויעילה, לאסוף דגימות ביולוגיות המסייעים בטיפול, אחסון של העברת דגימות EPR מעבדתיים.

השימוש אלקטרון תהודה פאראמגנטיים בדגימות ביולוגיות-טמפרטורת הסביבה ו- 77 K

פרוטוקול זה מתאר את ההתקנה של bioreactor NMR כדי לשמור על תאים אנושיים אנקפסולציה קיימא עבור עד 72 שעות, ואחריו זמן נפתר בתוך התא NMR נתונים וניתוח. המתודולוגיה מוחלת כדי לפקח על אינטראקציות חלבון-ליגנד תאיות בזמן אמת.

ניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד בתאים אנושיים על ידי NMR כמותי בזמן אמת בתוך התא באמצעות Bioreactor צפיפות תאים גבוהה

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לאיתור תחמוצת החנקן ונגזרותיה הרלוונטיות מבחינה ביולוגית באמצעות מבחנים מבוססי כימילומינסנציה בעלי רגישות גבוהה.

מבחנים מבוססי כימילומינסנציה לזיהוי תחמוצת החנקן ונגזרותיה מאוטוקידציה ותרכובות ניטרוסטיות

כאן, אנו מציעים פרוטוקול שיטתי, נגיש, לשחזור כדי לזהות מינים חמצן תגובתי תאית (ROS) באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate בדיקה (DCFH-DA) בתאי גליה מולר (MGCs). שיטה זו מכמתת את סך רמות ה- ROS התאיות עם ציטומטר זרימה. פרוטוקול זה קל מאוד לשימוש, מתאים וניתן לשחזור.

כימות של מינים חמצן תגובתי באמצעות 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate בדיקה וזרימה-Cytometry בתאי גליה מולר

הדור של אניון סופראוקסיד חיוני לגירוי טסיות הדם, ואם אינו מוסדר, קריטי למחלות טרומבוטיות. כאן, אנו מציגים שלושה פרוטוקולים לזיהוי סלקטיבי של אניונים סופראוקסידים ולחקר ויסות טסיות תלוי חיזור.

שיטות חלופיות לאיתור ייצור אניון סופראוקסיד בטסיות הדם 

למדו לזהות תחמוצת חנקן וסופרוקסיד בתאים באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה אלקטרונית פאראמגנטית ומלכודות ספין. השיטה מאפשרת זיהוי מדויק של מיני חמצון בתאים חיים.

זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

גלה סרטונים נוספים