זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

אני פרדריק דינה, פרופסור חבר לפרמקולוגיה כאן באוניברסיטת אוהיו סטייט. בהדגמה זו, נראה את הגילוי של חנקן חמצני (nitric oxide) וסופראוקסיד מתאים באמצעות EPR ושיטת לכידת ספין (Spin Trapping).

מיני חמצן וחנקן רהאיביים מעורבים בפיתוחן של מחלות שונות, ולכן גילוים במערכות ביולוגיות הוא בעל חשיבות עליונה. רק מספר קטן של שיטות אמינות לגילוי מינים רהאיביים יושמו במערכות ביולוגיות, אך הן מוגבלות מבחינת ספציפיות ורגישות. עם זאת, שיטת ה-Spin trapping נפוצה לזיהוי של ROS והיא כוללת תגובת הוספה של רדיקל למלכודת ספין ניטרו או לקומפלקסים של מתכת היוצרים תוצר ספין יציב, שניתן לזהותו באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה פאראמגנטית אלקטרונית או EPR; תוצרי ההוספה הרדיקליים השונים מראים ספקטרום ייחודי שבו ניתן להשתמש כדי לזהות את הרדיקלים הנוצרים, והוא יכול לספק מידע רב על טבען ועל קינטיקת הייצור של הרדיקלים.

האנזים Nitric oxide Syntase מקטליז את המרת L-arginine ל-L citruline באמצעות N-A-D-P-H כדי לייצר nitric oxide. בתנאים של עקה חמצונית, ENA יכול לעבור מייצור של nitric oxide לייצור של superoxide בתהליך הנקרא uncoupling, אשר נחשב כנגרם מחמצון של heme או של ה-cough factor המעכב את ה-nitric oxide. ויסות של nitric oxide במערכות ביולוגיות הוא חשוב, שכן הוא ממלא תפקיד קריטי באיתות תאי המוביל לתפקודי פיזיולוגיים מועילים כגון vaso dilation, אך ייצור יתר שלו קשור לעיתים קרובות למצבים דלקתיים. לכן, גילוי של nitric oxide במערכות ביולוגיות הוא בעל חשיבות.

סוג חשוב נוסף של מולקולות איתות במערכות ביולוגיות הן מיני חמצן רב-פעילים כגון חנקן חמצני; מיני חמצן רב-פעילים בריכוזים נמוכים ממלאים תפקיד חשוב בוויסות תפקודי התא, באיתות ובמענה חיסוני, אך בריכוזים שאינם מווסתים הם עלולים להוביל לנזק חמצוני תאי הגורם לעקה חמצונית. האניון הרדיקלי של superoxide הוא אחד ממיני החמצן הרב-פעילים החשובים ביותר והוא המקדים העיקרי לכמה מהמינים בעלי יכולת החמצון הגבוהה ביותר הידועים במערכות ביולוגיות, כגון superoxide nitrite ורדיקל ההידרוקסיל. לכן, גילוי ו/או סקווסטרציה של superoxide במערכת ביולוגית הם חשובים, שכן היווצרותו מסמנת את הסימן הראשון להתפרצות חמצונית לפני תחילתה.

פרוטוקול זה מתאר את תהליך הטרייפסינציה של תאי אנדותל מאורטה של בקר שגודלו בתרבית, כפי שמתואר בהליך הכתוב. העבירו את התאים לפלטת שש בארות מסומנת והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 לאחר ההדגרה.

הוצא את הפלטה בעלת שש הבארות מהאינקובטור ושאב את המדיום מהבאר הראשונה. שטוף את התאים פעמיים עם 1 mL של תמיסת DPBS. הכן תמיסת ברזל סולפט heptahydrate בריכוז 1.9 mM על ידי הוספה של 0.8 mg ברזל סולפט ל-1 mL של DPBS עם calcium chloride ו-magnesium chloride.

יש להכין תמיסת MGD על ידי הוספת 2.7 milligrams של ammonium MGD ל-500 microliters של DPBS עם calcium chloride ו-Magnesium chloride. יש להוסיף 210 microliters של 1.9 millimolar iron sulfate hep dehydrate שהוכן טרי, ו-210 microliters של MGD שהוכן טרי ביחס מולרי של אחד לשבעה, ולערבב את התסמין שהתקבל. יש להוסיף 4.6 Microliters של calcium ion four ולערבב שוב את התמיסה באמצעות שאיבה והזרקה חוזרת עם פיפט.

לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך 36 דקות. אספו את supernatant ששקע לתוך מבחנה מסוג Eppendorf. הזינו את פרמטרי הרכישה של ה-EPR: שדה מרכזי של 3427 gauss, אמפליטודת מודולציה של 6 gauss ותדר של 9.8 GHz.

מכיוון שהפרמטרים ישתנו ממכשיר אחד וממצב ניסויי אחד למשנהם, אנא עיינו בטקסט עבור פרמטרים אחרים שנעשה בהם שימוש בציוד זה. העבירו את הנוזל העליון לתא EPR שטוח, אטמו באמצעות פראפין והניחו בחלל ה-EPR. רשמו את הספקטרה למשך כ-21 דקות ב-121 סריקות ו-10.4 שניות לסריקה לאחר הרצת הניסוי.

השתמש בתוכנת העיבוד brucker WIN EPR לתיקון קו הבסיס (baseline) ולאינטגרציה של ספקטרא ה-2D, דבר המפחית את רעשי הרקע. יש לציין כי זמן הסריקה ומספר הסריקות עשויים להשתנות מניסוי אחד למשנהו. כמו כן, השיטות לתיקון קו הבסיס עשויות להשתנות בין תוכנה אחת לשנייה.

כדי להתחיל בביטול הצימוד של Enos, הסר את המצע מהבאר השנייה מתוך פלטת שש הבארות ושטוף את התאים פעמיים עם 1 Milliliter DPBS. לאחר מכן, הוסף 100 microliters של תמיסת Syn one 0.5 millimolar שהוכנה, והשלם את הנפח לשני milliliters עם DPBS המכיל 10%FBS. דגור את התאים למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5%CO2. לאחר הדגירה.

שטפו את התאים עם DPBS פעמיים. לאחר מכן, הוסיפו 210 µL של ברזל סולפט הפטהידרט בריכוז 2.8 mM שהוכן טרי, ו-210 µL של MGD בריכוז 19.6 mM שהוכן טרי בהתאם לפרוטוקול הקודם. לאחר מכן, הוסיפו 4.6 µL של יוני סידן בריכוז 1.9 mM, וערבבו את התמיסה שוב.

כמו קודם לכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 36 דקות. לאחר 36 דקות, אספו את העלייה (supernatant) ששוקעה בתוך מבחנה מסוג Eppendorf והעבירו אותה לתא שטוח של EPR. רשמו את ספקטרומי ה-EPR באמצעות אותם פרמטרי רכישה כפי שבוצעו קודם לכן לאחר הרכישה.

עבד את הנתונים באותו אופן לפני תחילת פרוטוקול זה. הכן תמיסת מלאי של DMPO בריכוז one molar ותמיסת PBS המכילה 0.1 millimolar DTPA. לאחר מכן, הכן תמיסה בריכוז one milligram per milliliter של four by 12.

הכינו אליקוטים של 1 ml מתמיסת המלאי של PMA (Myristate 13 acetate ב-DMSO) על ידי דילולו לריכוז של 10 µg/ml ב-PBS בתוך מבחנה מסוג Eppendorf המכילה 1 mg/ml D-glucose ו-1 mg/ml Albumin. הכינו תרחיף של 5 עד 6 מיליון תאי PMN למל באמצעות פיפוט מעלה ומטה במבחנת Eppendorf של 1.5 ml. הכינו תערובת בנפח סופי של 60 µl המכילה כ-1.6 × 10⁶ תאי PMN, 10 mM DMPO ו-0.2 µg/ml של PMA.

בניסוי זה, נשתמש בספקטרומטר Bruker ESP 300 X band. העבירו את התמיסה לתא EPR שטוח, ולאחר מכן הניחו את התא השטוח בחלל ה-EPR. הזינו את פרמטרי הרכישה של ה-EPR: שדה מרכזי של 3, 486 goss, אמפליטודת מודולציה של 0.5 goss, ותדר של 9.8 gigahertz.

מכיוון שהפרמטרים משתנים ממכשיר למכשיר וממצב ניסויי אחד למשנהו, אנא עיינו בטקסט עבור שאר הפרמטרים ששימשו בניסוי זה לרכישת ספקטרום. בהדגמה זו, אנו מראים את הזיהוי של חנקן חמצני (nitric oxide) ורדיקלי סופר-אוקסיד באמצעות שתי מלכודות ספין שונות: iron MGD ו-DNPO.

אנו מראים כי גרייה של תאי אנדותל באמצעות calcium ion four מייצרת nitric oxide, וטיפול עם seen one, תורם perine nitrite, יכול להפחית את ייצור ה-nitric oxide; עם זאת, גרייה של נויטרופילים באמצעות PMA בנוכחות nitro spin trap מניבה hydroxyl radical ADDA במקום S oxide, וזאת בשל חוסר היציבות של ה-superoxide adda שנוצר בתחילה. בעוד שמנגנוני ה-spin trapping על ידי iron mg d nitros הם באופן בסיסי זהים, הוספת nitric oxide ל-iron MGD כרוכה ב-pass rate of reaction, וצורת ה-iron MGD nitric oxide add היא יציבה מאוד.

למעשה, ניתן להקפיא את התמיסה בטמפרטורה של 80°C- לצורך רכישת ספקטרום EPR מאוחרת יותר, ללא ירידה משמעותית בעוצמת אות ה-EPR שלו. מאידך, גילוי של oxide באמצעות מלכודת הספין nitro הוא איטי. דבר זה מחייב ריכוזים גבוהים יותר של מלכודת הספין בהשוואה למקבילה שלה, iron MGD, לצורך גילוי nitric oxide.

נעשה שימוש במספר גישות כדי לזהות בהצלחה את צורת התוצר של הסופראוקסיד, אותן לא הדגמנו יותר בסרטון זה. שימוש בתא שטוח, למשל, עשוי להניב עוצמת אות גבוהה יותר של תוצר הסופראוקסיד הודות לצפיפות תאים גבוהה יותר. אני ממליץ לעיין בטקסט בנושא זה.

בנוסף, במקום להשתמש ב-DMPO, ניתן להשתמש במלכודת ספין מאושרת כגון BMPO ו-VMP או ב-Nitro DAP MPO מפוספור, אשר עשויים להניב תוצרי תוספת של פראוקסיד SU עמידים יותר. השימוש בציקלודקסטרין הועסכן אף הוא כדי לייצב את תוצרי תוספת פראוקסיד SU בעת שימוש במלכודות ספין לזיהוי US. מומלץ מאוד לבצע רכישה מיידית של ספקטרום ה-EP לאחר יצירת סופראוקסיד SU.

לפיכך, גילוי של nitric oxide באמצעות iron MGD הוא יעיל הרבה יותר, והאתגר המרכזי העומד כעת בפני לכידת ספין של superoxide באמצעות PR הוא השגת המאפיינים שנצפו ביצירת iron MGD nitric oxide addoch. כלומר, ריאקטיביות מהירה ל-superoxide ויצירת add יציבים; מאמצים לפיתוח מלכודות ספין בעלות ריאקטיביות מהירה ל-superoxide ויצירה של spin יציב ADD מבוצעים כעת במעבדה שלנו ועל ידי קבוצות אחרות אף הן.