זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

אני פרדריק דינה, פרופסור חבר לפרמקולוגיה כאן באוניברסיטת אוהיו סטייט. בהדגמה זו, נראה כיצד לזהות חנקן חמצני (nitric oxide) וסופראוקסיד מתאים תוך שימוש ב-EPR Spin Trapping.

מיני חמצן וחנקן ריאקטיביים מעורבים בפיתוחן של מחלות שונות, ולפיכך גילוים במערכות ביולוגיות הוא בעל חשיבות עליונה. רק מספר מצומצם של שיטות אמינות לגילוי מינים ריאקטיביים יושמו במערכות ביולוגיות, אך הן מוגבלות מבחינת ספציפיות ורגישות. עם זאת, שיטת Spin trapping משמשת נפוצות לזיהוי של ROS וכרוכה בתגובת הוספה של רדיקל למלכודת ספין ניטרוגנית או לקומפלקסים של מתכת היוצרים תוצר ספין יציב, שניתן לזהותו באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה פראמגנטית של אלקטרונים או EPR. תוצרי ההוספה הרדיקליים השונים מציגים ספקטרום ייחודי שניתן להשתמש בו כדי לזהות את הרדיקלים הנוצרים, והוא יכול לספק שפע של מידע על טבעה וקינטיקה של ייצור הרדיקלים.

הנזים Nitric oxide Syntase מקטליז את המרת L-arginine ל-L citruline תוך שימוש ב-N-A-D-P-H כדי להפיק nitric oxide. בתנאי עקה חמצונית, ה-NOS יכול לעבור מייצור של nitric oxide לייצור של superoxide בתהליך הנקרא uncoupling, אשר נחשב כנגרם מחמצון של heme או של cofactor המעכב את ה-nitric oxide. ויסות של nitric oxide במערכות ביולוגיות הוא חשוב, כיוון שהוא ממלא תפקיד קריטי באיתות תאי, המביא לתפקודי פיזיולוגיים מועילים כגון vaso dilation, אך ייצור יתר שלו קשור לעיתים קרובות למצבים דלקתיים. לפיכך, זיהוי של nitric oxide במערכות ביולוגיות הוא בעל חשיבות.

סוג חשוב נוסף של מולקולות איתות במערכות ביולוגיות הן מיני חמצן רהאיביליים (reactive oxygen species), כגון חמצן nitric oxide; מיני חמצן רהאיביליים בריכוזים נמוכים ממלאים תפקיד חשוב בויסות תפקודי התא, באיתות ובתגובה החיסונית, אך בריכוזים שאינם מווסתים הם עלולים להוביל לנזק חמצוני תאי הגורם לעקה חמצונית (oxidative stress). superoxide radical anion הוא אחד ממיני החמצן הרהאיביליים החשובים ביותר, והוא מהווה את הקדם העיקרי לכמה מהמינים בעלי הפוטנציאל החמצוני הגבוה ביותר known to exist במערכות ביולוגיות, כגון superoxide nitrite ו-hydroxy rod. לכן, גילוי ו/או ספיחה של superoxide במערכת ביולוגית הם בעלי חשיבות, שכן יצירתו מהווה את הסימן הראשון לפריצה חמצונית (oxidative burst) לפני תחילתה.

פרוטוקול זה מתאר את תהליך הטיפסין של תאי אנדותל של העורק האורטי של בקר שגודלו בתרבית, כפי שמתואר בנוהל הכתוב. העבירו את התאים לפלטה בעלת שישה בארות מסומנת, והדגרירו למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 לאחר ההדגירה.

הוצא את פלטת שש הבארות מהמדגרה ושאב את המצע מהבאר הראשונה. שטוף את התאים פעמיים עם 1 mL של תמיסת סלקית פוספטית (DPBS). הכן תמיסת ברזל(II) סולפט heptahydrate בריכוז 1.9 mM על ידי הוספה של 0.8 mg של ברזל(II) סולפט ל-1 mL של DPBS עם סידן כלורי ומגנזיום כלורי.

יש להכין תמיסת MGD על ידי הוספת 2.7 milligrams של ammonium MGD ל-500 microliters של DPBS עם calcium chloride ו-Magnesium chloride. יש להוסיף 210 microliters של iron sulfate hep dehydrate בריכוז 1.9 millimolar שהוכן טרי, ו-210 microliters של MGD שהוכן טרי, תוך שימוש ביחס מולרי של אחד לשבעה, ולערבב את התרחיף המתקבל. יש להוסיף 4.6 Microliters של calcium ion four ולערבב שוב את התמיסה באמצעות שאיבה והזרקה חוזרת עם פיפט.

לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך 36 דקות. אספו את העלייה (supernatant) ששוקעת לתוך מבחנה מסוג Eppendorf. הזינו את פרמטרי הרכישה של ה-EPR: שדה מרכזי של 3427 gauss, מודולציה באמפליטודה של 6 gauss ותדר של 9.8 GHz.

מכיוון שהפרמטרים ישתנו ממכשיר אחד ומסביבת ניסוי אחת לאחרים, אנא עיינו בטקסט עבור פרמטרים נוספים ששימשו בציוד זה. העבירו את הנוזל העליון (supernatant) לתא EPR שטוח, אטמו אותו בפרפין והניחו אותו בחלל ה-EPR. הקליטו את הספקטרה למשך כ-21 דקות ב-121 סריקות ו-10.4 שניות לסריקה לאחר הרצת הניסוי.

השתמש בתוכנת עיבוד brucker WIN EPR כדי לתקן את קו הבסיס (baseline) ולבצע אינטגרציה לספקטרה הדו-ממדית, פעולה המפחיתה את רעש הרקע. יש לציין שזמן הסריקה ומספר הסריקות עשויים להשתנות מניסוי אחד למשנהו. כמו כן, השיטות לתיקון קו הבסיס עשויות להשתנות בין תוכנה לתוכנה.

כדי להתחיל את הניתוק של Enos, הסר את המצע מהבאר השנייה מתוך פלטת שש הבארות ושטוף את התאים פעמיים עם 1 mL של DPBS. לאחר מכן, הוסף 100 µL של תמיסת Syn one 0.5 mM שהוכנה, והשלם את הנפח לשני מיליליטרים עם DPBS המכיל 10% FBS. הדגר את התאים למשך שעתיים ב-37 °C ו-5% CO2 לאחר ההדגרה.

שטפו את התאים עם DPBS פעמיים. לאחר מכן, הוסיפו 210 µL של ברזל סולפייט הפטא-הידרט בריכוז 2.8 mM שהוכן טרי, ו-210 µL של MGD בריכוז 19.6 mM שהוכן טרי לפי הפרוטוקול הקודם. לאחר מכן, הוסיפו 4.6 µL של יוני סידן בריכוז 1.9 mM, וערבבו את התמיסה שוב.

כמו קודם לכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 36 דקות. לאחר 36 דקות, אספו את העלייה (supernatant) ששקעה בתוך מבחנת Eppendorf והעבירו אותה לתא EPR שטוח. רשמו את ספקטרום ה-EPR תוך שימוש באותם פרמטרי רכישה כפי שבוצעו קודם לכן לאחר הרכישה.

עבדו את הנתונים באופן דומה לפני תחילת פרוטוקול זה. הכינו תמיסת מלאי של DMPO בריכוז של one molar ו-PBS המכיל DTPA בריכוז של 0.1 millimolar. לאחר מכן, הכינו תמיסת four by 12 בריכוז של one milligram per milliliter.

הכינו מנות של 1 מיליליטר של תמיסת מלאי PMA (Myra State 13 acetate ב-DMSO) על ידי דילולו לריכוז של 10 µg/mL ב-PBS בתוך פ使用了פרו-טיוב (Eppendorf tube) המכיל 1 mg/mL D-glucose ו-1 mg/mL albumin. הכינו תמיסה של 5 עד 6 מיליוני תאי PMN למיליליטר על ידי פיפוט למעלה ולמטה בתוך פרו-טיוב של 1.5 מיליליטר. הכינו תערובת בנפח סופי של 60 µL המכילה כ-1.6 × 10⁶ תאי PMN, 10 mM DMPO ו-0.2 µg/mL של PMA.

בניסוי זה, נשתמש בספקטרומטר Bruker ESP 300 X band. העבירו את התמיסה לתא EPR שטוח (flat cell), ולאחר מכן הניחו את התא השטוח בחלל ה-EPR (cavity). הזינו את פרמטרי הרכישה של ה-EPR: שדה מרכזי של 3, 486 goss, אמפליטודת מודולציה של 0.5 goss, ותדירות של 9.8 gigahertz.

מכיוון שהפרמטרים ישתנו ממכשיר למכשיר וממצב ניסיוני אחד לאחר, אנא עיינו בטקסט עבור שאר הפרמטרים ששימשו בניסוי זה לרכישת ספקטרום. בהדגמה זו, אנו מראים את הגילוי של תחמוצת החנקן ורדיקלי סופר-אكسיד באמצעות שני מלכודות ספין שונות: iron MGD ו-DNPO.

אנו מראים כי גרייה של תאי אנדותל באמצעות calcium ion four מייצרת nitric oxide, וטיפול עם seen one, תורם perine nitrite, יכול להפחית את ייצור ה-nitric oxide. עם זאת, גרייה של נויטרופילים באמצעות PMA בנוכחות nitro spin trap מניבה hydroxyl radical ADDA במקום S oxide, וזאת בשל חוסר היציבות של ה-superoxide adda שנוצר בתחילה. בעוד שמכניזמי ה-spin trapping על ידי iron mg d nitros הם דומים מיסודם, הוספת nitric oxide ל-iron MGD כרוכה בקצב תגובה מהיר, והצורה של iron MGD nitric oxide add היא יציבה מאוד.

למעשה, ניתן להקפיא את התמיסה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לצורך רכישת ספקטרום EPR מאוחרת יותר, ללא ירידה משמעותית בעוצמת אות ה-EPR. מנגד, זיהוי תחמוצות באמצעות מלכודת הספין nitro הוא איטי. הדבר מחייב ריכוזים גבוהים יותר של מלכודת הספין בהשוואה לשימוש ב-iron MGD למשם זיהוי nitric oxide.

נעשה שימוש במספר גישות כדי לזהות בהצלחה את צורת התוצר של הסופראוקסיד (superoxide adduct), אותן לא הדגמנו יותר בסרטון זה. השימוש בתא שטוח, למשל, עשוי להניב עוצמת אות גבוהה יותר של תוצר הסופראוקסיד בשל צפיפות תאים גבוהה יותר. אני ממליץ לכם לעיין בטקסט בנושא זה.

בנוסף, במקום להשתמש ב-DMPO, ניתן להשתמש בלכד ספין (spin trap) מאושר כגון BMPO ו-VMP או ב-Nitro DAP MPO זרחני, אשר עשויים להניב תוצרי תוספת (adducts) של סופר-אוקסיד עמידים יותר. כמו כן, נעשה שימוש בציקלודקסטרין כדי לייצב את תוצרי התוספת של הסופר-אוקסיד בעת שימוש בלכידת ספין לגילוי סופר-אוקסיד. מומלץ מאוד לבצע רכישה מיידית של ספקטרום ה-EP לאחר יצירת הסופר-אוקסיד.

לפיכך, זיהוי תחמוצת החנקן באמצעות iron MGD הוא יעיל הרבה יותר, והאתגר המרכזי העומד כעת בפני לכידת ספין ב-PR של superoxide הוא להשיג את המאפיינים שנצפו ביצירת iron MGD nitric oxide addoch. כלומר, תגובתיות מהירה ל-superoxide ויצירת add יציב. מאמצים לפיתוח מלכודות ספין בעלות תגובתיות מהירה ל-superoxide ויצירת spin יציב ADD מבוצעים כעת במעבדה שלנו ובקבוצות אחרות גם כן.