זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

אני פרדריק דינה, ואני פרופסור חבר לפרמקולוגיה כאן באוניברסיטת אוהיו. בהדגמה זו, נראה את הזיהוי של תחמוצת החנקן וסופראוקסיד מתאים באמצעות EPR. מלכודת ספין.

מיני חמצן וחנקן ריאקטיביים היו מעורבים בהתפתחות מחלות שונות, ולכן יש חשיבות עליונה לאיתורם במערכות ביולוגיות. רק מעט שיטות אמינות לזיהוי מינים ריאקטיביים הופעלו במערכות ביולוגיות, אך הן מוגבלות על ידי ספציפיות ורגישות. ירידת ספין, לעומת זאת, משמשת בדרך כלל לזיהוי ארוס וכוללת תגובת הוספה של רדיקל למלכודת ספין ניטרו או קומפלקסים מתכתיים היוצרים תוספת ספין מתמשכת, שניתן לזהות על ידי ספקטרוסקופיה תהודה פרמגנטית אלקטרונית או EPR, צינורות התוספת הרדיקליים השונים מציגים את הספקטרום הייחודי שניתן להשתמש בו כדי לזהות את הרדיקלים הנוצרים ויכולים לספק שפע של מידע על האופי והקינטיקה של הרדיקל ייצור.

תחמוצת החנקן סינטאז מזרז את ההמרה של L-ארגינין ל-L ציטרולין באמצעות N-A-D-P-H לייצור תחמוצת החנקן. בתנאי עקה חמצונית, ENA יכולה לעבור מייצור תחמוצת החנקן לסופראוקסיד בתהליך הנקרא ניתוק, אשר מאמינים כי נגרם על ידי חמצון הם או גורם השיעול שויסות תחמוצת החנקן הידרו-טרין במערכת הביולוגית חשוב מכיוון שהוא ממלא תפקיד קריטי באיתות התאים וכתוצאה מכך פונקציות פיזיולוגיות מועילות כגון הרחבת כלי הדם, אך ייצור היתר שלו קשור לעתים קרובות למצבים דלקתיים. לכן, זיהוי תחמוצת החנקן במערכת הביולוגית חשוב.

סוג חשוב נוסף של מולקולות איתות במערכות ביולוגיות הם מיני חמצן פעילים כמו תחמוצת החנקן, מיני חמצן פעילים בריכוזים נמוכים ממלאים תפקיד חשוב בוויסות תפקוד התא, איתות ותגובה חיסונית, אך בריכוזים לא מוסדרים עלולים להוביל לנזק חמצוני תאי המוביל למתח חמצוני. אניון רדיקלי מי חמצן S הוא אחד ממיני החמצן הריאקטיביים החשובים ביותר והוא המבשר העיקרי של כמה מהמינים המחמצנים ביותר הידועים שקיימים במערכות ביולוגיות כגון S מי חמצן, ניטריט ומוט הידרוקסי. לכן הזיהוי ו/או הקיבוע של מי חמצן S במערכת הביולוגית חשוב מכיוון שיצירתו מסמנת את הסימן הראשון להתפרצות מחומצנת לפני ההתחלה.

פרוטוקול זה עיני טריפסין תרבית תאי אנדותל אבי העורקים של בקר כמתואר בהליך הכתוב. העבירו את התאים לסימן שש המסומן. צלחת היטב ודגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לאחר הדגירה.

מוציאים את צלחת שש הבארות מהחממה ושואבים את המדיום מהראשון. ובכן, שטפו את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של דלקוס פוספט מאגר מלח או DPBS. הכן תמיסת התייבשות ברזל גופרתי 1.9 מילי-מולרית על ידי הוספת 0.8 מיליגרם ברזל גופרתי למיליליטר DPBS אחד עם סידן כלורי ומגנזיום כלוריד.

והכינו תמיסת MGD על ידי הוספת 2.7 מיליגרם אמוניום MGD ל-500 מיקרוליטר DPBS עם סידן כלורי ומגנזיום כלוריד. הוסף 210 מיקרוליטר של 1.9 מילי-מולרי ברזל גופרתי מיובש, ו -210 מיקרוליטר של MGD טרי שהוכן באמצעות יחס מולריות של אחד לשבע ומיקסר מתלה מתקבל. הוסף 4.6 מיקרוליטר של יון סידן ארבע וערבב את התמיסה שוב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

לאחר מכן דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 36 דקות. אוספים את הסופרנאט שמתיישב בצינור עינור. היכנס לשדה מרכז פרמטרים לרכישת EPR של אפנון 34 27 גוס, משרעת של שישה גוסים ותדר של 9.8 ג'יגה-הרץ.

מכיוון שהפרמטרים ישתנו ממכשיר אחד ומתנאי ניסוי למשנהו, אנא עיין בטקסט לפרמטרים אחרים המשמשים בציוד זה. העבירו את הסופר נאטין לאיטום תא שטוח EPR עם פרפין והניחו בחלל ה-EPR. רשום את הספקטרום במשך כ-21 דקות ב-121 סריקות ו-10.4 שניות לסריקה לאחר הפעלת הניסוי.

השתמש בעיבוד brucker WIN EPR כדי לתקן את קו הבסיס ולשלב את הספקטרום הדו-ממדי, מה שמפחית את רעשי הרקע. יש לציין כי זמן הסריקה ומספר הסריקות יכולים להשתנות מניסוי אחד למשנהו. כמו כן, שיטות לתיקון קו הבסיס יכולות להשתנות גם מתוכנה אחת לאחרת.

כדי להתחיל בניתוק Enos, הסר את המדיום מהבאר השנייה מבין השישה. ובכן צלחת ושטוף את התאים פעמיים עם DPBS מיליליטר אחד. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר מהתמיסה המוכנה של 0.5 מילי-מולרית Syn אחת, והביא את הנפח עד שני מיליליטר עם DPBS המכיל 10% FBS דגירה על התאים למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לאחר הדגירה.

שוטפים את התאים עם DPBS פעמיים. לאחר מכן הוסיפו 210 מיקרוליטר של ברזל גופרתי טרי, 2.8 מילי-מולרי ברזל גופרתי הטה הידרט, ו -210 מיקרוליטר של 19.6 מילי-מולרי MGD שהוכן טרי על פי הנוהל הקודם. לאחר מכן, הוסיפו 4.6 מיקרוליטר של 1.9 מילי-מולרי יון סידן ארבע, וערבבו שוב את התמיסה.

כמו קודם, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 36 דקות. לאחר 36 דקות, אספו את הסופר נאטין שמתיישב בצינור איינור והעבירו לתא שטוח EPR. רשום את ספקטרום ה-EPR באמצעות אותם פרמטרי רכישה כמו לפני הרכישה.

לעבד את הנתונים באותו אופן לפני תחילת פרוטוקול זה. הכן תמיסת מלאי של DMPO טוחנת אחת ו-PBS המכילה DTPA של 0.1 מילי-מולרי. לאחר מכן הכינו תמיסה של מיליגרם אחד למיליליטר של ארבעה על 12.

Myra State 13 אצטט או PMA ב-DMSO מייצרים ציטוטים של מיליליטר אחד מתמיסת ה-PMA על ידי דילול ל-10 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS בשפופרת einor המכילה מיליגרם אחד למיליליטר D גלוקוז ומיליגרם אחד למיליליטר. אלבומין מייצר 5 עד 6 מיליון תאי PMN למיליליטר על ידי פיפטינג למעלה ולמטה בצינור איינור של 1.5 מיליליטר. הכינו תערובת בנפח סופי של 60 מיקרוליטר המכילה כ -1.6 כפול 10 לששת התאים של PMN 10 מילי-מולרי DMPO ו -0.2 מיקרוגרם למיליליטר PMA.

בניסוי זה, נשתמש בספקטרומטר פס Bruker ESP 300 X. העבירו את התמיסה לתא שטוח EPR, ולאחר מכן הניחו את התא השטוח בחלל ה-EPR. הזן פרמטרי רכישה EPR, שדה מרכזי של 3, 486 goss, משרעת אפנון של 0.5 goss, ותדר של 9.8 ג'יגה-הרץ.

מכיוון שהפרמטרים ישתנו ממכשיר אחד למשנהו ומתנאי הניסוי למשנהו, אנא עיין בטקסט עבור הפרמטרים האחרים המשמשים בניסוי זה רכוש ספקטרום. בהדגמה זו, אנו מראים את הזיהוי של רדיקלים של תחמוצת החנקן ו-SU מי חמצן באמצעות שתי מלכודות ספין שונות. הברזל MGD ו-DNPO.

אנו מראים שגירוי של תאי אנדותל עם יון סידן ארבע מייצר תחמוצת החנקן והטיפול באחד נראה. תורם ניטריט פרין יכול להפחית את ייצור תחמוצת החנקן, גירוי של נויטרופילים, עם זאת, עם PMA בנוכחות מלכודת ספין ניטרו נותן ADDA רדיקלי הידרוקסיל במקום תחמוצת S עקב חוסר היציבות של הסופראוקסיד שנוצר בתחילה. בעוד שמנגנוני לכידת הספין על ידי ברזל mg d nitros זהים ביסודם, תוספת תחמוצת החנקן לברזל MGD כרוכה בקצב מעבר של תגובה וכי צורת התוספת של תחמוצת החנקן של ברזל MGD יציבה מאוד.

שלמעשה ניתן להקפיא את התמיסה במינוס 80 מעלות צלזיוס לרכישה מאוחרת יותר של ספקטרום ה-EPR ללא ירידה משמעותית בעוצמת אות ה-EPR שלו. מצד שני, זיהוי התחמוצת באמצעות מלכודת הספין של הניטרו הוא איטי. זה דורש ריכוזים גבוהים יותר של מלכודת הספין בהשוואה לזיהוי הברזל המקביל MGD ארבע תחמוצת החנקן.

מספר גישות שימשו כדי לזהות בהצלחה את צורת החיבור של סופראוקסיד, שכבר לא הדגמנו בסרטון זה. השימוש בתא שטוח, למשל, יכול לתת עוצמת אות טובה יותר של מי חמצן עקב צפיפות תאים גבוהה יותר. אני ממליץ לך לעיין בטקסט בעניין זה.

כמו כן, במקום להשתמש ב-DMPO, ניתן להשתמש במלכודת ספין מוסמכת כגון BMPO ו-VMP או Nitro DAP MPO זרחני, שיכול להניב תוספת SU מי חמצן מתמשכת יותר. השימוש בציקלודקסטרין שימש גם לייצוב SU מי חמצן להוסיף הסתגלות בעת שימוש בלכידת ספין לזיהוי US. רכישה מיידית של ספקטרום ה-EP לאחר יצירת סופראוקסיד SU מומלצת מאוד.

לכן, זיהוי תחמוצת החנקן באמצעות ברזל MGD יעיל בהרבה והאתגר העיקרי כעת העומד בפני לכידת ספין PR של סופראוקסיד הוא להשיג את המאפיינים שנצפו להיווצרות אדוך תחמוצת החנקן של ברזל MGD. כלומר מהיר, תגובתיות סופראוקסיד ויציבה מוסיפים מאמצים בפיתוח מלכודות ספין עם תגובתיות מהירה לסופראוקסיד ויצירת ספין יציב. הפרעת קשב וריכוז מתבצעת כעת במעבדה שלנו וגם על ידי קבוצות אחרות.