כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה
July 31st, 2011
תקנים איזוטופ יציב ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים (SISCAPA) זוגות להעשרת הזיקה של פפטידים עם איזוטופ יציב דילול ספקטרומטריית מסה (MRM-MS) כדי לספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות חלקיקים מגנטיים בפורמט אוטומטיות חלקית.
המטרה הכוללת של ההליך הבא היא לבודד ולכמת פפטידים בתערובת מורכבת הפועלים כתחליפים לחלבון שלהם. ראשית, חלבונים גדולים בתערובת מתעכלים לפפטידים מרכיבים באמצעות אנזים כמו טריפסין. לאחר מכן אנליטי הפפטידים הממוקדים ותקן פנימי של איזוטופ יציב עם תווית דוקרני מועשרים באמצעות נוגדנים לפפטיד אנטיפ, המשותקים על חלקיקים מגנטיים מקודדים בחלבון G לאחר בידוד.
הפפטידים הממוקדים נרמזים מהחלקיקים המגנטיים ומנותחים על ידי ספקטרומטריית מסה לכימות ביחס לתקן הפנימי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בדיקות אימונולוגיות מסורתיות הוא שהיא מהירה וחסכונית יותר בבניית מספר רב של בדיקות. יש לו אחוזי הצלחה גבוהים והוא מוכפל בקלות ומדגים שההליך יונח.
טכנאי במעבדה החזיק Eloqua פלזמה של 10 מיקרוליטר על קרח רטוב. העבירו את הדגימה לצלחת באר בעומק של 1000 מיקרוליטר וכסו בסרט משל כדי לנטרל את החלבונים ב-20 מיקרוליטר של אוריאה טרייה תשע טוחנת 30 מילי-מולרית DTT לכל דגימה ודגירה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של 500 מילי-מולרי טרי I oto אצטמיד לכל דגימה ודגרו במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. כעת יש לדלל את האוריאה ל-0.6 מולרית עם 100 מילי-מולרי טריס pH שמונה, ולהוסיף 10 מיקרוליטר של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר נסיעות ותמיסת מלאי ליחס של 1 עד 50 אנזים למצע.
לאחר הדגירה של התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה בשלושה מיקרוליטרים של חומצה פורמית מסודרת לריכוז סופי של 1% המשך להוסיף את תקן האיזוטופ היציב או תקנים מרובים. אם מבצעים בדיקת מולטיפלקס, שטפו היטב את צלחת המחסנית של אואזיס עם 500 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית ב-80% ניטריל ACE, וזרקו את הזרימה. לאחר מכן יש לאזן את לוחית המחסנית על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית במים ולהשליך את הזרימה.
טען את דגימות העיכול על לוחית המחסנית והתאם את הוואקום כך שהזרימה תהיה איטית מאוד. שטפו שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית במים והשליכו את הזרימה דרך הפפטידים פעמיים עם 500 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית בניסוי של 80% אצטו, ואז ליופיליזציה או האיץ את הפליטה ליובש והרכיבו מחדש את הפפטידים המיובשים ב-50 מיקרוליטר PBS בתוספת 0.03%Chaps מעבירים את הדגימות לצלחת באר סטנדרטית של קינגפישר 96 מוסיפים מיקרוגרם אחד של נוגדן ו-1.5 מיקרוליטר חלבון G חרוזים מגנטיים מקודדים לכל מטרה. מערבולת את החרוזים לפני ההוספה.
כדי להבטיח שהחרוזים תלויים היטב. מכסים את הצלחת בנייר כסף ודוגרים למשך הלילה עם צנטריפוגה נופלת עדינה. הצלחת ב 400 סל"ד למשך 10 שניות כדי להסיר כל נוזל משטח נייר הכסף.
הסר את מכסה נייר הכסף. מניפולציה לדוגמה מתרחשת על פלטפורמת שלדג אוטומטית בפלטפורמת Kingfisher. שטפו את החרוזים פעמיים עם 200 מיקרוליטר PBS בתוספת 0.03% צ'אפס ופעם אחת עם 200 מיקרוליטר של דילול אחד עד 10 של PBS בתוספת 0.03% צ'אפים כעת חומקים מהפפטידים עם 25 מיקרוליטר של 5% חומצה אצטית בתוספת 0.03% צ'אפס.
הנח את לוחית הפליטה על מגנט והעביר את הפליטה לצלחת 96 באר תוך הקפדה לא להעביר את שאריות החרוזים. כסו את הצלחת עם שטיח התקרה, העבירו את הצלחת הזו המכילה את האלואט לספקטרומטר המסה המשולש והמרובע, לניתוח. שיטת MRM בנויה על ידי השגת ספקטרום מסה טנדם של הפפטיד המעניין מאשר בחירה ואופטימיזציה של יוני שברי המעבר הטובים ביותר.
בדרך כלל, תצורה לניתוח MRM משתמשת במלכודת C 18 ובעמודות אנליטיות עם שני שלבים ניידים. טען 10 מיקרוליטר מהדגימה והוציא על ידי שיפוע ליניארי. שלב אזורי שיא עבור הפפטידים הקלים והכבדים, וחשב את יחס שטח השיא של פפטיד ללא תווית לפפטיד מסומן בכל דגימה.
הפפטידים הקלים והכבדים נפלטים בו זמנית וניתן לנטר מעברים מרובים עבור כל פפטיד כדי לאשר את הזהות, שטח השיא של הפפטיד האנדוגני נמדד ביחס לשטח התקן הפנימי כדי לספק מדד כמותי של פפטיד המטרה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם טכניקה זו במעבדה שלך. ניתן להשתמש בו כדי לכמת כל חלבון מעניין, מה שהופך אותו למתאים למגוון רחב של יישומים במחקר ביולוגי.
סקירה
מאמר זה מתאר את טכניקת התקנים של איזוטופים יציבים ו-Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA), המשלבת העשרה באפיניות של פפטידים עם ספקטרומטריית מסה בדילול איזוטופים יציבים למדידת פפטידים כמותית. הפרוטוקול משתמש בחלקיקים מגנטיים בפורמט אוטומטי חלקית כדי לשפר את היעילות.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ספקטרומטריית מסה
רקע
- SISCAPA מאפשרת כימות של פפטידים כמחליפים לחלבונים.
- השיטה משפרת את הבדיקות האימונולוגיות המסורתיות במהירות וביעילות עלות.
- היא מתאימה לבדיקות מרובות, ומאפשרת ניתוח של מספר פפטידים בו זמנית.
- הטכניקה כוללת עיכול חלבונים לפפטידים והעשרתם באמצעות נוגדנים ספציפיים.
מטרת המחקר
- לבודד ולהעריך פפטידים מתערובות מורכבות.
- להדגים פרוטוקול שמשפר את היעילות של ניתוח הפפטידים.
- לספק שיטה שניתן ליישמה באופן רחב במחקר ביולוגי.
שיטות ששימשו
- עיכול חלבונים באמצעות טריפסין ליצירת פפטידים.
- העשרה של פפטידים ממוקדים עם נוגדני פפטידים על חלקיקים מגנטיים.
- ניתוח ספקטרומטריית מסה להעמדת פפטידים.
- יישום של זרימת עבודה אוטומטית חלקית באמצעות פלטפורמת Kingfisher.
תוצאות עיקריות
- שיטת SISCAPA מספקת שיעור הצלחה גבוה להעמדת פפטידים.
- היא מדגימה את היכולת לבצע בדיקות מרובות ביעילות.
- מדידות כמותיות מושגות על ידי השוואה בין יחסי פפטידים קלים וכבדים.
- הטכניקה מתאימה לחלבונים שונים של עניין.
מסקנות
- SISCAPA היא שיטה חזקה להעמדת פפטידים בדגימות ביולוגיות.
- הפרוטוקול ניתן ליישום במעבדות ליישום מגוון.
- היא מציעה יתרונות על פני שיטות מסורתיות, מה שהופך אותה לכלי חשוב במחקר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative protein measurement remains a critical bottleneck in target validation and biomarker discovery, where traditional immunoassays face cost, lead time, and interference limitations. SISCAPA offers a scalable, multiplexable alternative that enhances predictive confidence in early discovery by providing stoichiometric, antibody-independent quantification of proteotypic peptides. This supports risk-adjusted portfolio decisions and translational continuity from hypothesis to preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise quantification of target proteins in complex matrices.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by using proteotypic peptides as stoichiometric surrogates for protein concentration.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering reproducible, multiplexable data for target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated peptide enrichment workflows compatible with downstream SRM/MRM-MS quantification.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through stable isotope internal standards and magnetic bead enrichment.
- Scalability: Facilitates multiplexed assay development for parallel target evaluation without plasma depletion.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing quantitative peptide readouts translatable across sample types.
- Mechanistic De-risking: Enables biomarker alignment through specific, interference-resistant peptide detection in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Supports risk-adjusted advancement decisions via quantitative, antibody-free protein measurement.
Pipeline & Workflow Integration
SISCAPA integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling quantitative measurement of proteins as a foundation for assay development and screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying target proteins in native biological contexts.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible peptide enrichment and quantitative MS readouts for compound evaluation.
- Analytics: Provides light/heavy peptide peak area ratios as quantitative outputs for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Enables continuity from discovery to preclinical validation through standardized peptide quantification.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multiplexed target quantification across projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, antibody-based enrichment, and mass spectrometry.
- Depends on access to SRM/MRM-capable mass spectrometers and magnetic bead handling platforms.
- Necessitates cross-team standardization of antibody validation and peptide selection criteria.
- Involves adaptation considerations for different sample types, including plasma, cell lysates, and tissue extracts.
- Involves practical limitations related to antibody availability for specific peptides and trypsin digestion efficiency.
