Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

המטרה הכוללת של הליך זה היא להבדיל בין תאי גזע ואב המטופויאטיים אנושיים לאורך שושלת האריתרואידים ולהפיל גורם שעתוק מסוים במהלך אריתרופואיזיס ex vivo. זה מושג על ידי בידוד תאי גזע אנושיים חיוביים CD 34 ותאי אב מדם טבורי, מח עצם או דם היקפי המגויס באמצעות GCSF. השלב השני של ההליך הוא להבדיל את תאי הגזע ההמטופויאטיים הללו לאורך השושלת האריתרואידית באמצעות הליך תרבית תאים בן ארבעה שלבים המשלב ציטוקינים ספציפיים ותרבית משותפת על שכבת תאי סטרומה כדי לחקות את המיקרו-סביבה של מח העצם.

לאחר מכן, הכינו חלקיקים וקטוריים לנטי-ויראלים המבטאים מולקולת HRNA כנגד גורם השעתוק המעניין, מולקולת HRA מקושקשת כבקרה שלילית וחלבון GFP לשליטה ביעילות הזיהום בנגיף. השלב האחרון של ההליך הוא להדביק את תאי האריתרואיד האנושיים הראשוניים בשלב נתון של התמיינות בחלקיקים לנטי-ויראליים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות התפשטות תאים והתמיינות אריתרואידית באמצעות ניתוח מורפולוגיה של תאים, יכולת יצירת מושבה של אבות, ייצור המוגלובין וביטוי של סמנים ספציפיים לאריתרואידים על ידי עובדות.

יעילות זיהום הנגיף מנותחת על ידי מדידת ביטוי GFP על ידי עובדות והפלת גורם השעתוק המעניין מנותחת על ידי R-T-Q-P-C-R. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההמטופוזיס, כגון מנגנון מולקולרי על ידי כל גורם שעתוק, לווסת את ביטוי הגנים בסביבה שאינה משתנה המסופקת על ידי תאים אנושיים ראשוניים. זה חשוב להבנת תהליכים בסיסיים של המטופואיזיס כגון קביעת סולפט, התפשטות התחדשות עצמית או אפופטוזיס.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי החזר ROI תקין והוויסות שלו ברמה המולקולרית, היא יכולה לשמש גם כמערכת מודל לחקר טיפולים ממוקדים למחלות הנובעות מחוסר איזון, צמיחה והתמיינות, כולל הפרעות מיאלופרוליפרטיביות כגון פוליציטמיה ורה אנדרו לוקמיה. הפרוטוקול לאריתרופואיזיס ex vivo של תאי גזע ואב המטופויאטיים אנושיים להמוגלובין בוגר המכיל תאי דם אדומים מורכב משני שלבים, בידוד של תאי גזע ואב המטופויאטיים אנושיים חיוביים CD 34, והתמיינות אריתרואידים חופשיים בסרום בתרבית תאים. בשלב הראשון, תאים חיוביים ל-CD 34 מבודדים מדם טבורי, מח עצם או דם היקפי אנושי המגויס עם GCSF באמצעות ברירה חיסונית חיובית.

השלב השני של התמיינות אריתרואידים ללא סרום כרוך בגידול תאים חיוביים CD 34 בתרבית נוזלית. על פי פרוטוקול בן ארבעה שלבים המותאם מהשיטה שפותחה בתחילה על ידי מעבדת DU מיום האפס עד היום ה-11, תאים המטופויאטיים גדלים באזיקי קרח בתוספת זמן, ECCOs מותאמים, מדיום המכיל גורם תאי גזע הידרוקורטיזון אינטרלוקין שלוש ואריתרופואטין. לאחר מכן, מהיום ה-11 עד היום ה-15, תאי אריתרואידים עוברים תרבית משותפת על טרשת נפוצה חמישה תאים מזנכימליים במדיום IMDM המכיל EPO בשלב השלישי.

לאחר קצירת תאי אריתרואיד קיץ לשימוש עתידי, התאים הנותרים עוברים תרבית משותפת על תאי MS חמישה בתוספת IMD ומדיום ללא ציטוקינים. לבסוף, מהיום ה-18 עד היום ה-26, תאי אריתרואידים מרוכזים פי שלושה עד ארבעה ונשמרים על שכבה של MS חמש כדי לאפשר התבגרות ו-10% FBS מתווסף במדיום IMDM לשימור טוב יותר של תאי דם אדומים מתורבתים. למטרות מאמר וידאו זה, נדגים רק את השלב השני של התמיינות אריתרואידים, התרבות המשותפת של תאים אריתרואידים על תאים מזנכימליים עם אריתרופוייטין.

ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא לבצע שלבים אלה בקנה מידה גדול, שטיפה והחלפת המדיום של הבקבוק המכיל חמישה תאי AUS לתרבית משותפת ולאחר מכן העברת תאי סחר אמנות לתוך בקבוק זה. לכן, אנו מעבדים בקבוק בכל פעם ויש לנו 2% איבר בו זמנית. כדי להתחיל בתרבית משותפת של תאים אריתרואידים על תאים מזנכימליים עם EPO, ספור את תאי האריתרואידים באמצעות טריאן כחול כדי לא לכלול תאים מתים.

ביום ה-11, צפיפות התאים צריכה להיות בערך 1.5 כפול 10 מתוך ששת התאים למיליליטר רזרבה של כ-80 מיליליטר מתרבית התאים האריתרואידים לתרבית משותפת על חמישה תאים מזנכימליים של טרשת נפוצה. PBS חם מראש השלים את מדיום IMDM, והשלים מדיום IMDM המכיל EPO ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שלפו מהחממה ארבעה מהצלוחיות שהוכנו בעבר עם חמישה תאים משולבים של MS.

שטפו כל בקבוק עם 20 מיליליטר של XPBS אחד והוסיפו מיד 80 מיליליטר של מדיום IM DM טרי המכיל EPO לכל בקבוק. שמור את התאים בחממה בזמן הכנת התאים האריתרואידים. כעת העבירו את תאי האריתרואידים השמורים לשני צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב-1500 RRP M למשך 10 דקות.

לאחר השלכת ה-supernatant לשטוף כל אחד משני כדורי התא עם 20 מיליליטר של תוספת IMDM בינונית, השעו כל כדור תא ב-40 מיליליטר של מדיום IMDM בתוספת המכיל EP. לאחר מכן מחלקים 20 מיליליטר של תרחיף תאים זה לכל אחת מארבעת הצלוחיות המכילות טרשת נפוצה, חמישה תאים ו-80 מיליליטר מדיום. בשלב זה, אתה צריך שיהיו לך ארבע צלוחיות עם טרשת נפוצה מתכנסת חמישה תאים המכילים 100 מיליליטר של תאים אריתרואידים ב-0.3 כפול 10 עד ששת התאים למיליליטר ביום שלמחרת, נגד תאי אריתרואידים עם טריאן כחול כדי לא לכלול תאים מתים. צפיפות התאים צריכה להיות בערך 0.6 כפול 10 לששת התאים למיליליטר.

קצור את המספר הדרוש של תאים לבדיקות כדי לאמת התפשטות תאים תקינה והתמיינות אריתרואידים. חקר אריתרופואיזיס ברמת השעתוק דורש גם יכולת לבטא יתר על המידה או להפיל גורמים ספציפיים בתאי אריתרואידים ראשוניים. בדוגמה זו, מערכת העברת גנים בתיווך lentivirus משמשת כדי להפיל את גורם השעתוק לאחד בתאי אריתרואידים אנושיים ראשוניים.

הפרוטוקול להכנת חלקיקים וקטוריים לנטי-ויראלים זמין בכתב היד. סרטון זה ידגים את ההליך לזיהום לנטי-ויראלי של תאי אריתרואידים ראשוניים להעברת גנים. תאי אריתרואידים גרעיניים יכולים להידבק ביעילות בכל שלב של התמיינות באמצעות ריבוי של 50 עד 100 של זיהום.

כאן ישמש נגיף לנטי המבטא T אחד או ערבול S-H-R-N-A כדי להדביק תאים אריתרואידים בימים השמיני והתשיעי של ההתמיינות באמצעות MOI של 52 שימוש לתא. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו שלוש שפופרות חרוטיות של 15 מיליליטר המכילות אחת כפול 10 מתאי האריתרואיד השישיים, כל צינור אחד ל-TAL נוקדאון אחד, צינור אחד לבקרה שלילית מקושקשת וצינור אחד לביטוי GFP. שליטה בתאי שטיפה עם חמישה מיליליטר של מדיום IMDM בתוספת EPO מסתובבים ב-1000 סל"ד למשך חמש דקות ומסירים כמה שיותר סופרנטנט.

ההדבקה צריכה להתבצע בכמויות מינימליות של מדיה כדי לאפשר ספיגה מקסימלית של נגיף הלנטי על התאים. הוסף פולי מוח בריכוז סופי של 40 מיקרוגרם למיליליטר לכל שפופרת של לנטי-וירוסים מרוכזים. הוסף 100 מיקרוליטר של נגיף מרוכז מוכן המכיל פולי מוח לכל צינור של תאים.

דגירה במשך שעה בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס מעורבב על ידי הקשה על האצבע כל 10 דקות. זה מאפשר פיזור אחיד של הנגיף על פני התאים בסיום הדגירה של שעה אחת ב-1.9 מיליליטר של מדיום IMDM בתוספת המכיל EPO לכל צינור. מעבירים כל דגימה לצלחת של שש בארות ומניחים בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

לאחר 24 שעות, קצרו את התאים בצינורות נפרדים של 15 מיליליטר. סובב אותם ב -1000 RRP M למשך חמש דקות והסר את הסופרנטנט. חזור על ההדבקה, הוסף וירוס ומוח פולי ודגירה למשך שעה 37 מעלות צלזיוס בהקשה על האצבעות.

לאחר מכן הוסף מדיום IMDM משלים המכיל EPO לתאים. מעבירים כל דגימה לצלחת של שש בארות ומדגרים למשך 24 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את התאים לשלושה צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר ושטפו על ידי צנטריפוגה, הסרת תרחיף סופרנטנט ורסוס של תאים וצנטריפוגה בינונית טרייה.

שוב, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בריכוז של 0.2 כפול 10 מתוך ששת התאים למיליליטר לתוך IMDM משלים המכיל EPO. לאחר מכן, המשך בהליך להתמיינות אריתרואידים ex vivo נספרים כל יומיים במהלך פרוטוקול ההתמיינות האריתרואידית ex vivo. תוצאה מייצגת בקנה מידה לוגריתמי מראה שתאים הם שגשוג מאוד כפי שמודגם על ידי הגברה של פי 10,000.

בנוסף, מאי גרונוולד, כך שצביעת מורפולוגית נעשית כל יומיים באמצעות 0.05 כפול 10 מתוך ששת התאים ליום אפס עד שמונה ו-0.2 כפול 10 מששת התאים בימים האחרים. כפי שמודגם באיור זה, תאים בשלבים מסוימים של התמיינות, מציגים גדלים ומורפולוגיה ניתנים לזיהוי. שימו לב לתהליך ההתפרקות המתרחש בסוף ההתמיינות החל מהיום ה-20.

ביום ה-26, כל התאים איבדו את הגרעינים שלהם. מבחני יצירת מושבות משמשים לאיתור אבות המטופויאטיים מוקדמים ומאוחרים במהלך הימים הראשונים של ההתמיינות, והתוצאות מוצגות כאן ביום האפס. בנוסף לאבות אריתרואידים, גרנולוציטים, אבות מקרופאגים מיוצגים באופן משמעותי בתוך התאים החיוביים המוקדמים של CD 34.

ככל שהבידול מתקדם רואים ירידה משמעותית בכמה מהנדסים גנטית, וביום השישי הם הוחלפו לחלוטין על ידי אבות אריתרואידים, BAUE ו-CAUE. חשוב גם לציין שמהיום הרביעי עד היום השישי, האבות האריתרואידים המוקדמים, BAUE מוחלפים בהדרגה על ידי עמיתיהם המובחנים יותר, CAUE. עד היום העשירי, תאי האריתרואידים איבדו למעשה את יכולת יצירת המושבה שלהם.

מוצגות כאן תמונות טיפוסיות של BFUE ו-CFUE. הצבע החום האדום נובע מההמוגלובין של BFUE ו-CFUE. אריתרופואיזיס מנוטר במהלך התמיינות exvivo על ידי קצירת תאים בנקודות הזמן המצוינות וניתוחם על ידי עובדות או על ידי מיקרוסקופיה לביטוי סמני פני התא.

כאן, העמודות מייצגות אחוזים של תאים חיוביים. תצפיות משמעותיות כוללות את האובדן המתקדם של סמן האב ההמטופויאטי CD 34, הרכישה וההפסד המתקדם של סמן האב CD 36, הרכישה והאובדן המתקדם של סמן האב האריתרואידי, האב והסמן הרטיקולוציטים CD 71, והעלייה של מבשר האריתרואיד וסמן האריתרוציטים GPA. סמנים אחרים להתמיינות אריתרואידים כוללים סינתזת המוגלובין החל מהיום השמיני, כפי שנמדד על ידי צביעת בנדין והוצאת תאים החל מהיום ה-20.

כפי שנמדד על ידי אובדן ה-LDS של כתם ה-DNA, התוצאות של העברת גנים בתיווך לנטי-ויראלי בפרו-אריתרובלסטים ראשוניים אנושיים מוצגות לאחר הפלת גורם השעתוק. T one תווך על ידי lentivirus שנמסר נגד T אחד SHRA או מדידת SHRA בקרה מקושקשת של הקינטיקה של T 1 mRNA רמת על ידי RT qPCR R וביטוי של T תעתיק אחד ביחס ל-18. Srna הראה כי 75% מתעתיקי T one הופלו בהצלחה בתאי אריתרואידים ראשוניים.

העלייה ברמת התעתיק של T one מהיום התשיעי ליום ה-12 והבקרה המקושקשת מדגישה את החשיבות של גורם שעתוק זה במהלך התמיינות אריתרואידים. לבסוף, בניסוי אחר, תאים אריתרואידים נדבקו ב-lentivirus המבטא את חלבון ה-GFP. איור זה מראה ששלושה ימים לאחר ההדבקה, רוב תאי האריתרואידים מבטאים GFP כפי שנמדד על ידי פלואורסצנטיות במיקרוסקופ ועל ידי עובדות.

זה מצביע על יעילות הזיהום בתאי אריתרואידים ראשוניים קרוב ל -100% לאחר התפתחותו. טכניקה זו נסללה על ידי חוקרים בתחום ההמטופואיזיס כדי לחקור את ויסות השעתוק באריתרופואיזיס אנושי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להבדיל תאי גזע ואב המטופויאטיים לציטים בתרבית, כמו גם כיצד להשתמש בהעברת גנים בתיווך לנטי-ויראלי על מנת לגרום לנוקאאוט יעיל של גנים בכל שלב של תהליך התמיינות זה.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.