בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

נגיפי RNA משתמשים ב-RNA פולימרזות המקודדות ויראלית כדי לשכפל את הגנום שלהם. לפולימרזות אלו יש שיעור שגיאות גבוה מטבען, המאפשר לנגיף להסתגל ולהתפתח במהירות. סרטון זה מציג שיטה אופטימלית לסריקה וזיהוי של נגיפים עם מוטציות ב-RNA פולימרז שלהם המשפיעות על שיעור השגיאות או על הנאמנות (fidelity) במהלך השכפול.

ראשית, מחילים מוטגנים על תאי מאחס ויראליים כדי לקבוע את הרמה המקסימלית של המוטגן שניתן להשתמש בה מבלי להרוג את התאים או לעכב את הנגיף. לאחר קביעת התנאים האופטימליים, מעבירים את הנגיף (passaging) תחת לחץ סלקטיבי של מוטגנים של RNA. לאחר מכן, מבצעים ריצוף לאוכלוסייה העמידה למוטגנים כדי לזהות את המוטציה האחראית.

בשלב הבא, מבודד המוטנט העמיד למוטגנים. קינטיקת השכפול מנוטרת והתוצאות מראות עליות או ירידות בנאמנות הפולימראז. זאת במקביל לעמידות רחבה למוטגנים של RNA ושינויים בתדירות המוטציות של אוכלוסיית הנגיף.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות נאמנות ביוכימית באמצעות פולימרזים מטוהרים, הוא שהטכניקות המעורבות כאן תקפות עבור כל נגיף RNA שניתן לגדל בתרבית רקמה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הווירולוגיה, כגון תפקידו של ה-polymerase aate באדפטציה ובאבולוציה של נגיפים. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להתקשות, כיוון שהלחצים הסלקטיביים שבהם הם משתמשים הם חזקים מדי או חלשים מדי, וגודל דגימת הרצף המנותחת של האזור הרצופי ומספר השיבוטים לא עברו אופטימיזציה לצורך עוצמה סטטיסטית.

התחילו בניסוי זה על ידי קביעת טווח ריכוזי המוטגנים שניתן להשתמש בהם בניסויים הבאים מבלי לגרום למות התאים. שאבו את המצע מלוחות של שישה בארות המכילים שכבות חד-שכבתיות תת-קונפלואנטיות של תאי hilar. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של מצע מועשר במוטגן; כאן נעשה שימוש במוטגנים ribovirin, five Flo uracil, five azacitidine, magnesium chloride ו-manganese chloride.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר מכן, בכל 24 שעות במשך יומיים עד שבעה ימים, השתמשו בצלחת אחת של תאים כדי לבדוק את החיוניות באמצעות הדחיית צבע triam blue. באמצעות hemo cytometer, חשבו את אחוז התאים החיוניים עבור כל ריכוז של המוטגן, כולל תנאי הביקורת ללא טיפול, אשר גורמים לפחות מ-50% מוות של תאים עד לסוף נקודת הזיהום.

כאשר הגעה לטיטרים מקסימליים היא אידיאלית, השלב הבא בהליך הוא קביעת ריכוז המוטגן שיפעיל לחץ סלקטיבי אופטימלי מבלי לגרום למוטגניות יתר של האוכלוסייה בריכוזים המתאימים. כל גנום יעבור מוטציה בלפחות מיקום אחד או שניים. כך ייצור המוטגן את מוטציית העמידות, אשר תיבחר לאחר מכן במהלך המעברים.

אם יוכנסו מוטציות רבות מדי, המוטנטים הנושאים את מוטציית העמידות יהיו בעצמם קטלניים. מוטגנוס המעכב את בידודם בלוחות של שש בארות שזרעו תאינו ב-2 ml של מצע המועשר במוטגן; השתמש באותו טווח ריכוזים כפי שבוצע קודם לכן, למעט ריכוזים שהובילו למות של מעל 50% מהתאים.

דגרו למשך שעתיים כדי לאפשר ספיגה של המוטגן בעקבות הדגירה. שאבו את המצע והדביקו בנגיף בריבוי הדבקה (MOI) נמוך ב-200 µL; דגרו למשך 15 עד 60 דקות כדי לאפשר לנגיף להדביק את התאים, תוך נעירה של הפלטה במרווחי זמן קבועים כדי להבטיח שהאינוקולום מכסה את השכבה החד-תאית (monolayer) של התאים. שאבו את הנגיף שהוחדר ושטפו פעמיים עם 2 mL של PBS כדי להסיר כמה שיותר מהאינוקולום.

לאחר מכן, הוסיפו לכל באר מצע עם מוטגן והדגרימו את התאים למשך זמן השווה לשלושה עד שישה מחזורי שכפול, בדרך כלל בין יומיים לשבעה ימים. אספו את הווירוסים מכל באר ובצעו בדיקת פלאק סטנדרטית או דילול מגביל כדי לקבוע את ההשפעה האנטי-ויראלית על תיתור הווירוס מהתיתורים שחושבו. זהו את ריכוז המוטגן המפחית את תיתורי הווירוס בהשוואה לביקורת הזיהום ללא טיפול ב-0.5 עד שני לוגים, ואינו רעיל מאוד לתאים.

באופן אידיאלי, רעילות של פחות מ-50% כדי לבודד וריאנטים עמידים למוטגנים. התחל בהעברת נגיף בתאי HeLa עם הריכוז האופטימלי של כל מוטגן; ייתכן שיהיה צורך להעביר את הנגיף עד 30 פעמים. בכל מעבר, קבע את תיתור הנגיף וחזור על ההדבקה והדגירה עם המוטגן כפי שמוצג כאן. תיתורי הנגיף של דגימות שעברו טיפול במוטגנים צריכים לרדת במהלך המעברים הראשונים בהשוואה לתיתור הנגיף המקורי ולתיתורי הנגיף של ביקורת ללא טיפול. ברגע שתיתורי הנגיף עבור סדרה נתונה יגיעו לאותה סדר גודל של תיתורי הביקורת ללא הטיפול, הדבר מעיד על עמידות.

חלץ את ה-RNA הנגיפי לריצוף באמצעות פריימרים המגבירים את הגנים של הפולימראז או השכפול של הנגיף הנבדק. ייצר cDNA של הגנום הנגיפי באמצעות R-T-P-C-R, ולאחר מכן רצף את ה-DNA. לאחר קבלת מידע על הרצף.

השתמשו בתוכנה ליישור רצפים כדי ליישר את הרצפים שהתקבלו אל מול רצף הקונסנזוס של הייחוס ולזהות את מוטציות הנקודה החדשות. בנוסף, בדקו את הכרומטוגרמות לאיתור פסגות מיעוט שייתכן שפוספסו על ידי תוכנת היישור; מוטנט המהווה 20% עד 30% מאוכלוסיית המקור עדיין יופיע כפסגה, אך היא תהיה קטנה מדי מכדי להיות מזוהה כנוקלאוטיד מעורב באמצעות ניתוח רצפים סטנדרטי. כדי לזהות את המוטציה המבוקשת, חפשו פולימורפיזמים של נוקלאוטיד בודד (SNPs) המופיעים באופן בלעדי באוכלוסייה שעברה מוטגנזה בהשוואה לביקורת לא מטופלת מאותו מעבר, כפי שמוצג כאן. ברגע שזוהתה מוטציה, יש לשחזר את הווריאנט העמיד מ-cDNA זיהומי או לבודדו בתרבית רקמה, ויש לאשר את הפנוטיפ של העמידות.

כאן נבצע בידוד של המוטנטים שזוהו באמצעות בדיקת פלאקים (plaque assay). הכינו דילולים סדרתיים של הדגימה העמידה לחנקן והוסיפו אותם לשכבות תאים (cell monolayers) בצלחות שש-בארים לצורך בדיקת פלאקים, לאחר דגירה של שעה אחת ב-37 °C וב-5% carbon dioxide. הוסיפו כיסוי אגרוז יומיים עד חמישה ימים לאחר ההדבקה.

הפלאקים צריכים להיות גלויים בבירור. באופן אידיאלי, אחת הצלחות תניב בין 10 ל-50 פלאקים מופרדים היטב. סמנו את מיקום הפלאקים על הצלחת באמצעות נקודה בעזרת טוש; הקפידו לא להזיז או להסיט את שכבת הכיסוי, ודחפו בעדינות טיפ מסנן של P 200 דרך שכבת כיסוי האגרז.

כדי להגיע לפלאק, הרם בזהירות את הקצה מתוך שכבת הכיסוי והעבר את פקק ה-aros למבחנה למיקרו-צנטריפוגה המכילה 250 microliters של מצע. כמות מספקת של נגיף תועבר ללא קשר לשאלה אם פקק ה-aros שוחרר מהקצה, סובב את המבחנה ב-vortex כדי להשיג עד TenX לכל טיפול. שמור חלק מהדגימה כדי להגביר את הנגיף החי מאוחר יותר.

לאחר מכן, הוצא את ה-RNA משארית הדגימה ובצע R-T-P-C-R כדי לזהות את דגימת הפלאק המכילה את המוטציה הרצויה. בצע ריצוף ל-CDNA. ודא כי אין מוטציות נוספות.

לאחר מכן, הכינו מלאי גדול יותר של נגיף זה עבור כל המחקרים הבאים. בשלב הבא, כדי לאשר את העמידות המוענקת על ידי המוטציה שזוהתה, חזרו על בדיקת המוטגנים תוך שימוש במספר תנאים מוטגניים.

אם הווריאנט עמיד למספר מוטגנים, סביר להניח שהנאמנות (fidelity) שלו מוגברת. מכיוון שמוטציות המשנות את הנאמנות ממופות לפולימראז, חשוב לוודא שקינטיקת השכפול לא השתנתה באופן משמעותי. לפני קביעת תדרי המוטציות, יש לבחון את השכפול באמצעות לפחות שתי גישות משלימות.

לדוגמה, ניתן לבצע גישה הבוחנת ייצור נגיפים, כגון plaque assay או TCID 50, בנוסף לגישה הבוחנת סינתזת RNA, כגון quantitative R-T-P-C-R או northern blot. לאחר מכן, כדי לאשר שהשינוי שזוהה בפולימראז המקנה עמידות למוטגנים משנה את השכפול, נמדדים תדרי המוטציות של הדיוק (fidelity mutation frequencies). ניתן לבצע זאת באוכלוסיית נגיפים חיונית או באוכלוסיית הנגיפים הכוללת.

כדי לקבוע את תדרי המוטציות של אוכלוסיית הנגיף הכוללת, הכוללת וריאנטים חיוניים ושאינם חיוניים, יש לבצע מיצוי של ה-RNA והגברה באמצעות R-T-P-C-R של אזור בן 800 עד 1,200 נוקלאוטידים מרצף מקודד הידוע כבעל וריאנטים גנטיים, כגון זה המקודד לחלבון מבני. לאחר מכן, בצעו topo TA cloning למוצר המזוקק עבור כל אוכלוסיית נגיף הנחקרת. בחרו 96 מושבות שזוהו כבעלות אינסרט חיובי באמצעות סינון כחול-לבן על צלחות מצופות xga.

בצע PCR של מושבה בודדת כדי לאשש את תקינות הסינון הכחול-לבן. בהתבסס על גודל המקטע והתנאים שצוינו לעיל, כ-90% מהמושבות צפויות להיות חיוביות. עבור כל מושבה לבנה חיובית, השתמש בקיסם שיניים כדי להעביר כל מושבה ל-1 mL של מצע LB בתוך פלטת 96.

דגרו את צלחות התרבית הבקטריאלית למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C תחת ניעור קבוע. למחרת, בודדו את ה-DNA על ידי הכנת mini preps בפורמט של 96 בארות; רצפו כל צלחת עם מספיק פריימרים כדי להשיג כיסוי מקסימלי של הסגמנט המשובט.

שני פריימרים עם כיסוי של 600 בסיסים אמורים להספיק. בצע ניתוח רצפים באמצעות רצף ייחוס או רצף קונסנזוס עבור כל אוכלוסייה, והשתמש בתוכנת יישור מתאימה שיכולה לזהות בקלות פולימורפיזם של נוקליאוטיד בודד (SNP) במקרה זה. מומלץ להשתמש בתוכנה של DNASTAR Laser.

ראשית נעשה שימוש ב-Gene כדי להסיר רצפים באיכות נמוכה, כגון רצפים עם קריאת בסיסים לקויה בקצוות או רצפים שאתורם קצר מדי. יישרו את הרצפים שנותרו. זהו את טווח הנוקלאוטידים המכוסה על ידי כל הרצפים בניתוח.

יש להשליך שיבוטים שאינם מכסים את האזור הזה במלואו. מסיבות של השוואה, חיוני שיהיה כיסוי מלא של אותו אזור. זהו וספרו את פולימורפיזמי הנוקליאוטיד הבודד השונים מזן הייחוס.

חשבו את תדירות המוטציות על ידי חילוק מספר פולימורפיזמי הנוקליאוטיד הבודד (single nucleotide polymorphisms) הכולל במספר הנוקליאוטידים הכולל שרצפו. הציגו מספר זה כמספר המוטציות הממוצע ל-10,000 נוקליאוטידים שרצפו. אם אותו פולימורפיזם של נוקליאוטיד בודד מופיע במספר רב של שיבוטים (clones), הציגו שני ערכים: אחד הכולל מוטציות חוזרות אלו ואחד המוציא אותן.

קבעו את התפלגות המוטציות. הכינו רשימה מדורגת של מספר השיבטים בכל אוכלוסייה המציגים 0, 1, 2, 3 מוטציות וכן הלאה. מוטציות באזור שרצף כאופציה.

השתמש ברצפים הערוכים כדי לחשב את כל ההשוואות הזוגיות האפשריות בתוך דגימה אחת, על מנת לקבל ערכי ממוצע של גיוון האוכלוסייה. מספר תוכנות ליישור רצפים זמינות כאן. תוכנת Molecular evolutionary genetics analysis, המכונה גם mega, משמשת לקביעת התנאים האופטימליים לבחירה של עמידות למוטגנים של RNA.

התאים שלנו טופלו בריכוזים עולים של ribovirin והודבקו בנגיף Cox AKI B מסוג wild-type בריבוי הדבקה (multiplicity of infection) של 0.0 1, 48 שעות לאחר ההדבקה. נגיפי הבן נאספו והטיטרים נקבעו באמצעות TCID₅₀. איור זה מציג את אחוז התאים ששרדו את הטיפול, המופיע מתחת לציר ה-x, כפי שנקבע על ידי צביעת trypan blue 48 שעות לאחר ההדבקה.

התוצאות מראות שריכוזים של 100 ו-200 micromolar מפחיתים את טרטין הנגיף ב-one to two log מבלי להשפיע על חיות התאים. כדי לבחור אוכלוסיות עמידות למוטגנים, נגיף CHI ganga הועבר בתאי hilar בנוכחות פסים אפורים או בהיעדר פסים שחורים של 50 micromolar ribovirin; לאחר כל מעבר, כמות צאצאי הנגיף נמדדה באמצעות plaque assay קלאסי על תאי BHK, כפי שניתן לראות כאן. ההשפעה המוטגנית ניכרת במהלך המעברים הראשונים, שבהם טרטין הנגיף המטופל ירד ב-two log.

בהדרגה חזר ה-Titus לרמות רגילות של דגימות שלא עברו טיפול. לא נצפו הבדלים משמעותיים בחמש אוכלוסיות שטופלו במוטגנים בהשוואה לאלו שלא טופלו, מה שמעיד על כך שנבחרו וריאנטים עמידים. אכן, ריצוף זיהה מוטציות ייחודיות באוכלוסיית הנגיף שעברה טיפול ב-ribovirin כדי לאשר עמידות רחבה למוטגנים של RNA בעלי מבנה שונה; הווריאנט A 3 72 V בעל הנאמנות הגבוהה של נגיף COA virus B three, שבודד בתחילה בסריקה, נבדק לרגישות מופחתת לריכוזים שונים של מוטגני ה-RNA RIBOVIRIN, fluoro uracil 5 ו-azacitidine 5.

התאים שלנו טופלו בריכוזים המצוינים של ribovirin והודבקו בנגיס Cox AKI virus B מסוג wild type בריבוי הדבקה (MOI) של 0.01. 48 שעות לאחר ההדבקה, נאספו נגיסי הבן ותרי הטיטרים נקבעו באמצעות TCID₅₀. מוצגים כאן הטיטרים של ה-wild type ושל הווריאנט a 3 72 כפונקציה של ריכוז המוטגנס. הווריאנט a 3 72 הראה בעקביות טיטרים גבוהים יותר מה-wild type.

בכל התנאים שנבדקו כדי לקבוע את קינטיקת הצמיחה בצעד אחד (one step growth kinetics) של ייצור נגיפים, התאים שלנו הוזhקו בריבוי זיהום (multiplicity of infection) של 10, או על ידי זן הבר (wild type), או על ידי הווריאנט בעל הנאמנות הגבוהה A 3 72 V, או על ידי הווריאנט עם הליקוי בשכפול CX 64 של נגיף Cox AKI virus B three. בנקודות הזמן המצוינות, נאספו צאצאי הנגיפים מהתאים ומהעלים על ידי הקפאה והפשרה (freeze thaw) ונמדדו על ידי TC ID 50. העלייה בנאמנות של A 3 72 V אינה מלווה בליקוי שכפול ניכר בתרבית רקמות. הווריאנט CX 64 מציג עיכוב משמעותי בקינטיקת השכפול ומגיע לטיטרים מקסימליים הנמוכים פי 1000 מאלו של נגיף הבר.

בשימוש בגישה המתוארת בסרטון זה, כל שיבוט שעובר ריצוף מקורו בגנום ייחודי בתוך אוכלוסיית הווירוס הכוללת, ולפיכך הוא יישא מוטציות ייחודיות. איור זה מציג יישור טיפוסי לאחר ניקוי של רצפים באיכות נמוכה וויזואליזציה של פולימורפיזם של נוקלאוטיד בודד. סך פולימורפיזמי הנוקלאוטיד הבודד בתוך אוכלוסייה חושב, ומספר פולימורפיזמי הנוקלאוטיד הבודד המופיעים בכל שיבוט נרשם.

לדוגמה, השיבט המסומן בקו תחתון מכיל שתי מוטציות ייחודיות, בעוד ששמונה שיבטים אחרים מכילים מוטציה ייחודית אחת. נתונים אלו משמשים לעריכת טבלה כזו המוצגת כאן. הטבלה מציגה את התפלגות הדירוג של השיבטים שרצפו לפי מספר המוטציות.

השוואה סטטיסטית של ערכים מדורגים יכולה לקבוע האם התפלגות אחת שונה באופן מובהק מאחרת. לצורך פרשנות קלה יותר, ניתן להציג את הנתונים המספריים שהתקבלו מאנליזת הרצפים והניתוח הסטטיסטי כתרשים או כהיסטוגרמה. כפי שמוצג כאן, נגיף ה-A 3 72 V מייצר פחות מוטציות מאשר סוג הבר (wild type) ומציג תדירות מוטציות נמוכה באופן מובהק עם ערך P נמוך מ-0.01.

אותה אוכלוסייה של נגיף ganga בעוף מניבה תדרי מוטציות דומים, בין אם משתמשים במאגר הנגיף ובין אם בדילול של 10⁵ לצורך בידוד ה-RNA. לכן, לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע בדיקות ביוכימיות in vitro או מחקרי קריסטליזציה כדי להבין טוב יותר את הבסיס המכניסטי והמבני של הנאמנות (fidelity) בגרסה זו של הפולימראז.

לאחר פיתוח זה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה לבחון את המתאם בין גיוון גנטי לבין כושר ההישרדות (fitness) של נגיפים in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להגדיל את הסיכויים לבידוד של וריאנטים של נאמנות (fidelity variants) של נגיפי RNA, וכיצד להשתמש בתדירויות מוטציות כדי לזהות הבדלי נאמנות אלו.