Name: יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים הדמיה 3D ו ניתוח מורפולוגי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: למד שיטת יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים לצורך הדמיה תלת-ממדית וניתוח מורפולוגי. טכניקה זו מאפשרת חקירת מבנה כלי הדם המוחיים באמצעות מיקרוסקופיה וסריקת CT.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים וולטייר Gungab לסיוע בהכנת כתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות: המכון הלאומי לבריאות (T32 GM008440 אל EJ ווקר, R01 NS27713 אל WL יאנג, P01 NS44155 אל WL צעירים וה &#39;סו), וכן R21 NS070153 ל ח סו וכן האמריקאי Heart Association (AHA 10GRNT3130004 ל ח סו).

1. ניקוי דם מן vasculature <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר בזריקה intraperitoneal של קטמין מ"ג / ק"ג עם 100 xylazine מ"ג / ק"ג 10 בדילול מלא מלוחים 0.25 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה אושרה על ידי תשובה לצבוט כף יד, שימוש במספריים לעשות חתך לרוחב החזה עם מספריים, ממש מתחת תהליך xyphoid, לחתוך דרך הסרעפת, ולחתוך בין קטע הגבי ו הגחון של בית החזה כדי לחשוף חלל בית החזה. לחשוף לב על ידי קיפול עד עצם החזה והחזה סמוך ובטוח עם hemostat. פתח את שק קרום הלב עם פינצטה כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה זלוף (100mmHg לחץ) מחובר חם PBS בתוספת הפרין (5 יחידות / מ"ל) פתרון באמבט מים חמים על 37 מעלות צלזיוס, צינורות עם מחט 22 קהה מד על יצוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי, קרוב לשיא של הלב. מיד לחתוך לפתוח את אטריום הזכות לאפשר יצוא דם מערכתית להמשיך שטיפה עד דם אניs הוסר מן המחזור. </li></ol> 2. זלוף של סוכן יציקה לתוך מערכת כלי הדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Microfil (תזרים טק, Inc קארבר, MA) פתרון הליהוק לכל פרוטוקול של היצרן: מערבבים 5 מ"ל של diluent MV עם 4 מ"ל של המתחם MV מסונן. הוסף 450μl (5%) של זרז (סוכן MV ריפוי). זמן הפתרון הוא עובד 20 דקות, אבל לערבב מיד לפני השימוש כדי להבטיח צמיגות תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משיכה הליהוק פתרון סוכן לתוך מזרק 10 מ"ל, לצרף מחט קהה 20 לאמוד את המזרק ומלא מחט עם פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט לתוך החדר השמאלי דרך אותו חור המשמש הסמקה הדם. מחט Secure למקום עם מהדק hemostat על הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק סוכן פתרון הליהוק לאט לתוך החדר השמאלי על כ 3 מ"ל / דקה. לחץ עודף עלול להוביל זרימה נכונה של סוכן יציקה או קרע כלי פוטנציאליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תראה סימנים של זלוף מוצלח, כולל: ויזואליזציה של השחקניםing סוכן vasculature המעי והכבד, שינוי צבע האיבר הדיסטלי, ואת האף ושינויי צבע הלשון. להסתגל מחט ואם יש צורך להשיג זלוף תקין. </li></ol> 3. איסוף ועיבוד של רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח ומכניסים paraformaldehyde 4% בין לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים המוח על ידי הנחת מן paraformaldehyde ישירות EtOH מרוכז יותר ויותר בטמפרטורת החדר: 25% EtOH, 1 יום, 50% EtOH, 1 יום, 75% EtOH, 1 יום, 95% EtOH, 2 ימים, ו -100% EtOH, 2 ימים . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את רקמת המוח סביב כלי הדם ידי טבילה המוח perfused ב salicylate מתיל עבור 2 ימים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכלי הדם של המוח כולו הבהיר unsectioned ניתן הדמיה עם המוח שקוע salicylate מתיל תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 1) (לייקה MZFL מיקרוסקופ השלישי, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) או מיקרוסקופ brightfield (איור 2) (לייקה DM / LS, Leica Microsystems). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Reclarificationניתן לעשות זאת אם הרקמה לא מנוקה לחלוטין. מ סליצילט המוח מתיל העברה, כדי EtOH 95% 2 ימים, 100 EtOH% עבור 2 ימים, salicylate מתיל עבור 2 ימים. </li></ol> 4. Micro-CT או הדמיה הכנה היסטולוגית Application-רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח יכול להיות צילמו באמצעות מיקרו-CT מיד לאחר הבהרה או לאחר הידרציה מחדש (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את רקמת המוח לניתוח היסטולוגית, רעננותם המוח דרך EtOH בדילול סידורי: 100% EtOH, 1 יום, 95% EtOH, 1 יום, 75% EtOH, 1 יום, 50% EtOH, 2 ימים, 25% EtOH, 2 ימים וכן חנות PBS. המוח יכול להיות מוטבע פרפין באמצעות הליך רגיל. </li></ol> 5. נציג תוצאות בעקבות הליהוק וסקולרית, cerebrovasculature ניתן לראות macroscopically על פני המוח (Fig.1A). העץ כלי דם בתוך parenchyma ניתן הבהרה בעקבות דמיינו (איור 1B). מבנה כלי הדם מפורטניתן הדמיה וניתח תחת מיקרוסקופ brightfield (איור 2), לנתח היקף (איור 3), ועם מיקרו סריקת CT (איור 4). באמצעות מיקרוסקופ brightfield, vasculature ניתן לראות מטוסים מוקד שונים ללא חתך את המוח (איור 2 א) וכן microvessels הפרט בהגדלה גבוהה יותר (איור 2 ב). תחת בהיקף לנתח, אפשר לראות את מבנה כלי הדם כולה במישור מיקוד אחת, דבר המאפשר הדמיה טובה יותר של מבנה תלת מימדי של cerebrovasculature (איור 3). תמונות שצולמו במיקרוסקופ יכול להראות לנתח מורפולוגיה כלי שיט גדולים vasculature המוח כולו, אבל חוסר הפרטים המוצגים בתמונות שצולמו במיקרוסקופ brightfield (איור 2 ב). טכניקה זו אפשרה לנו לזהות כלי סדיר במודל ניסיוני מבוגר שלנו עכבר BAVM 2. איור 5 מציג דוגמה של כלי סדיר באותו זוהה על ידי מיקרו סריקת CT (איור 5 א) ו - מיקרוסקופ brightfield (איור 5 ב). יחד, נתונים אלה מראים כי אנו יכולים לנתח tהוא מדגם זהה עם כלי הדמיה מרובים לאחר הליהוק של כלי הדם. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig1.jpg"> באיור 1. במוח העכבר שלמים הבאים הליהוק כלי הדם. לפני (א) ולאחר בירור (ב ') על ידי salicylate מתיל ממס. כלי ניתן דמיינו בבירור על פני השטח המוח (א) ו בהליך בירור parenchyma הבאים (B). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig2.jpg"> 2. איור מיקרוסקופ brightfield תמונות של המוח הבהיר casted וסקולרית. המוח ניתן הדמיה על מטוסים שונים ברמות הגדלה שונות. סולם בר 200μm (א) ו 50μm (B). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig3.jpg"> באיור 3. הביתור תמונת מיקרוסקופ על 1x מראה מבוגר כל עכבר cerebrovasculature המוח מתצוגה הגבי. &lt;img alt = "איור 4" src = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" /&gt; איור 4. Micro-CT סריקת תמונה של המוח המבוגר אותו כל עכבר שמוצג באיור 3 מתצוגה הגבי. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/2958/2958fig5.jpg"> איור 5. היישום של שיטת הליהוק כלי הדם לזהות מום arteriovenous המוח. א) Micro-סריקת CT של המוח casted כלי הדם מראה מוגדל של האזור, AVM, כמו כלי סדירה האונה הימנית מתצוגה הגחון. תמונה מוגדלת של האזור (קופסה לבנה) מוצגת בצד ימין. ב) כלי סדיר דמיינו אותו תחת מיקרוסקופ brightfield בהגדלה 50x. סולם בר 50 מיקרומטר.

<ol><li>Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+in+vivo+muCT+evaluation+of+neovascularisation+in+tissue+engineered+bone+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs.</a> Bone. 43, 195-202 (2008).</li>
<li>Walker, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriovenous+malformation+in+the+adult+mouse+brain+resembling+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease.</a> Ann. Neurol. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Iqbal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+novel+mono-+and+multivalent+VHH-fragments+and+their+application+for+molecular+imaging+of+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).</li>
<li>Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+recovery+after+simultaneous+transplantation+with+neuro-epithelial+stem+cells+and+adjacent+mesenchymal+tissues+into+infarcted+rat%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat.</a> 145, 473-480 (2003).</li>
<li>Chugh, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cerebral+blood+volume+in+mouse+brain+regions+using+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography.</a> Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).</li>
<li>Marxen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med. Phys. 31, 305-313 (2004).</li>
<li>Barger, A. C., Beeuwkes, R., 3rd, L. ainey, L, L., Silverman, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis%3A+vasa+vasorum+and+neovascularization+of+human+coronary+arteries.+A+possible+role+in+the+pathophysiology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis.</a> N. Engl. J. Med. 310, 175-177 (1984).</li>
<li>Fossett, D. T., Caputy, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFossett%2C+DT+%22Operative+Neurosurgical+Anatomy%22">Operative Neurosurgical Anatomy</a>. , Thieme Medical Publishers. New York. (2002).</li>
<li>Reynolds, D. G., Brim, J., Sheehy, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+architecture+of+the+small+intestinal+mucosa+of+the+monkey+%28Macaca+mulatta%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">The vascular architecture of the small intestinal mucosa of the monkey (Macaca mulatta).</a> Anat. Rec. 159, 211-218 (1967).</li>
<li>Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+size+of+bronchopulmonary+anastomoses+in+sheep+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A.+Discov.+Mol.+Cell.+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung.</a> Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).</li>
<li>Brady, J. M., Cutright, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+of+measuring+blood+vessel+volume+in+bone+applied+to+the+mandible+and+humerus+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">A new technique of measuring blood vessel volume in bone applied to the mandible and humerus of the rat.</a> Anat. Rec. 170, 143-146 (1971).</li>
<li>Evan, A. P., Dail, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efferent+arterioles+in+the+cortex+of+the+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney.</a> Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).</li>
<li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li>
</ol>

הפרוצדורות לשימוש בחיות מעבדה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש מאוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו (UCSF).

אנו מדווחים כאן שיטה ליציקת cerebrovasculature של עכבר בוגר שעשויים להיות צילמו עם שיטות שונות. יישום של שיטה זו על BAVM המודל מאפשר ניתוח 3D מחלה של כלי סדיר. מחקרים עתידיים אפשריים כוללים כימות של מיקרו-CT תמונות, ניתוח היסטולוגית של רקמה, ואבחון של התקדמות מחלת כלי דם. בעיות נפוצות נתקל והצעות זלוף מלאה של כלי הדם במוח לא תמיד מושגת. לאחר לחץ מספיק כדי להגיע לכלי הדם דיסטלי ללא פקיעת אבי העורקים אטריום שמאלה או אתגר. כדי להתגבר על זה, להפעיל לחץ עקבי של כ 100mmHg. כמו כן, להתאים את מיקום המחט על מנת להבטיח יצוא מתאים הליהוק של סוכן אל תוך אבי העורקים. חשוב עורקי הראש אינן מוגבלות כל כך הסוכן הליהוק יכול להגיע כלי המוח. נהלים קריטי כי לתאם עם כלי קטן משופרת לכלהיתוך הם: (1) ניקוי נאות של הדם בכלי הדם מתוך: (2) סינון של הסוכן הליהוק; ו (3) מיקום המחט בזמן זריקה למלהק. יש להקפיד להימנע הזרקת הליהוק סוכן אל המבואה ריאה שמאל. חוקרים אחרים perfused בהצלחה העכבר 3 ו -4 cerebrovasculature עכברוש ללא שימוש נהלים נוספים. ניתוח ידניים כלי perfused Microfil counterstained עם hemotoxylin הראה 93 כלי% זלוף לומן 5. תמיד להתעלם לחלוטין או לנקות כל כלי בא במגע עם סוכן הליהוק, כפי שיופיע לפלמר במהירות, וכלים לא יכולה לשמש בנושאים רבים. הבהרה של הרקמה הסובבת במוח העכבר יכול להיות מאתגר. לאחר טבילה salicylate מתיל, הרקמה עדיין עשויים להיראות אטום, מה שהופך הדמיה כלי הקשה. הבטחת התייבשות בירור ראוי וצריך לפתור את הבעיה הזו. הצבת ברקמת המוח על כיסא נדנדה במהלך אלכוהול מתיל sהטיפול יכול לשפר alicylate הבהרה רקמות. החסרונות של טכניקת המגבלות של טכניקה זו כוללים: (1) יש צורך להזריק את הפתרון למלהק מיד לאחר ערבוב זה כמו שזה יהיה לעבות במהירות לאחר זרז נוסף, (2) סוכן הליהוק ממלא כלי מוליכות גדולים בקלות, אבל זה לא למלא כלי אמין יותר, כגון arterioles (כלי התנגדות) נימים (כלי התזונתי); ו (3) זה לא בניגוד radiopaque הטוב ביותר עבור מיקרו CT הדמיה, למרות קבוצות שמעדיפים Microfil עבור מיקרו CT הדמיה 1,6. עם זאת, בעקבות הצעות המוצע לעיל, כולל מיקום המחט תקין, עמדה הספינה ולחץ זלוף, יציקה מלאה של כלי קטן יכולה להיות מושגת. הסתגלות כלי ניתוח שונים עושה את זה סוכן כלי חשוב לניתוח מבנה מוחי, כולל במחזור עורקי וורידי, עם שונותפרספקטיבות. יישומים של טכניקת היתרון של שיטה זו הוא פוטנציאל היישום הרחב. צוות השחקנים ממלא את כל הכלים, כולל עורקים, ורידים, נימים של רקמה בתוך כל הגוף, כך מבנים כלי דם באיברים שונים של מינים שונים ניתן לנתח. בעבר, קבוצות אחרות השתמשו זלוף עבור 8 כלי גדול 7 וקטנים אדם, קוף 9, 10 כבשים, חולדה 4,11,12, ועכבר 3,13. אנו מציגים כעת עדות באמצעות טכניקה זו בניתוח מבנה microvessels במוח העכבר, במדינות שניהם בריאים וחולים 2. בנוסף, ישנם פתרונות Microfil עם viscosities שונים זמינים perfuse כלי בגדלים שונים וצבעים שונים על מנת לשפר את ההדמיה של כלי לאיברים שונים. לדוגמה, אדום ניתן דמיינו בקלות parenchyma המוח חיוור, צהוב ניגודים היטב עםאדום כהה שריר הלב. יתר על כן, החומר הוא radiopaque, vasculature ניתן הדמיה עם מיקרו-CT סריקה כדי לקבל תמונה rotatable 3D. הרקמה יכול לשמש גם עבור חלקים פרפין וניתוח היסטולוגית לאחר הדמיה. מסקנה אנו מדגימים כאן פרוטוקול לעשות יצוק כלי הדם של כלי הדם של המוח עכבר מבוגר, אשר ניתן להתאים באמצעות מגוון של טכניקות ניתוח כדי ללמוד את המבנה המורפולוגי של cerebrovasculature. יש לנו גם סיפק עדויות ליישום שיטה זו מודל של המדינה המחלה BAVM, המיוצג על ידי כלי מוגדל צורה אסימטרית כי המחלף דם עורקי וורידי תפוצה. יש מגוון של שיטות הליהוק וסקולרית זמין. פרוטוקול פשוט אנו מספקים כאן בגבס כלי הדם עשויים לשמש ככלי לבחון את כלי הדם של המוח המבוגר העכבר באמצעות שיטות הדמיה שונות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות </td></tr><tr><td> Microfil </td><td> FlowTech, Inc </td><td> MV130 </td><td> 4 חודשים חיי מדף </td></tr><tr><td> מתיל Salicylate </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> O3695-500 </td><td> כדי להבהיר רקמה </td></tr></tbody></table>

יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים הדמיה 3d ו ניתוח מורפולוגי

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

דם הדמיה היא קריטית באבחון וניהול קליניים של מחלות כלי דם במוח, כגון מומים במוח arteriovenous (BAVMs). במודלים של בעלי חיים נחוצים לחקר טיפולים etiopathology ואת הפוטנציאל של מחלות כלי דם במוח. דימות vasculature בבעלי חיים גדולים יחסית קל. עם זאת, בפיתוח שיטות הדמיה של כלי מודלים המחלה Murine המוח רצוי בשל העלות והזמינות של גנטית שונה קווי העכבר. הדמיה העץ Murine כלי הדם המוחיים היא אתגר. בבני אדם ובבעלי חיים גדולים יותר, תקן הזהב להערכת angioarchitecture ב macrovascular (מוליכות) רמה רנטגן קטטר בניגוד מבוססי אנגיוגרפיה, שיטה לא מתאים מכרסמים קטנים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה של ​​יציקת מוחי שמייצר שלד עמיד המיטה כלי דם, כולל עורקים, ורידים, נימים, כי יכול להיות מנותח באמצעות d רביםifferent לאופנים. הליהוק השלם של microvessels cerebrovasculature של העכבר יכול להיות קשה, אך אתגרים אלה מופנים בפרוטוקול צעד אחר צעד זה. באמצעות זלוף intracardial החומר הליהוק כלי הדם, כלי כל הגוף הם casted. המוח לאחר מכן ניתן להסיר הבהיר באמצעות salicylate מתיל ממס אורגני. שלושה ממדי הדמיה של כלי הדם במוח ניתן דמיינו פשוט ובזול עם מיקרוסקופ כל brightfield קונבנציונלי או ביתור מיקרוסקופ. Cerebrovasculature casted יכול להיות גם צילמו לכמת באמצעות מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת (CT מיקרו) 1. בנוסף, לאחר הדמיה, המוח casted יכול להיות מוטבע פרפין לניתוח היסטולוגית. היתרון של שיטה זו הליהוק וסקולרית לעומת טכניקות אחרות, הוא הסתגלות הרחב לכלים אנליטיים שונים, לרבות ניתוח brightfield מיקרוסקופיים, סריקת CT עקב המאפיינים radiopaqueteristic של החומר, כמו גם ניתוח היסטולוגית ו immunohistochemical. זה ניצול יעיל של רקמות יכול לחסוך את השימוש בבעלי חיים ולהפחית עלויות. הוכחנו לאחרונה יישום של שיטה זו כדי להמחיש את כלי הדם לא סדיר במודל של עכברים של BAVM מבוגר ברמה מיקרוסקופית 2, ולספק תמונות נוספות של כלי פגום הדמיה על ידי מיקרו CT. אף על פי שיטה זו יש חסרונות ולא יכול להיות אידיאלי עבור כל סוגי הניתוחים, היא טכניקה פשוטה, מעשית זה ניתן ללמוד בקלות מיושמים באופן נרחב על הליהוק של כלי הדם של כלי הדם בכל הגוף.

במאמר זה, אנו מציגים טכניקה פשוטה, מעשית ליציקת כלי דם במוח כי הוא קל לביצוע, יכול להיות מנוצל על התמונה עץ כלי דם של המוח עכבר מבוגר.

יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים הדמיה 3D ו ניתוח מורפולוגי

הדמיה של כלי דם היא קריטית לאבחון הקליני ולניהול של מחלות צרכליות (cerebrovascular diseases), כגון מלפורמציות עורקיות-ורידיות במוח (BAVMs).

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדמיות תלת-ממדיות של כלי הדם המוחיים בעכבר בוגר. הדבר מושג תחילה על ידי פתיחת חלל בית החזה וניקויי כל הדם מכלי הדם באמצעות פרפוזיה תוך-פיתה של PBS עם heparin; לאחר הפרפוזיה, מוזרק חומר יציקה לחדר השמאלי כדי לבצע פרפוזיה למערכת הדם כולה. לאחר מכן, המוח שעבר פרפוזיה מוצא ומוקבע ב-Paraformaldehyde.השלב האחרון של הפרוצדורה הוא דהידרטציה והבהרה של רקמת המוח באמצעות אתנול ומתיל סליסילאט. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות מוח של עכבר שקוף, שניתן לדמות את עץ כלי הדם שלו תחת מיקרוסקופ שדה בהיר או מיקרוסקופ דיסקציה, ובאמצעות סריקת micro CT. שלום, שמי ספן ווקר מאוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו.היום נבצע יציקה של מערכת כלי הדם במוחו של עכבר בוגר. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אנגיוגרפיה, הם שניתן ליישמה בבעלי חיים קטנים כגון עכברים. אין צורך בחומרים רדיואקטיביים, וההליך לביצוע הוא פשוט יחסית.דבר זה הוביל להתאמה של כלים אנליטיים שונים, כולל מיקרוסקופיה בשדה בהיר (brightfield), סריקת CT, בשל תכונותיו הרדיואופקיות של החומר, וכן ניתוח היסטולוגי ואימונוהיסטוכימי. אוקיי, בואו נתחיל. הרדימו את העכבר באמצעות הזרקה תוך-פריטונית של ketamine ו-xylazine המדוללים בתמיסת סלין, ואשרו הרדמה מלאה באמצעות צביטה בכף הרגל.לאחר שהאלחוש אושר, השתמש במספריים כדי לבצע חתך לרוחב החזה, ממש מתחת לתהליך החרב (xiphoid process). לאחר מכן, גזור דרך הסרעפת ואז כלפי מעלה בין המקטע הגבי למקטע הבטני של כלוב הצלעות. כדי לחשוף את חלל בית החזה, קפל כלפי מעלה את עצם החזה ואת דופן החזה הסמוכה וקבע אותם באמצעות המוסטט כדי לחשוף את שק פריקרד.לאחר מכן, פתחו את שק העטיפה של הלב (pericardial sac) באמצעות פינצטה במידת הצורך כדי לחשוף את הלב. כאשר משאבת הפרפוזיה מכוונת ל-100 millimeters of mercury, התחילו בביצוע פרפוזיה של PBS בתוספת five units per milliliter של heparin המחומם ל-37 degrees Celsius. הכניסו את המחט הקהה במידה 22 gauge המחוברת למוצא המשאבה אל תוך החדר השמאלי בקרבת חוד הלב. גזרו מיד.פתחו את העלייה הימנית כדי לאפשר זרימה החוצה של הדם הסיסטמי והמשיכו בשטיפה עד להסרת הדם ממערכת הדם. ראשית, הכינו תמיסת חומר יציקה על ידי ערבוב של 5 mL מהמדלל עם 4 mL מהתרכובת המסוננת. לאחר מכן, הוסיפו 450 µL של חומר מקשה והקפידו להשתמש בתמיסת חומר היציקה בתוך 20 דקות.ערבבו את תמיסת חומר היציקה ישירות לפני השימוש. כדי להבטיח צמיגות נכונה, שאבו את תמיסת חומר היציקה למזרק של 10 milliliter. חברו למזרק מחט קהה במידה של 20 gauge ומלאו את המחט בתמיסה.החדירו את המחט לחדר השמאלי דרך אותו חור ששימש לשטיפת הדם, ולאחר מכן קבעו את המחט במקומה באמצעות תפס המוסטט. הזריקו לאט ידנית את תמיסת חומר היציקה לתוך החדר השמאלי בקצב של כ-three milliliters per minute, שכן לחץ עודף עלול להוביל לזרימה שגויה או לקרע פוטנציאלי בכלי דם במהלך ההזרקה. חפשו סימנים לפרפוזיה מוצלחת, כולל ויזואליזציה של חומר היציקה בכלי הדם של המעי והכבד, שינוי צבע של הגפיים הדיסטליות ושינוי צבע של האף והלשון. כווננו מחדש את המחט במידת הצורך כדי להשיג פרפוזיה תקינה.יש להוציא את המוח ולהניחו ב-4% paraform aldehyde למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש לבצע דהידרטציה למוח במהלך שבעה ימים על ידי הנחתו ישירות באתנול בריכוזים עולים בטמפרטורת החדר, החל מ-25% ethanol ביום הראשון. לאחר השלמת הדהידרטציה, יש לבצע הבהרה (clarification) של רקמת המוח מסביב לכלי הדם על ידי טבילת המוח שבוצע לו פרפוזיה בתוך methyl salicylate למשך יומיים בטמפרטורת החדר; לאחר יומיים, ניתן להדמיא את מערכת כלי הדם של המוח המובהר כולו ללא חיתוך באמצעות טבילה ב-methyl salicylate תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (bright field), כמו גם תחת מיקרוסקופ דיסקציה או סריקת micro CT. באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר, ניתן לצפות במערכת כלי הדם במישורי מוקד שונים ללא צורך בחיתוך המוח, וכן בכלי דם מיקרוסקופיים בודדים בהגדלה גבוהה יותר.מוצג כאן בפאנל התחתון. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting scope), ניתן לראות את כל מבנה כלי הדם המוחיים במישור מוקד אחד, מה שמאפשר ויזואליזציה טובה יותר של המבנה התלת-ממדי שלהם. תמונה זו מציגה את המורפולוגיה של כלי דם גדולים ואת כל רשת כלי הדם במוח, אך חסרים בה הפרטים המוצגים בתמונות שצולמו במיקרוסקופיה בשדה בהיר (brightfield microscopy).סריקת Micro CT מאפשרת ויזואליזציה בתלת-ממד של כלי הדם ומאפשרת בנייה של מודלים תלת-ממדיים הניתנים לסיבוב. כדי להמחיש את ויזואליזציית כלי הדם, מוצג כאן מבנה כלי דם מוחי חריג שזוהה באמצעות Micro CT, המקביל לתמונה של אותה מלפורמציה של כלי הדם במיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield). יחד, נתונים אלו מראים שניתן לנתח את אותה דגימה באמצעות כלי דימוג מרובים לאחר יציקת כלי הדם.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן יציקת כלי הדם של מוח עכבר בוגר באמצעות תמיסת Microfill. הליך זה כולל פינוי דם ממערכת כלי הדם, הזרקה תו-חדרית של תמיסת Microfill, איסוף ועיבוד של מוח העכבר הבוגר, והדמיה של כלי הדם המוחיים באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר (brightfield microscopy). המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות בכלי הדם של מוח עכבר בוגר בתלת-ממד.

cerebrovascular-casting-adult-mouse-for-3d-imaging-morphological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מציגים שיטה ליצירת חלון הדמיה בגולגולת העכבר החובקת מילימטרים והוא יציב במשך חודשים ללא דלקת של המוח. שיטה זו גם מתאים מחקרים ארוכי טווח של זרימת דם, דינמיקה סלולריים, ותא / מבנה כלי הדם באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

סרטון זה מציג הליך כירורגי להשתלת חלון גולגולתי במודל עכבר לגישה אופטית יציבה לאזורים שונים במוח.

השתלת חלון הדמיה גולגולתי במודל עכבר: הליך כירורגי להשתלת כיסויים מבוססי זכוכית לגישה אופטית יציבה לאזורים במוח מורין

מקור: Choi, J. P.  ואחרים. אינדוקציה והדמיית מיקרו-CT של מומים במערות המוח במודל עכבר. J. Vis. exp. ( 2017)} סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיית מיקרו-CT כדי להמחיש נגעים של מום מערות מוחי (CCM) במוח של עכבר. הוא מפרט את השלבים להכנת דגימה, הדמיה ושחזור תמונה תלת מימדית כדי להעריך את הצפיפות והמיקום של נגעי CCM ברקמת המוח.

הדמיית מיקרו-CT משופרת ניגודיות של נגעי מום במערות המוח במוח עכבר

באמצעות סריקות MRI (אנושיות), תוכנת הדמיה תלת-ממדית וניתוח אימונוהיסטולוגי, אנו מתעדים שינויים בחדרים הצדדיים של המוח. מיפוי תלת מימד אורכי של שינויים בנפח החדר הצדדי ואפיון של שינויים תאיים סביב החדר המתרחשים במוח האנושי עקב הזדקנות או מחלה מודלים לאחר מכן בעכברים.

3D דוגמנות של רוחב החדרים והיסטולוגית אפיון רקמות סביב חדרי מוח בבני אדם ועכבר

באמצעות מספר זוויות לחתוך את מוח גור עכבר, אנחנו לשפר פרוסת מוח חריפה שתואר אשר לוכדת את הקשרים בין רוב מבני המוח התיכון והמוח הקדמי השמיעתיים המרכזיים.

שינוי של Colliculo-thalamocortical עכבר המוח פרוסה, שילוב הדפסת 3-D של לשכת רכיבים ודימות אופטי רב בקנה מידה

כתב יד זה מתאר הליך לעקוב אחר השיפוץ של cerebrovasculature במהלך הצטברות פלאק עמילואיד in vivo באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ אורך. הכנה הגולגולת דליל מאפשר הדמיה של צבעי ניאון כדי להעריך את התקדמות הנזק כלי דם במוח במודל של עכברים של מחלת אלצהיימר.

אֹרכִּי<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

פרוטוקול זה מדגים את תנאי הגיוס של מחלה מוחית מום חלול במודל של עכברים, שימושים חדות משופרת מיקרו טומוגרפיה כדי למדוד את הנגע הנטל. שיטה זו מגבירה את הערך של העכבר ויצר מודלים ללמוד את הבסיס המולקולרי של טיפולים פוטנציאליים חלול מום מוחי ומחלות אחרות כשאבדן.

אינדוקציה והדמיה מיקרו-CT של המוח מומים חלול במודל עכבר

המטרה של טכניקה זו היא הדמיה ex vivo של רשתות עורקים ריאתיים של עכברים פוסט לידתיים ומבוגרים מוקדם באמצעות אינפלציה ריאות והזרקה של תרכובת פולימר אטומה רדיו באמצעות עורק הריאה. יישומים פוטנציאליים עבור רקמות יצוקות נדונים גם.

יציקת כלי דם של ריאות עכבר מבוגר ומוקדם לאחר הלידה עבור הדמיית מיקרו-CT

מחקר זה מתאר את השלבים להשגת תמונות ברזולוציה גבוהה של מוחות עכבר בילודים על ידי שילוב טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT) וסוכן ניגוד בדגימות ex vivo . אנו מתארים ניתוחים מורפומטריים בסיסיים כדי לכמת את גודל המוח וצורתו בתמונות אלה.

הדמיית מיקרו-CT וניתוח מורפומטרי של מוחות יילודים בעכברים

שיטת המחט של היצרות עורק הצוואר המשותף הדו-צדדית הא-סימטרית מוצעת ליצירת מודל עכבר לפגיעה קוגניטיבית בכלי הדם ודמנציה. זה מביא לתוצאות ארוכות טווח בהשוואה למודלים שנקבעו בעבר ותואם ל-MRI חי. ייצוג חזותי המדגים את ההליך מספק הנחיות לשליטה בניתוח.

מודל עכבר לליקוי קוגניטיבי וסקולרי ודמנציה המבוסס על היצרות עורק צוואר משותף דו-צדדי אסימטרי מונחה מחט

מיקרוסקופיה תוך-ויטלית מאפשרת לחקור תהליכים ביולוגיים דינמיים כגון התחדשות רקמות והתפתחות גידולים. מח העצם הגולריאלי, רקמה דינמית ביותר, מציע תובנות לגבי המטופואיזיס ותפקוד כלי הדם. שימוש בשתל קיבוע ראש מודפס בתלת מימד תואם ביולוגית מאפשר הדמיה אורכית חוזרת, ומשפר את ההבנה שלנו לגבי דינמיקת הרקמות ומיקרו-סביבת הגידול.

הדמיה אורכית תוך-חיונית של דינמיקת כלי הדם במח העצם הגולגולתי

למד שיטת יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים לצורך הדמיה תלת-ממדית וניתוח מורפולוגי. טכניקה זו מאפשרת חקירת מבנה כלי הדם המוחיים באמצעות מיקרוסקופיה וסריקת CT.

יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים הדמיה 3D ו ניתוח מורפולוגי

גלה סרטונים נוספים