תרבית חוץ גופית והתמיינות של מונוציטים ראשוניים למקרופאגים

מונוציטים הם תאים חיסוניים המתמיינים למקרופאגים ותאים דנדריטיים המציגים אנטיגן כדי להגן מפני זיהום.

כדי לגדל מונוציטים ולגרום להתמיינות שלהם במבחנה, התחל בלקיחת השעיה של מונוציטים אנושיים ראשוניים במדיום תרבית מתאים. הוסף את מתלה התאים לבארות של צלחת תרבות. דגירה בתנאים פיזיולוגיים כדי לאפשר לתאים להיצמד.

הוסף ציטוקינים מעוררי התמיינות - גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים, או GM-CSF, לבאר אחת וגורם מגרה מושבת מקרופאגים, או M-CSF, לאחר. דגירה למשך זמן מתאים.

GM-CSF נקשר לקולטן ההטרודימרי שלו על התאים וגורם להתמיינות של המונוציטים. קשירת GM-CSF מביאה להפעלת מסלולי איתות תוך-תאיים, מה שמוביל לביטוי גנים להתחלה לפנוטיפ דמוי מקרופאג M1.

התאים דמויי M1 - תאים מעוגלים עם נפח ציטופלזמי גדול - הם פרו-דלקתיים ומסייעים בהגנה מפני זיהום.

בבאר השנייה, ה-M-CSF נקשר לקולטן ההומודימרי שלו על המונוציטים וגורם להתמיינות התאים. קשירת M-CSF מביאה להפעלה של מסלולי איתות תוך תאיים שונים מ-GM-CSF, מה שמוביל לביטוי גנים להתחלה לפנוטיפ דמוי מקרופאג M2.

התאים דמויי M2 - בעלי צורה מוארכת - הם אנטי דלקתיים ומציגים פונקציות של שיפוץ ותיקון רקמות.

תאי המקרופאגים הממוינים מוכנים לבדיקות נוספות במורד הזרם.

לאחר הספירה, השעו מחדש את המונוציטים המבודדים ב-1 כפול 10 עד שישי תאים למיליליטר של 37 מעלות צלזיוס ללא סרום RPMI 1640 בתוספת אנטיביוטיקה, וצלחו 1 מיליליטר של תאים מושעים מחדש לצלחות של 35 מילימטר בארון בטיחות ביולוגית. לאחר מכן, הניחו את הצלחות בחממת תרבית התאים למשך 30 עד 60 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד לתחתית הבאר.

כדי להכין מקרופאגים עם פנוטיפ דמוי M1, הוסף 100 מיקרוליטר של סרום בקר עוברי המכיל 25 ננוגרם למיליליטר של GM-CSF לכל צלחת. כדי להכין מקרופאגים עם פנוטיפ דמוי M2, הוסף 100 מיקרוליטר של בקר עוברי המכיל 50 ננוגרם למיליליטר M-CSF לכל צלחת.