בידוד לימפוציטים ממדבקה של עכבר

מדבקות פייר, PPs, אגרגטים של רקמות לימפה מאורגנות בדופן המעי הדק, מכילות תאים חיסוניים כולל לימפוציטים B, לימפוציטים T, תאים דנדריטיים ומקרופאגים.

כדי לבודד לימפוציטים מ-PPs של עכברים, התחל עם עכבר שעבר המתת חסד. חותכים את דופן הבטן וחושפים את חלל הצפק. אתר את הצקום. נתח את הצומת האילאוצקלי כדי להפריד את הצקום מהמעי הדק.

כרתו את המזנטריה וחתכו את המעי הדק בתריסריון כדי להסיר את המעי הדק מחלל הצפק. מניחים את המעי הדק בצלחת מרובת בארות המכילה מדיום צונן ושוטפים כדי להסיר פסולת.

מקם את המעי הדק כשהצד המזנטרי פונה כלפי מטה, והרטיב במדיום כדי לשמור על לחות הרקמות. זהה את ה-PPs - אגרגטים לבנים מרובי אונות בצד האנטי-מזנטרי של דופן המעי.

כרתו בזהירות את ה- PPs, למעט רקמת המעי שמסביב. מעבירים לצינור המכיל מדיום. דגירה תחת תסיסה מתמדת. שלב תסיסה זה מנתק את הריר, פסולת התאים וכל חומר צואתי מה-PPs, ובכך משפר את ההתאוששות של לימפוציטים PP.

לאחר מכן, העבירו את הרקמה למסננת תאים בגודל רשת מתאים. לשבש בעדינות את ה-PPs ולשחרר תאים. יש לשטוף עם מדיום דרך המסננת כדי לקבל תרחיף לימפוציטים חד-תאיים. צנטריפוגה את המתלה בטמפרטורה נמוכה כדי לשמור על יציבות התא.

השהה מחדש את הלימפוציטים במדיום, והשתמש לניתוח נוסף.

התחל בהנחת עכבר במצב שכיבה, ועיקור הבטן עם 70% אתנול. בצע חתך בטן בקו האמצע דרך העור והצפק מהערווה לכלוב הצלעות כדי לפתוח את חלל הצפק ולאתר את הצקום ואת הצומת האילאוצקלי.

בצע חתך דיסטלי ככל האפשר, בצומת כדי להפריד את המעי הדק מהצקום, וחתוך את המזנטריה במספריים כדי להסיר בזהירות את כל המעי הדק עד לסוגר הפילורי.

חתכו את הצומת בין הפילורוס לתריסריון כדי לנתק לחלוטין את המעי הדק מחלל הבטן, והניחו את המעי הדק המבודד לבאר אחת של צלחת בת שש בארות המכילה מדיום RPMI קר, בתוספת 10% סרום בקר עוברי או FBS על קרח. לאחר מכן, ערבבו בעדינות את הרקמות באופן ידני עד שכל הקטעים שקועים במדיום הקר.

לאחר שכל המעיים נקצרו, השתמשו במלקחיים כדי לתפוס את השומן המזנטרי בקצה אחד של המעי והניחו את הדגימה - הצד המזנטרי כלפי מטה - על מגבת נייר. הרטיבו את כל מקטע המעי עם RPMI בתוספת 10% FBS כדי למנוע התייבשות ודביקות של רקמות, ואתרו את כתמי פייר, המופיעים כאגרגטים לבנים מרובי אונות עם צורה דמוית כרובית בצד האנטי-מזנטרי של דופן המעי.

כדי לקצור את המדבקות של פייר, השתמש במספריים כירורגיים מעוקלים כשהעקומה פונה כלפי מעלה כדי להוציא בעדינות כל מדבקה מהגבולות הדיסטליים והפרוקסימליים שלה, תוך הקפדה על אי הכללת רקמת המעי שמסביב, והנח את מדבקות הפייר לבארות בודדות של צלחת בת 12 בארות המכילה RPMI קר כקרח בתוספת 10% FBS, על קרח, בזמן שהם נאספים.

לאחר שכל המדבקות נרכשו, השתמשו במספריים כדי לחתוך את קצה המיקרופיפטה של 1 מיליליטר כך שהקוטר יהיה גדול מספיק כדי לשאוב מדבקות פייר בודדות, והעבירו את המדבקות של פייר לצינור חרוטי של 150 מיליליטר לכל עכבר, המכיל 25 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס RPMI בתוספת 10% FBS.

לאחר מכן, הנח את הצינורות בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס עם תסיסה מתמשכת ב-125 עד 150 סל"ד למשך 10 דקות. בתום התסיסה, העבירו את מדבקות הפייר למסננת תאים של 140 מיקרומטר לכל עכבר, והשתמשו בקצה הגומי של בוכנה מזרק של 110 מיליליטר לכל חיה כדי לשבש בעדינות את מדבקות פייר דרך הרשת לצינורות חרוטיים בודדים של 50 מיליליטר.

שוטפים את המסננות עם 15 עד 20 מיליליטר RPMI קר בתוספת 10% FBS, ואוספים את התאים באמצעות צנטריפוגה. לאחר השלכת הסופרנטנט בזהירות, השעו מחדש את התאים בערך 1 x 10⁷ תאים למיליליטר RPMI בתוספת ריכוז FBS של 10% לספירה. לאחר מכן, העבירו 2 עד 2.5 x 10⁶ תאים לכל 200 מיקרו-ליטר מדיום, לכל באר של צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות, וגלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה.