דור חוץ גופי של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים מאבות לימפואידים נפוצים

תאים דנדריטיים פלסמציטואידים, או pDCs, הם תאים חיסוניים המגיבים לזיהום על ידי ייצור אינטרפרון ציטוקין מסוג I.

כדי ליצור pDCs במבחנה, קח תרחיף של תאי אב לימפואידים נפוצים, או CLPs, המבודדים ממח עצם העכבר. CLPs יכולים להתמיין ללימפוציטים ותאים דנדריטיים.

הוסף את תרחיף התאים על שכבה של תאי הזנה - תאי סטרומה דבקים - המוקרנים בקרני גמא כדי לעכב התפשטות. תאי ההזנה מספקים ציטוקינים ומגע תא-תא הנדרש להתמיינות של CLPs.

הוסף ריכוז הולם של טירוזין קינאז 3 ליגנד דמוי Fms, או FL - ציטוקין דו-ערכי המקדם התפתחות pDC - ודגר.

ה-CLPs נודדים בין תאי ההזנה ומתרבים ליצירת קבוצות תאים, הנקראות אזורים מרוצפי אבן.

ה-FL במדיום נקשר לקולטן Flt3 - קולטן טירוזין קינאז - על ה-CLPs. הקישור גורם לדימריזציה של קולטנים ולזרחון עצמי של שאריות הטירוזין בתחום הציטופלזמי

חלבוני מתאם ציטופלזמיים נקשרים לשאריות אלה והופכים לזרחניים, ומעבירים את האות לרכיבי האיתות במורד הזרם. מפל האיתות גורם להתמיינות של CLPs ל-pDCs - תאים עגולים קטנים הגדלים בתרחיף - כמו גם לתאים דנדריטיים קונבנציונליים, או cDCs - תאים דבקים גדולים יותר בצורת ציר.

אסוף את התאים. הוסף נוגדנים כנגד סמני משטח ספציפיים ל-pDC ו-cDC. נתח את התאים באמצעות ציטומטריית זרימה.

תאים חיוביים לסמנים ספציפיים ל-pDC ושליליים לסמנים ספציפיים ל-cDC מצביעים על התפתחות מוצלחת של pDC.

כדי לנתח את אבות הלימפה הנפוצים, או CLPs, על ידי זרימה ציטומטרית, לאחר מכן, F_c חוסם את התאים עם אנטי-CD16/32 למשך דקה עד שתיים, ולאחר מכן צביעה בו זמנית של התאים עם קוקטייל הנוגדנים המתאים.

לאחר 15 דקות על קרח, שטפו את התאים בשלושה מיליליטר של מאגר FACS, והשעו מחדש את הגלולה ב-300 מיקרוליטר של מאגר FACS טרי. לאחר מכן, סנן את מתלה התאים דרך מסננת של 40 מיקרומטר, ומיין מיד את התאים על ציטומטר זרימה באמצעות המסננים והמתחים המתאימים, ואסף את התאים המעניינים בצינור של 15 מיליליטר המכיל 8 מיליליטר של RPMI שלם.

כדי ליצור אוכלוסיית pDC מועשרת מאוד, חיוני למיין את האוכלוסייה הנכונה של CLPs מתאי מח עצם שנקטפו לתרבית חוץ גופית עם מערכת הזנה AC-6.

בסוף המיון, סובב את התאים, והשהה מחדש את כדורית תא ה-CLP עם מספיק RPMI שלם כדי לקבל צפיפות תאים של בערך פי 5 פי 10 לתאים הרביעיים למיליליטר. לאחר מכן, זרעו 500 תאים לבאר לתוך צלחת 12 הבארות המכילה את תאי ההזנה AC-6, והשלימו את התרבויות המשותפות ב-100 ננוגרם למיליליטר ליגנד FLT3. לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עם ניטור חזותי תקופתי של התא הדנדריטי, או התפתחות DC, תחת מיקרוסקופ.

ביום ה-12, קצרו את התאים בסופרנטנט של תרבית משותפת, ושטפו כל באר פעם אחת עם חצי מיליליטר של מדיום RPMI שלם, ואספו את הסופרנטנטים והשטיפות שנוצרו. לאחר מכן, הוסיפו חצי מיליליטר של מדיום טרי לכל באר, והשתמשו במגרד תאים כדי לנתק את התאים הדבקים. שלב את התאים המנותקים עם התאים הצפים, וצנטריפוגה את תרחיף התאים שנוצר, והשהה מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר של מאגר FACS.

לאחר מכן, ספרו את התאים וצבעו אותם לביטוי CD11c, CD11b ו-B220 לאחר חסימת Fc, כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן ניתן לנתח את התאים בתרבית משותפת לנוכחות של אוכלוסיות CD11c חיוביות קונבנציונליות, CD11b חיוביות, B220 שליליות ופלזמציטואיד CD11c חיובי, CD11b שלילי, B220 חיובי ל-DC.