יצירת תאים דנדריטיים לא בוגרים, בוגרים וסובלניים ממונוציטים

כדי לעורר תגובה חיסונית, תאים דנדריטיים, DCs, מציגים אנטיגן המוצג עם MHC class-II ומולקולות הגירוי המשותף CD80 ו-CD86. בהתבסס על מאפייני התגובה החיסונית, הם מחולקים ל-DCs לא בשלים, בוגרים וטולרוגניים.

כדי ליצור תת-קבוצות שונות של תאים דנדריטיים במבחנה, התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה מונוציטים אנושיים - תאי קודמן חיסוני בתווך שלם המכיל גורמי גדילה והציטוקין IL-4 - מולקולת איתות.

דגירה על התאים למשך זמן ממושך. גורמי הגדילה ו-IL-4 גורמים לשגשוג מונוציטים והתמיינות ל-DCs לא בשלים.

DCs לא בשלים מחזיקים בקולטני זיהוי דפוסים, PRRs ומבטאים מולקולות MHC נמוכות מסוג II וגירוי משותף, המציגים יכולת מופחתת לעורר תגובה חיסונית.

טפל בבאר אחת המכילה DCs לא בשלים עם חומרים אימונומודולטוריים - ויטמין D3 וגלוקוקורטיקואידים. סוכנים אימונומודולטוריים אלה מפחיתים את הביטוי של מולקולות MHC מסוג II וגירוי משותף. זה מוביל להתמיינות ל-DCs טולרוגניים - תאים מווסתים חיסוניים המונעים תגובות חיסוניות מוגזמות או לא רצויות.

טפל בבאר אחרת המכילה DCs לא בשלים עם ליפופוליסכריד, LPS - אנטיגן. LPS מקיים אינטראקציה עם קולטן דמוי אגרה של התאים - PRR, יוזם מפל איתות ומבדיל אותם לתאים בוגרים. תאים אלה מבטאים MHC Class II גבוה, מולקולות קו-סטימולטוריות ו-PRRs - יעילים לעיבוד והצגה של אנטיגן.

התבונן בבארות שטופלו באופן דיפרנציאלי עבור מאפיינים מורפולוגיים מובהקים המייצגים את תת-סוגי התאים הדנדריטים.

זרע ארבע קבוצות של מונוציטים CD14+ בריכוז של 0.3 עד 0.5 x 10⁶ למיליליטר של מדיום תרבית תאים של IL-4 בצלחות של שש בארות. דגרו את התאים באינקובטור תרבית רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. ביום 4, הסר 850 מיקרוליטר מדיום מהתרבית, והצנטריפוגה.

שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים. מוסיפים את תערובת התאים בחזרה לתרבית. ביום החמישי, הוסף 1 מיקרוליטר של ציר ויטמין D3 ו-1 מיקרוליטר של מלאי דקסמתזון למיליליטר של מדיום לשניים מהסטים כדי ליצור moDCs טולרוגניים.

ביום השישי, הוסיפו 200 ננוגרם למיליליטר של GM-CSF ו-200 ננוגרם למיליליטר של IL-4 לכל הסטים. הוסף 1 מיקרוגרם למיליליטר של LPS לאחת מהקבוצות שטופלו רק ב-GM-CSF ו-IL-4 כדי ליצור moDCs בוגרים.

הוסף 1 מיקרוגרם למיליליטר של LPS לקבוצה אחת של moDCs של מצבים טולרוגניים כדי ליצור moDCs טולרוגניים של LPS. לבסוף, ביום השביעי, קצרו את הסוגים השונים של moDCs על ידי שטיפת צלחת התרבות עם PBS-EDTA.