בידוד וטיהור תאי B מדם היקפי אנושי

כדי לבצע הפרדה שלילית אימונומגנטית של תאי B, אסוף דם היקפי אנושי בצינור המכיל נוגדי קרישה כדי למנוע קרישת דם. הוסף כדוריות דם אדומות, RBC, מאגר ליזה כדי ליז את ה-RBCs מבלי להשפיע על תאי דם אחרים.

צנטריפוגה כדי לשקוע את תאי הדם השלמים והצפופים יותר מ-RBCs הליזה הפחות צפופים, שנשארים בסופרנטנט. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה במדיום טרי.

העבירו את התאים לצלחת תרבות. דגירה כדי לאפשר למקרופאגים ולמונוציטים להיצמד לצלחת בזמן שהתאים שאינם נצמדים, כולל תאי B, נשארים בתרחיף.

אוספים את התאים בתרחיף לצינור טרי. צנטריפוגה כדי לגלול את התאים ולהשעות אותם מחדש במאגר.

הוסף תמיסת קוקטייל המכילה נוגדנים ביוטיניליים ספציפיים לתאי דם שאינם תאי B. הנוגדנים נקשרים לאנטיגנים על פני השטח של תאים שאינם B, ומשאירים את תאי B ללא תווית.

צנטריפוגה. השליכו את הסופרנטנט המכיל נוגדנים לא קשורים.

הוסף תמיסה של חרוזים מגנטיים מצומדים סטרפטווידין. במהלך הדגירה, הסטרפטווידין על המיקרו-חרוזים נקשר בחוזקה לנוגדנים הביוטיניים הקשורים לתאים שאינם B, ויוצר קומפלקסים.

הנח את הצינור בשדה מגנטי כדי להדביק את התאים שאינם B הקשורים בחרוזים מגנטיים לדפנות הצינור, והשאיר את תאי B בתרחיף. העבירו את הסופרנטנט שמכיל תאי B טהורים לשפופרת.

צנטריפוגה והשעיית תאי B בתווך להמשך ניתוח במורד הזרם.

מיד לאחר קבלת דגימת דם של 10 מיליליטר מהווריד הקוביטלי החציוני לתוך צינור של 15 מיליליטר המכיל EDTA בתוספת אשלגן, הפוך את הצינור מספר פעמים כדי למנוע היווצרות קרישים. לאחר מכן, הוסף 35 מיליליטר של מאגר ליזה של תאי דם אדומים אוטוקלאב לתאים לדגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.

כאשר ניתן לצפות באור דרך הצינור, צנטריפוגה את הדם ואשר נוכחות של כדור לבן. הסר את מאגר הליזיס השיורי עם 10 מיליליטר של חיטוי ל-PBS, והשהה מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640.

צלחת את התאים בצלחת תרבית של 10 סנטימטר לדגירה של 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, סובבו בעדינות את צלחת התרבות כמה פעמים והעבירו את התאים הצפים לצינור חרוטי מפלסטיק של 15 מיליליטר.

לאחר שתי שטיפות על ידי צנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה בריכוז של 5 עד 10 x 10⁶ תאים למיליליטר ב-200 מיקרוליטר של מאגר PBS קר, והוסיפו 5 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים אנטי-אנושיים ביוטיניליים ספציפי לתאי דם לכל 1 x 10⁶ תאים.

לאחר דגירה של 30 דקות על קרח, שטפו את התאים בנפח עודף פי 10 של PBS סטרילי, והשעו מחדש את הגלולה ב-5 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים מצומדים לסטרפטווידין לכל 1 x 10⁶ תאים למשך 30 דקות דגירה על קרח. בתום הדגירה, הוסף 2 מיליליטר של מאגר PBS לתאים והנח את הצינור על מעמד מגנטי למשך 8 דקות בטמפרטורת החדר.

כאשר המיקרו-חרוזים נצמדו לדופן הצינור, העבירו בזהירות את הסופרנטנט לתוך צינור חרוטי חדש, והוסיפו עוד 2 מיליליטר של מאגר PBS לתאים. לאחר איסוף הסופרנטנטים השני, אספו את התאים שנאספו על ידי צנטריפוגה, והעבירו את התאים לצינור פוליסטירן של 5 מיליליטר במאגר PBS טרי בריכוז של 1 x 10⁷ תאים למיליליטר.