הערכה תפקודית של תאי B מפרישי נוגדנים באמצעות בדיקת ELISpot

תאי B המפרישים נוגדנים, או ASCs, הם תאי B מובחנים המפרישים איזוטיפים של נוגדנים, כולל IgG ו-IgM, כדי להבטיח הגנה מפני פתוגנים.

כדי לבצע הערכה תפקודית של ASCs במבחנה, התחל בבדיקת הנקודה האימונוסורבנטית המקושרת לאנזים. קח צלחת ELISpot המכילה קרום פלואוריד פוליווינילידן מופעל בבסיס.

דגרו על הבארות עם שברי נוגדנים רב-שבטיים המכילים אך ורק אזורי Fab ללא אזור ה-Fc של הנוגדן. לכל אזור Fab יש אתר קשירה לאיזוטיפים ספציפיים של נוגדנים - IgG או IgM, המאפשר זיהוי של שני האיזוטיפים.

במהלך הדגירה, שברי הנוגדנים נצמדים לקרום, מה שמוביל לקיבוע.

כסו את הבארות בתמיסות חוסמות למניעת כריכה לא ספציפית. זרעו את הצלחת עם תאי B מפרישי נוגדנים פעילים, ודגרו. ה-ASCs מפרישים איזוטיפים שונים, כולל IgG ו-IgM, הנקשרים לשברי הנוגדנים הקשורים לממברנה.

שטפו את הצלחת עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים מופרשים לא קשורים. טפל בבארות מסוימות עם נוגדנים לזיהוי מצומדים של אנזים ל-IgM ואחרות עם נוגדנים לזיהוי ל-IgG, ודגירה.

נוגדני הזיהוי נקשרים לאיזוטיפים שלהם, ויוצרים אימונוקומפלקסים.

הוסף מצעים קולורימטריים לכל הבארות, המקיימים אינטראקציה עם האנזימים ומייצרים כתמים בצבע סגול על הממברנה. הוסף פתרון עצירה כדי לעצור את התגובה.

הכתם הצבעוני המיוצר בכל באר מצביע על נוכחות האיזוטיפ של הנוגדן הספציפי, בקורלציה עם פעילות ההפרשה של תאי B.

כאשר כל התאים נקצרו, זרעו את תת-הקבוצות לבארות בודדות של צלחת תרבית תאים של 12 בארות בריכוז של 1 עד 10 x 10⁵ תאים למיליליטר במדיום RPMI טרי. לאחר מכן, הפעל את תאי B עם 5 מיקרוגרם של CpG (ODN 2006) לכל 1 x 10⁶ תאים למיליליטר לבאר בחממת תרבית התאים למשך חמישה ימים.

בתום ההפעלה, הוסף 30 מיקרוליטר של 35% אתנול במים מזוקקים לכל באר של צלחות ELISpot למשך 30 שניות. לאחר מכן, החלף את האתנול בכל באר ב-150 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים שעברו חיטוי, ודגר את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי להסיר את שאריות האתנול. בצע שטיפת PBS, ואחריה תוספת של 50 מיקרוליטר של שבר F(ab')2 הפוליקלונלי של Ig אנטי אנושי לכל באר.

שטפו את הצלחות פעמיים עם PBS, כפי שהודגם זה עתה. חסום את הכריכה הלא ספציפית בכל באר עם 200 מיקרוליטר PBS טרי עם BSA למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר סדרת שטיפה נוספת של PBS, דגרו את הבארות ב-100 מיקרוליטר של RPMI 1640 בינוני טרי ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, החלף את המדיום בכל באר ELISpot במספר המתאים של תאי B מופעלים.

הביאו את הנפח הסופי של כל באר ל -150 מיקרוליטר עם מדיום RPMI טרי. לאחר מכן, החזר את צלחת ELISpot לחממת תרבית התאים למשך 8 עד 14 שעות. בתום תקופת הדגירה יש להשליך את המדיום ולשטוף את הבארות עם 200 מיקרוליטר PBS בתוספת Tween 20 למשך חמש שטיפות של 3 דקות.

לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו את נוגדני הזיהוי המתאימים לבארות המתאימות להם, ודגרו על הצלחות למשך שעתיים בחושך. לאחר סדרת כביסה נוספת של PBS, הוסף 50 מיקרוליטר של מצע BCIP/NBT לכל באר למשך 5 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר.

כאשר מופיעים כתמים סגולים, עצרו את התגובה עם 100 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים לבאר, ושטפו את הצלחת במי ברז זורמים. לאחר מכן, יבש באוויר את ממברנות ELISpot המוגנות מפני אור.