בידוד תאי T מבוסס ציפה באמצעות מיון תאים המופעל על ידי ציפה

כדי לבודד תאי T - תאי דם לבנים החיוניים למערכת החיסון - באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי ציפה, BACS, קח תרחיף של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי, PBMCs. PBMCs מכילים תאי T מטרה ותאים שאינם מטרה כמו תאי B, מונוציטים, תאי הרג טבעיים ותאים דנדריטיים.

הוסף חוצץ המכיל כמות מספקת של נוגדן אנטי-CD3 ביוטיניל ודגר למשך הזמן הנדרש. הנוגדן נקשר לקומפלקס CD3 - קומפלקס חלבון מולטימרי על פני התא - מאפיין מגדיר של תאי T.

הוסף מיקרו-בועות פונקציונליות - חלקיקים כדוריים קטנים המצופים בסטרפטווידין - לבחירה חיובית של תאי T הקשורים לנוגדנים. הליבה של כל מיקרו-בועה היא כדור חלול, מה שהופך אותם לחלקיקים בצפיפות נמוכה המסוגלים לצוף בתמיסה מימית.

דגרו את התערובת תחת תסיסה, ואפשרו למיקרו-בועות ולדגימה להתערבב היטב. במהלך הדגירה, סטרפטווידין על המיקרו-בועה נקשר לביוטין על הנוגדן הקשור לתאי T, ומשתק את התאים על המיקרו-בועות.

צנטריפוגה את הצינור. תאים שאינם מטרה נפרדים מהתערובת ככדור בתחתית.

המיקרו-בועות הקשורות לתאי T נשארות צפות על פני השטח, מה שמוביל להפרדה מבוססת ציפה של תאי T. טכניקת הפרדה זו מגבילה את הלחץ על תאי המטרה. בעזרת פיפטה דקה, הסר את הגלולה ואת החומר מבלי להפריע לשכבת המיקרו-בועה.

השעו מחדש את תאי ה-T המבודדים הקשורים למיקרו-בועות במדיום תרבית מתאים להמשך עיבוד.

כדי להתחיל, דגרו 3 x 10⁸ PBMCs שהושגו מסחרית ב-2.5 מיליליטר של מאגר הפרדה עם נוגדן אנטי-CD3 ביוטיניל. מערבבים בעדינות את הרכיבים על ידי פיפטינג, ומדגרים אותם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

הוסף מיקרו-בועות סטרפטווידין לתאים ביחס של 0.5 ל-1, על פי הוראות היצרן, וערבב באמצעות מסובב מסחרי מקצה לקצה ב-20 סל"ד למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה בחום של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר צנטריפוגה, התאים שנבחרו באופן חיובי יהיו בחלק העליון של התרחיף עם המיקרו-בועות של סטרפטווידין, והתאים הנותרים שלא נבחרו יהיו בכדור התא בתחתית הצינור.

בעזרת פיפטת זכוכית בגודל 9 אינץ ', הכנס את הקצה מתחת לשכבת תאי הבועות לתחתית הצינור. שאפו את כדור התא והתת-נטנט בעזרת פיפטה אלקטרונית והעבירו אותם לצינור חדש.

השעו מחדש את שכבת תאי הבועה שנותרה בצינור המקורי ב-1 מיליליטר של מדיום תאי T שלם. צנטריפוגה של החומר התת-טבעי ב-400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והשתמש בו למדידה עקיפה של טוהר והתאוששות.