אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:31 דק׳ • July 8th, 2025
תאי חיסון מתקשרים זה עם זה באמצעות אינטראקציה של קולטנים מרובים, ויוצרים צומת מיוחד - סינפסה חיסונית. סינפסה זו משמשת כאתר להחלפת מולקולות איתות החיוניות לתגובה חיסונית.
כדי לחקור היווצרות סינפסות אימונולוגיות במבחנה, התחל עם שקופית מיקרובאר מצופה מטריצת מרתף המכילה תרבית דבקה של תאים מציגי אנטיגן אנושיים פעילים, APCs.
ה-APCs המופעלים מציגים אנטיגנים הקשורים לקומפלקס תאימות היסטולוגית עיקרי או מולקולות MHC-II על פני השטח שלהם, החיוניים להפעלת תאי T. תאים אלה מסומנים בצבע פלואורסצנטי כחול לזיהוי קל.
טפל בבארות עם לימפוציטים T מסייעים אנושיים רקומביננטיים. לימפוציטים T מסייעים אלה מבטאים חלבוני ממברנה ירוקים מתויגים בחלבון פלואורסצנטי - CD63 הנמצאים בשלפוחיות הפרשה. זה מאפשר מעקב אחר שלפוחיות הפרשה.
קולטני תאי T של לימפוציטים מקיימים אינטראקציה עם קומפלקסים של אנטיגן MHC על ה-APCs, ומביאים את לימפוציטים T המסייעים ליד התאים המציגים אנטיגן, וכתוצאה מכך צימוד.
עם הצימוד, מולקולות איתות בגירוי משותף על ה-APCs מקיימות אינטראקציה עם קולטני לימפוציטים - ויוצרות מקבץ סביב אתר ההצמדה, ויוצרות סינפסה אימונולוגית.
היווצרות סינפסה מעוררת ארגון מחדש של שלד התא הלימפוציטי, הכולל מיקום מחדש של אלמנטים ציטו-שלדיים - חוטי אקטין ומיקרו-צינורות. ארגון מחדש זה מקל על תנועת השלפוחיות לעבר הסינפסה ליד הנגמ"שים.
התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ פלורסנט. רשום את תנועת השלפוחיות הירוקות בתוך תא ה-T המסייע לעבר הנגמ"שים הכחולים, המאשרים היווצרות סינפסות אימונולוגיות.
אחזר את שקופיות התא המכילות את עוקב התאים Staphylococcus Enterotoxin E-pulsed תאי ראג'י דבוקים מהאינקובטור. שאפו בזהירות את מדיום התרבות מכל באר, בזה אחר זה, עם פיפטה המונחת בפינת הבאר.
החלף מיד את המדיום ב -200 מיקרוליטר של תאי הג'ורקאט התלויים במדיום תרבית תאים. אם מבוצע זמן-lapse, המשך במהירות למיקרוסקופ.
אתר את שקופית החדר בחממת שלב המיקרוסקופ ובחר כמה שדות מתאימים.
הכן את המיקרוסקופ בתא הדגירה לפני ההדמיה. לאחר הוספת תאי הג'ורקאט לכל באר המכילה את תאי הראג'י, אתר במהירות את שקופית תא המיקרובאר בחממת שלב המיקרוסקופ שחוממה מראש, ובחר כמה מיקומי XY.
אם מתוכנן רק ניסוי נקודת קצה, דגרו את מגלשת החדר ב -37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שעה עד שעתיים. לאחר תקופת הגידול, בדוק אם יש היווצרות מצומדים ולאחר מכן תקן את המצומדים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.