זיהוי סמן CD של תאי הרג המושרים על ידי ציטוקינים אנושיים על ידי ציטומטריה של זרימה

תאי רוצח המושרה על ידי ציטוקין, CIK, הם אוכלוסיות תאי חיסון הטרוגניות הנוצרות ex vivo מתרביות תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMC) המגורים עם ציטוקינים ספציפיים ונוגדנים חד שבטיים. תאי CIK מורכבים מאוכלוסיות תאים, כולל תאי CD3+CD56+ NK-T, תאי CD3+CD56-T ותאי CD3-CD56+ NK.

כדי לקבוע את פרופורציה של תאי CIK, התחל עם צינורות המכילים תרחיף תאי CIK שמקורו ב-PBMC. הוסף נוגדנים נגד CD3 ואנטי-CD56 המצומדים לפלואורופורים שונים ואת התערובת שלהם לצינורות ייעודיים. הוסף נוגדנים לבקרת איזוטיפים מצומדים לפלואורופורים דומים כנוגדנים ספציפיים לצינורות אחרים.

נוגדנים נגד CD3 ו-CD56 המסומנים באופן פלואורסצנטי מזהים ונקשרים ל-CD3 ו-CD56 המתבטאים באוכלוסיות תאי CIK, בהתאמה. נוגדנים לבקרת איזוטיפים חסרים ספציפיות של אנטיגן מטרה, מה שמקל על מדידות אותות רקע לא ספציפיות.

תאי פיפטה לצינורות תחתונים עגולים עם מכסי מסננת תאים, המסייעים בהסרת אגרגטים של תאים. טען את הצינורות לקרוסלת ציטומטר זרימה. במהלך הריצה, כל תא עובר דרך התעלה ופוגש את קרני הלייזר ומפזר את האור.

גלאי אחד מודד את עוצמת האור המפוזר קדימה, המעידה על גודל התא; אחר מודד את עוצמת האור המפוזר בצד בניצב לקרן הלייזר, מה שמרמז על גרעיניות התא. יחד, מידע זה מסייע בזיהוי אוכלוסיית תאי החיסון.

במקביל, קרני לייזר באורכי גל עירור ספציפיים מעוררות את הנוגדנים המצומדים לפלואורופור על התאים, וגורמות לפליטת אותות פלואורסצנטיים המתגלות.

הניתוח של עוצמות פלואורסצנטיות ספציפיות על התאים קובע את שיעור תת-אוכלוסיות תאי CIK.

התחל הליך זה בהכנת תאי CIK, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, שטפו את תאי ה-CIK עם 10 מיליליטר PBS סטרילי. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב -300 פעמים גרם ו -18 עד 20 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים עם 5 מיליליטר PBS. ספור את מספרי התאים ובדוק את כדאיות התאים באמצעות מבחן אי הכללת הטריפן הכחול.

יש לחלק את תאי ה-CIK לשישה צינורות סטריליים של 1.5 מיליליטר בצפיפות של כ-0.5 עד מיליון תאים למיליליטר של PBS. סמן את התאים וטפל בהם, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. ערבבו בעדינות את תאי ה-CIK עם הנוגדנים על ידי פיפטה עדינה למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים עם פיפטה סטרילית של 1 מיליליטר. דגרו את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.

צנטריפוגה את הצינורות למשך 10 דקות ב -300 פעמים גרם ו -18 עד 20 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא עם מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן, פיפטה בעדינות את התאים למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים בעזרת פיפטה סטרילית של 1 מיליליטר. העבירו את מתלה התאים לצינור תחתון עגול מפוליסטירן סטרילי בנפח 5 מיליליטר עם מכסה מסננת תאים על ידי פיפטינג בעדינות דרך המכסה. לאחר מכן, הניחו את הצינורות על הקרוסלה לפי הסדר.

פתח את תוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה וצור תיקיה ניסיונית. לאחר מכן, לחץ על כפתור "דגימה חדשה" כדי להוסיף דגימה וצינור לניסוי. תן שם לצינורות כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

כדי ליצור מערכת שער פיזור עבור אוכלוסיות תאי CIK, ראשית, בחר צינור 1 ולחץ על כפתור עלילת נקודה כדי ליצור עלילת FSC-A/SSC-A. צייר שער מלבן על כל אוכלוסיית התאים עם סף FSC-A גדול מ-5,000 כדי לא לכלול פסולת תאים.

בחר את הפרמטר FSC-A/FSC-H עבור תרשים הנקודות החדש, וצייר שער מצולע סביב כל התאים הבודדים. בחר את הפרמטר ספירה לעומת מצומד FITC (CD3) וספירה לעומת APC מצומד (CD56) עבור עלילת ההיסטוגרמה החדשה. בחר את הפרמטר מצומד FITC (CD3) לעומת APC מצומד (CD56) עבור תרשים הנקודות החדש, וצייר שער של ארבעה רבעים כדי להגדיר את ארבע תת-האוכלוסיות.

רשום את הנתונים מ-20,000 תאים בודדים בכל דגימה. לחץ על כפתור "טען דגימה" כדי לנתח תחילה את דגימת הבקרה הריקה. זהה את כל אוכלוסיית תאי ה-CIK באמצעות פרמטרי הערוץ CD56 ו-CD3. פתח את הקבצים המכילים את הערכים הסטטיסטיים של הדגימה הבודדת כדי לנתח אוכלוסיות תאי CIK ולהדפיס אותם מחדש לקבצי ניתוח.