בדיקה לזיהוי הפרשת אינטרפרון-גמא באיברי הלימפה של מורין

אינטרפרון-גמא, או IFN-γ, ציטוקין המופרש על ידי הלימפוציטים תאי T ותאי הרג טבעיים או תאי NK, מתווך את התגובה החיסונית נגד פתוגנים.

כדי לחקור באתרו ייצור IFN-γ, קחו עכבר מושתל בתאי T עם תווית פלואורסצנטית שהונדסו לבטא קולטן המזהה אובאלבומין - אנטיגן מודל.

קחו תרחיף של חיידקים פתוגניים - מהונדסים גנטית כדי לבטא אובאלבומין - והזריקו אותו לווריד לעכבר, מה שגורם לזיהום מערכתי. החיידקים המסתובבים מגיעים לטחול - איבר לימפה משני - המסייע בהסרת פתוגנים על ידי הקלה על אינטראקציה עם תאי חיסון.

תאים המציגים אנטיגן בולעים את החיידקים ומציגים את האנטיגן. תאי T נקשרים לאנטיגן דרך הקולטן שלו, מופעלים ומייצרים IFN-γ.

תאי מקרופאגים, הנגועים בחיידקים, משחררים מתווכים חיסוניים ומווסתים ליגנדים מפעילים על פני השטח שלהם. עם אינטראקציה עם אותות אלה, תאי NK מופעלים ומייצרים IFN-γ.

הזרקת מעכב הובלת חלבון תוך תאי כדי להגביל את הפרשת IFN-γ, ולגרום להצטברות התוך תאית שלו.

קציר את טחול העכבר. תקן את הרקמה והקפיא אותה כדי לסייע בחיתוך. בעזרת קריו-מיקרוטום, צור קטעי רקמה דקים והנח אותם על שקופיות זכוכית. הוסף נוגדנים ספציפיים לתאי NK, הנקשרים לסמני פני השטח, ונוגדנים ספציפיים ל-IFN-γ, הצובעים את ה-IFN-γ התוך-תאי. נוגדנים אלה מסומנים בפלואורופורים שונים.

מקמו את השקופית מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות IFN-γ בתוך תאי NK ותאי T.

השליכו את התמיסה המקבעת והוסיפו 5 מיליליטר PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, תחת תסיסה עדינה. לאחר מכן, החלף את ה-PBS ב-5 מיליליטר של 30% סוכרוז ודגר למשך 12 עד 24 שעות כדי לשמור על מורפולוגיה של הרקמות. כעת, האיבר שוקע בתחתית הצלחת.

כדי להקפיא את הדגימה, הכניסו קרח יבש לכלי קיבול גדול והניחו בתוכו כלי קיבול קטן יותר, המכיל כ-50 מיליליטר מתנול טהור וכמה חתיכות קרח יבש. יבש בעדינות את הטחול על מגבון נטול מוך. טפטפו טיפה של תרכובת OCT בתחתית תבנית הבסיס והניחו את הטחול בתוך התבנית. היזהר לא לייצר בועות.

הוסף כ-1 מיליליטר OCT מעל הטחול. בעזרת מלקחיים, הניחו את תבנית הבסיס על פני המתנול באמבט הקרח היבש, וודאו שהמתנול אינו נוגע ב-OCT. ה-OCT יתעבה ויהפוך לבן כשהוא קפוא. זכור להקפיא את הרקמה במהירות האפשרית כדי למזער חפצים.

על מיקרוטום קריו, הגדר לטמפרטורה של מינוס 21 מעלות צלזיוס. חתכו את הרקמה לעובי הרצוי בסביבות 10 מיקרומטר. השתמש במברשת כדי לאסוף חלקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית, ובדוק חזותית. אפשר לחלקים להגיע לטמפרטורת החדר.

ציירו עיגול עם חוסם נוזלים, למשל, עט PAP, סביב קטע הרקמה מחוץ ל-OCT. לאחר שהרקמה התייבשה, החזר את הדגימה על ידי טפטוף 100 מיקרוליטר PBS על קטע הרקמה למשך 5 דקות. לאחר מכן, הסר את ה-PBS מהקטע על ידי שאיפה, והוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל קטע דגימה. דגירה בתא רטוב מכוסה למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר.

כדי להכתים בנוגדנים ראשוניים, החלף את תמיסת החסימה בתערובת הנוגדנים הראשונית המוכנה עבור כל דגימה. יש לדגור במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר או לילה בחום של 4 מעלות צלזיוס בתא רטוב מכוסה, לפני הכביסה לפי כתב היד.

כעת, יש לדלל את הנוגדנים המשניים המעניינים לריכוז אופטימלי, בדרך כלל 2.5 מיקרוגרם למיליליטר בתמיסת החסימה. הסר את תמיסת הכביסה הסופית מהקטע, והוסף את תערובת הנוגדנים המשנית המוכנה על גבי הקטע, ודגר במשך שעה עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר בתא מכוסה ורטוב.

לאחר שטיפה עם מאגר כביסה לפי כתב היד, הסר את תמיסת הכביסה ובצע שטיפה סופית עם PBS. שאפו את מי המלח המאוחסנים בפוספט ואפשרו ל-PBS הנותר להתאדות מבלי שהחלק יתייבש לחלוטין.

צייר עיגול סביב המקטע בגב השקופית. לאחר מכן, הניחו טיפה של אמצעי ההרכבה על גבי הדגימה, וודאו שהמדיום מכסה את כל הקטע, והניחו בזהירות זכוכית כיסוי מעל. הניחו לדגימות להתפלמר למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך.

בבוקר, הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ סריקת לייזר ספקטרלי הפוך. התאם את היעדים ל-10x/NA 0.40, או 60x/NA 1.4 לניתוח לוקליזציה תת-תאית של ציטוקינים.