אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 4:25 דק׳ • July 8th, 2025
צינורות הזרע של האשכים מכילים תאי סרטולי, המזינים תאי נבט. תאי סרטולי מחוברים באמצעות צמתים הדוקים ומחוברים היטב למטריצת הבסיס העשירה בחומצה היאלורונית. סידור זה של תאי סרטולי מווסת את כניסת תאי החיסון לצינורית ומגן על תאי נבט מתפתחים מפני פירוק.
כדי לבודד תאי סרטולי, התחל עם צינור המכיל צינורות זרע מעוכלים חלקית שמקורם באשכי עכבר. צינורות אלה חסרים תאים פריטובולריים - תאי שריר חלק המקיפים את צינורות הזרע.
טפלו בצינוריות עם קוקטייל אנזימים המכיל היאלורונידאז - חיוני להידרוליזה של חומצה היאלורונית - ו-DNase.
היאלורונידאזות נכנסות לצינורות ומבקעות חומצה היאלורונית - פוליסכריד במרתף - יוזמות ניתוק תאי סרטולי ממטריצת המרתף ומשחררות תאי נבט לתמיסה. DNase מעכל כל מזהמי DNA מהתמיסה, ומונע צבירת תאים.
שטפו את הצינורות המתעכלים אנזימטית עם חיץ, והסירו שאריות אנזימים, שברי תאים ותאי נבט. השעו מחדש את הצינורות המעוכלים והעמיסו את המתלה למכלול מזרק מחט.
העבירו את התמיסה שוב ושוב כדי ליצור גזירה הידרודינמית ולשבש את הצמתים ההדוקים של תאי הסרטולי, ולשחרר אותם כתאים בודדים יחד עם תאי הנבט הנותרים.
סנן את מתלה התאים, הסר פסולת סלולרית וקבל מתלה תא יחיד. צנטריפוגה את המסנן כדי לגלול את התאים.
השעו מחדש את התאים במצע גידול נטול סרום להרחבה סלקטיבית של תאי סרטולי.
כדי לבודד את תאי סרטולי, השתמש בפיפטה חדשה של 25 מיליליטר כדי להשעות מחדש את הצינורות המיושבים ביסודיות ב -25 מיליליטר PBS. לאחר שאפשרתם לצינורות להתייצב עוד 12 דקות, השתמשו באותה פיפטה כדי לשטוף את הצינורות שלוש פעמים נוספות באותו אופן. לאחר מכן, העבירו את הצינוריות לבקבוק חדש של 100 מיליליטר והוסיפו את תמיסת Hyaluronidase-DNase-I. יתר על כן, עכל את הצינורות באמבט מים רועדים ב-32 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
בדוק את ההשעיה על ידי בדיקת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 100. צינורות קצרים, אגרגטים צינוריים ותאים משוחררים צריכים להיות גלויים. אפשר לאגרגטים הצינוריים להתיישב למשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמש בפיפטה חדשה של 25 מיליליטר כדי להסיר את הסופרנטנט ולשטוף את האגרגטים ארבע פעמים ב-25 מ"ל PBS, עם 10 דקות של שקיעה בין כל שטיפה.
אוכלוסיית ה-PTC המזהמת תצטמצם. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 20 מ"ל של מדיום RPMI 1640 לתאים, והעבירו את המתלה דרך מחט 18G המותקנת על מזרק של 20 מיליליטר 10 פעמים. לאחר מכן, אשר במהירות שכל האגרגטים נותקו, וסנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרון כדי לקבל תרחיף חד-תאי טהור.
סובב את המסנן, השתמש בפיפטה של 25 מיליליטר כדי לשאוב בזהירות את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את תאי הסרטולי המבודדים ב-40 מ"ל של מדיום RPMI 1640 ללא סרום. לאחר מכן, ספור את מספר התאים ברי הקיימא על ידי אי הכללת טריפאן-כחול והתאם את ריכוז התאים ל-3 x 106 תאים למיליליטר. לבסוף, האכילו 1 מיליליטר תאים לבאר בצלחת של שש בארות.