בידוד סלקטיבי של תאי T CD4⁺ Vδ1⁺ γδ מתאי דם מונוגרעיניים היקפיים אנושיים

תאי T γδ מבטאים קולטני תאי T, TCRs, המורכבים משרשראות גמא ודלתא עם תחומים משתנים וקבועים.

תאי CD4+ Vδ1+ T - תת-אוכלוסייה של תאי T γδ - מבטאים במשותף את שרשרת Vδ1 המשתנה ואת הקולטן המשותף CD4. תאים אלה נודדים לרקמות דלקתיות ומתמיינים לתאי CD4+ או CD8+ αβ T בוגרים מבחינה תפקודית - מתווכים תגובה חיסונית.

כדי לבודד תאי CD4+ Vδ1+ T מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי, PBMCs, השעו מחדש את התאים במאגר. השתמש במגיב חוסם FC כדי לחסום את קולטני ה-Fc על פני התא ולמנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

הוסף נוגדנים נגד Vδ1 המצומדים עם הפלואורופור FITC, הנקשרים לאנטיגנים Vδ1 של תאי γδ T. דגירה עם מיקרו-חרוזים מגנטיים מצומדים לנוגדנים נגד FITC, הנצמדים לצבע FITC על הנוגדנים הקשורים לתאי Vδ1 T.

העבירו את התערובת דרך עמודה מגנטית כדי למשוך את תאי ה-Vδ1+ T הקשורים לחרוזים; תאי Vδ1-T נשארים לא קשורים ולאחר מכן נשטפים החוצה. שטוף בכוח את העמודה על ידי דחיפת המאגר דרכו כדי לנתק את תאי Vδ1+ T.

דגרו על התאים עם חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים נגד CD4, הנקשרים לקולטן CD4 של התאים. הנח את הצינור במגנט כדי למשוך את תאי CD4+ Vδ1+ T הקשורים לחרוזים; תאי CD4-Vδ1+ T נשארים לא קשורים.

השעו מחדש את תאי CD4+ Vδ1+ T במדיום. הוסף ריאגנט לניתוק חרוזים כדי לשחרר את החרוזים מהתאים. החזר את הצינור על המגנט כדי להפריד בין החרוזים.

אסוף את הסופרנטנט של תא CD4+ Vδ1+ לניתוח נוסף.

לפני שתתחיל בבידוד תאי Vδ1 T, השתמש ב-1 x 10⁶ של PBMC כדי להעריך את התדירות של תאי T חיוביים ל-Vδ1CD4 בדגימת התורם על ידי ציטומטריית זרימה. לאחר מכן, סובב את שאר הלימפוציטים, והשהה מחדש את הגלולה ב-60 מיקרוליטר של מאגר MACS לכל 1 x 10⁷ תאים.

לאחר מכן, חסום את התאים ב-20 מיקרוליטר של מגיב חוסם FC לכל 1 x 10⁷ תאים, ולאחר מכן תוספת של 10 מיקרוליטר של נוגדן Vδ1 אנטי-אנושי מצומד FITC לכל 1 x 10⁷ תאים למשך 12 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים ב -14 מיליליטר של מאגר MACS.

השעו מחדש את הגלולה ב-80 מיקרוליטר של מאגר MACS לכל 1 x 10⁷ תאים, והוסיפו 20 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים נגד FITC לכל 1 x 10⁷ תאים עם ערבוב. לאחר 15 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, שטפו את התאים ב -10 מיליליטר של מאגר MACS טרי.

במהלך הצנטריפוגה, יש לאזן עמודה מגנטית מקוררת מראש עם 500 מיקרוליטר של מאגר MACS. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS, והוסיפו אותם בזהירות לראש העמודה.

שטפו את העמוד בשלוש שטיפות חיץ MACS של 500 מיקרוליטר. לאחר מכן, הסר את העמודה מהמגנט, והשתמש בבוכנה כדי לשטוף במהירות את התאים החיוביים ל-Vδ1 עם 1 מיליליטר של מאגר MACS לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר.

לאחר העברת התאים דרך עמודה שנייה, מערבולת 25 מיקרוליטר של חרוזי CD4 למשך 30 שניות. לאחר מכן, העבירו את החרוזים לצינור תגובה של 1.5 מיליליטר, המכיל 1 מיליליטר של מאגר MACS, והניחו את הצינור על מגנט.

לאחר דקה אחת, השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לשאוב בזהירות את הסופרנטנט, והשהה מחדש את החרוזים ב-25 מיקרוליטר של מאגר MACS. לאחר מכן, סובב את התאים החיוביים ל-Vδ1 המבודדים והשהה מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS. מערבבים את התאים במרץ עם החרוזים. לאחר מכן, לאחר 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, עם הטיה מתמדת, הנח את הצינור בחזרה על המגנט.

כדי למנוע אובדן נפח דגימה כלשהו וכדי למזער את נוכחותם של תאים שליליים CD4 מזהמים, חיוני להחדיר כל מאגר שנותר מהחלק הפנימי של המכסה בחזרה לתוך הבקבוקון.

לאחר שתי דקות, השתמשו בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להעביר את הסופרנטנט המכיל תאים חיוביים ל-Vδ1 שלילי CD4 לתוך שפופרת חדשה. לאחר מכן, הסר את התאים החיוביים ל-CD4 מהמגנט, והשהה אותם מחדש ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS.

לאחר הסרת התאים השליליים ל-CD4 פעמיים נוספות, כפי שהודגם זה עתה, דגרו את התאים החיוביים ל-CD4 ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית, ו-10 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק חרוזים בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות עם הטיה מתמדת. בסוף הדגירה, החזירו את התאים למגנט למשך דקה אחת, והשתמשו בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להעביר את הסופרנטנט המכיל תאים חיוביים ל-CD4 נטולי חרוזים לתוך צינור חדש.

לאחר הסרת כל החרוזים שנותרו פעמיים נוספות, כפי שהודגם זה עתה, סובב את התאים. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים החיוביים ל-CD4 חיוביים ל-Vδ1 במדיום טרי ומחומם מראש לספירה.