טכניקת מבחנה לחקר טיפולים אנטי-מיקרוביאליים על אגרגטים חיידקיים

כדי לחקור את ההשפעה של אנטי-מיקרוביאלים על אגרגטים של חיידקים, קח תרבית Pseudomonas aeruginosa במצע גידול המקדם היווצרות אגרגטים - המדמה צמיחה במהלך זיהום.

החיידקים המהונדסים מבטאים חלבון פלואורסצנטי לזיהוי אגרגט במיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונה בתלת מימד כדי לחשב את נפח האגרגטים, או הביומסה החיידקית, ולדמיין את הגידול בביומסה לאורך זמן, מה שמעיד על צמיחת חיידקים.

הוסיפו קוליסטין - פפטיד אנטי-מיקרוביאלי קטיוני - בריכוז תת-קטלני שהורג חיידקים רגישים תוך בחירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה.

קוליסטין נקשר לליפופוליסכרידים בעלי מטען שלילי, או LPS, על הממברנה החיצונית של החיידקים, ומחליף גשרים קטיוניים המייצבים את ה-LPS חד-שכבתי - ופוגעים בשלמות הממברנה.

קוליסטין נכנס לפריפלזמה ונקשר ל-LPS על קרום התא, משבש את הממברנה וכתוצאה מכך ליזה של תאים. כמנגנון נגד, מוטציות גנטיות ספציפיות בתת-קבוצה של חיידקים מנטרלות את המטען השלילי של LPS. שינוי זה מעכב את האינטראקציה האלקטרוסטטית של קוליסטין קטיוני עם LPS פחות אניוני - ומונע מוות של תאים.

תמונה להמחשת ירידה בביומסה עם הזמן, המציינת את ההשפעה של האנטי-מיקרוביאלי. הוסף פרופידיום יודיד או PI - צבע פלואורסצנטי - שנכנס דרך הממברנה הפגועה כדי לקשור DNA, ומסמן רק את התאים המתים.

בצע מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, או FACS, המפריד בין תאים רגישים המסומנים על ידי PI לבין תאים עמידים לאנטיביוטיקה עם תווית פלואורסצנטית. התאים מוכנים לבדיקות במורד הזרם.

כדי לדמות את אגרגטים של Pseudomonas aeruginosa על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, בסוף הדגירה, ייעד שלוש בארות של לוחית התרבית כטיפול אנטיביוטי משוכפל בבאר אחת כ"בקרת ללא טיפול", והנח את הצלחת על השלב המחומם של המיקרוסקופ.

בחר יעד טבילה של 63 פעמים בשמן, ופתח את הכרטיסייה איתור כדי לזהות את אגרגטים החיידקים בשדה הבהיר. הגדר אזור להדמיה בתוך כל באר, והשתמש במודול המיקומים כדי לאחסן את מיקום השטח. הגדר את אורך גל העירור ל-488 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ל-509 ננומטר.

במודול Acquisition, בחר באפשרות Z-Stack כדי להשיג את התמונות, והשתמש במודול Line Averaging כדי להפחית את הקרינה ברקע בערוץ GFP בנפח הכולל של תמונות Z-stack. הגדר את אפשרות סדרת הזמן ללכוד 60 פרוסות בכל באר במרווחים של 15 דקות למשך 18 שעות, והשתמש באסטרטגיית המיקוד המוגדרת כדי לאחסן מישור מוקד עבור כל מיקום שיצולם מחדש בכל נקודת זמן במהלך הניסוי.

4.5 שעות לאחר הגדרת ניסוי ההדמיה, דמו כל מיקום כדי לקבוע את הביומסה המצטברת בכל אחת מארבע הבארות לפני הוספת האנטיביוטיקה. לאחר שש שעות, הוסיפו בעדינות אנטיביוטיקה פי שניים מתחת לריכוז המעכב המינימלי לאמצע כל באר, ממש מתחת לממשק האוויר-נוזל, ולחצו על התחל ניסוי כדי להתחיל בהדמיה שלאחר הטיפול האנטיביוטי.

כדי לבודד את התאים החיים, בתום תקופת ההדמיה של 18 שעות, סמנו את החיידקים בכל באר בנפח המתאים של פרופידיום יודיד, בהתאם להמלצות היצרן. בתום הדגירה, השתמש במיכל מבודד כדי להעביר את הצלחת לציטומטר הזרימה, והגדר את הציטומטר לזהות GFP ופרופידיום יודיד באמצעות זרבובית של 70 מיקרון. לאחר מכן, הפעל 1 מיליליטר של כל תרבית סופרנטנט בקצב הזרימה הנמוך ביותר כדי למיין את אגרגטים שליליים של Pseudomonas aeruginosa חיוביים ל-GFP ושאינם ברי קיימא.