אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בבדיקת דיכוי אנושי במבחנה כדי למדוד את תפקוד ה-treg ולצפות פוטנציאלית אובדן עתידי בתפקודם. זה מושג על ידי הכנה ובדיקה ראשונית של חרוזים מקודדים, שישמשו כממריצים לתאים. השלב השני הוא לבודד CD נאיבי טהור ארבעה תאי CD חיוביים 25 תאי T שליליים ב-vivo המופעלים CD ארבעה חיוביים, CD 25 תאי T נמוכים ורגולטוריים ארבעה תאי CD 25 חיוביים T N כדי להקרין PP BMCs לשימוש כתאים מציגי אנטיגן או APCs.

התרביות הבודדות הבאות מוגדרות מתאי T נאיביים או מופעלים כמגיבים עם P BMCs כ-APCs או תרביות משותפות באותם תנאים, אך עם טרגים שנוספו ביחס של 1 ל-10. השלב האחרון הוא לקצור את התאים ולמדוד את התפשטותם על ידי טריטיאט. שילוב תימידין שהתקבל בסופו של דבר יכול להדגים הבדלים בדיכוי תגובות תאי T נאיביות לעומת תגובות תאי T המופעלות in vivo.

שמי ג'ף וודקליף. תאי T רגולטוריים אינם מבטאים סמנים ייחודיים על פני התא. לכן, על מנת למדוד באופן אמין את תפקודם, יש לבודד אותם באמצעות טכניקות, תוך מתן ההפרדה הטובה ביותר.

היתרון העיקרי בשימוש במיון תאים מופעל פלואורסצנטי על פני שיטות אחרות כמו בידוד מקסימלי, הוא שהפקס מציע את אוכלוסיות התאים הטהורות שניתן להשיג. לאחר מכן ניתן לבדוק באופן אמין את תפקוד התא במבחני דיכוי חוץ גופיים כפי שמודגם כאן עם זאת, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד ה-treg בבריאים ובנבדקים הקשורים לסוכרת מסוג 1. ניתן ליישם אותו גם על מחלות אוטואימוניות אחרות כגון דלקת מפרקים שגרונית אנושית, זאבת מערכתית, מיטוזה, טרשת נפוצה ואחרות לציפוי חרוזים מופעלים עם CD 3 אנטי אנושי.

הוסף מיליליטר אחד של חרוזי M 4 50 toil המופעלים מהבקבוקון המקורי לתוך צינור של 1.5 מיליליטר, והנח את הצינור במעמד מגנטי עד שכל החרוזים נדבקו לצד הצינור. לאחר מכן הסר את מאגר החרוזים על ידי פיפטינג החוצה כשהצינור עדיין במעמד המגנטי. לאחר מכן הוציאו את הצינור מהמעמד המגנטי והוסיפו מיליליטר אחד של מאגר.

הנח את הצינור במעמד המגנטי שוב ושוב. הסר את המאגר בזמן שהצינור נמצא במעמד המגנטי. החייאה, השעו את החרוזים במיליליטר אחד של חיץ אחד שוב.

הפעם הוסיף גם 40 מיקרוליטר של CD 3 אנטי אנושי. מערבבים את החרוזים והנוגדנים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן הוסף 0.1% משקל לכל כרך BS, A, והמשך להתסיס במשך 16 השעות הבאות.

לאחר מכן, שטפו את החרוזים פעמיים עם מאגר שניים על ידי דגירה של החרוזים במיליליטר אחד של חיץ. שניים למשך חמש דקות בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הסרת המאגר בזמן שהצינור נמצא במעמד המגנטי. לאחר מכן שוטפים את החרוזים פעם נוספת באותם תנאים סטריליים.

הפעם באמצעות מיליליטר אחד של בופר שלוש, בדוק את יעילות ציפוי הנוגדנים על ידי הוספת מספר משתנה של חרוזים מצופים CD שלושה לתא על מנת לקבוע את היחס האופטימלי ו-ALI המצטט 50, 020 5, 000 P BMCs לבאר בשלוש פעמים בצלחת כדור 96. לאחר 72 שעות בתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הוסיפו מיקרו קארי אחד של תימידין טריטי והמשיכו לדגור במשך 16 השעות הבאות. קצרו את התאים בצלחת קציר מרובת מסכים או דומה.

הוסף נוזל נצנוץ וקרא את הספירה לדקה או CPM לבאר. באמצעות מונה נצנוץ N XT בספירה העליונה, או דומה, קבע את יחס החרוז לתא באמצעות זה שנותן A CPM באופן עקבי מעל 5,000, אך פחות מ-15,000 מניסיוננו. יחס של שלושה חרוזים לתא נותן בדרך כלל את הגירוי האופטימלי הן לתאי המגיבים והן לתאי הטרג בכל הנבדקים האנושיים שנבדקו.

מלאו צינור חרוטי של 50 מיליליטר ב -15 מיליליטר פלוס. לאחר מכן בצע דילול אחד עד שישה של 50 מיליליטר של מעיל באפי על ידי הוספת 250 מיליליטר PBS לצינור הדם. הניחו לאט לאט 25 מיליליטר של מעיל הבאפי המדולל על גבי חבילת הפיאל מבלי להפריע לשכבות.

צנטריפוגה בטמפרטורה של 800 פעמים G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כשההפסקה כבויה אסוף בזהירות את שכבת ה-PBMC, שהיא שלב הביניים הלבן בין פיאל למאגר. במידת הצורך, מגרדים תאים מדופן הצינור.

המתן מספר דקות ואסוף אותם משלב הביניים שוב. העבירו את התאים לצינורות טריים של 50 מיליליטר ושטפו אותם על ידי מילוי הצינורות בכדור PBS. ה- PBM cs.

חזור על שלב הכביסה פעמיים בכל פעם. שילוב של שני כדורי תאים לצינור יחיד, בסופו של דבר שלב את כל כדורי התא לצינור יחיד של 50 מיליליטר. לאחר מכן השתמש ב -20 מיקרוליטר של התאים התלויים כדי לקבוע את כדאיות התא על ידי אי הכללה של טריאן כחול.

בדוק ליצור APCs על ידי העברת מיליליטר אחד של ה-pbmc הבר-קיימא לתוך צינור חדש. לאחר מכן הוסף ארבעה מיליליטר של מדיה והקרין את התאים עם 5,000 ראדים מעל הצינור המכיל את שאר ה-P BMCs עם מאגר PBS. לאחר מכן לאחר סיבוב התאים ב -250 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בארבעה מיליליטר מאותה תערובת.

לאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של מקסימום אנטי CD ארבעה מיקרו-חרוזים ל-pbmc ודגר את תערובת התאים והחרוזים בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את התאים ב-40 מיליליטר של מאגר PBS, ולאחר מכן גלולו את התאים. לאחר מכן שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בשמונה מיליליטר של מאגר Degas PBS בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, השתמש במסנני הפרדה מראש כדי לסנן להפריד את מתלה התאים. לאחר מכן חלקו את ה-PBM CS לשני צינורות של 15 מיליליטר. הוספת ארבעה מיליליטר של ה-P BMC לכל צינור.

עבה מצמיד שני עמודים למפריד מינימקס ומניח צינורות איסוף מתחת לכל עמודה. לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר של מאגר PBS DGAs לכל עמודה כאשר לא נותר מאגר, שכב את כל תמיסת התאים של ארבעה מיליליטר מכל צינור מעל העמודות לפני שמתלה התא נגמר לחלוטין. הוסף שלושה מיליליטר של מאגר PBS בטמפרטורת החדר של DGAs לכל עמודה ותן למאגר לעבור לתוך צינורות האיסוף.

הוסף עוד מאגר עד שהוא יוצא צלול. פיפטה חמישה מיליליטר נוספים של ה-DGAs חוצצים על עמודות ה-LS, ולאחר מכן הסר את עמודות ה-LS ממפריד המינימקס. הנח את העמודים בצינורות איסוף סטריליים חדשים של 50 מיליליטר.

תן לחצי מיליליטר להיגמר ואז לצלול לאט לאט את שאר הנפח החוצה, שהוא בערך ארבעה מיליליטר. כעת שלב את שני התקליטורים ארבעה שברים חיוביים. לאחר מכן הוסיפו עד 50 מיליליטר PBS לצינור וספרו את התאים לאחר סיבוב התאים ב-400 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

השעו מחדש את התאים בשני מיליליטר של מאגר PBS. שלב את הנוגדנים שישמשו לצביעה עובדתית לתוך שפופרת אחת נגד CD 14, CD 32, CD אחד 16 ואופציונלי אנטי CD ארבע. קח מינוי של תערובת לצביעה של FLUOROCHROME מינוס צינור אחד.

הכן את צינור ה-FMO על ידי העברת חמישה מיקרוליטר של תרחיף תאי המיליליטר של הצינור לצינור פקס וצבוע את התאים בשני מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים שהוכן קודם לכן. לאחר מכן, הוסף תאים לא מוכתמים וחרוזים המצופים ב-IgG של עכבר כדי להיות מוכתמים בפלואורוכרום יחיד לשפופרות פקס בודדות חדשות לשימוש כבקרות פיצוי למיון תאים. לאחר מכן הוסף לקוקטייל 50 מיקרוליטר CD 25 PE אנטי אנושי והוסף את הקוקטייל לשאר מתלה התא.

דגרו את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה של התאים עם קוקטייל הנוגדנים, הוסף מאגר PBS לתאים ולאחר מכן גלול אותם Resus. השעו את הגלולה במאגר PBS בריכוז של 10 עד שבעה תאים למוביל מיליליטר.

השתמש בצינור FMO כדי להגדיר את הסף למיון של תאי T חיוביים CD 25. באמצעות אסטרטגיית שער זו, ראשית, הגדר הליכה סביב התאים השליליים של פיט על מנת לא לכלול את התאים החיוביים של פיץ, הכוללים מונוציטים, מקרופאגים וכל שאר תאי CD חיוביים שאינם T כפי שמודגם באיור זה. בתרשים נפרד, צייר הליכות עבור תאי CD 25 שליליים ו-CD 25 תאי T נמוכים ותאי CD 25 גבוהים כמו באיור זה.

לאחר הזרימה, מיון תת-קבוצות התאים, גלולה את צינורות האיסוף ולאחר מכן שמור את תא ה-T על קרח עד לציפוי. סמן צלחת באר תחתונה U 96 כפי שמוצג בטבלה. השעו 50 מיקרוליטר של CD שלושה חרוזים מצופים המחושבים לשלושה חרוזים לכל תא מגיב לריכוז באר במדיה שלמה עם סרום AB אנושי מאוגד ב-10% בצלחת 96 הבארות, ואז דלל את ה-APCs שהוקרנו בעבר במדיה לריכוז של חמישה פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר.

הוסף 50 מיקרוליטר מהתאים לצלחת 96 הבארות, ולאחר מכן הוסף 2.5 כפול 10 לארבעת ה-CD ארבעה חיוביים CD 25 שלילי או CD ארבעה חיוביים CD 25 תאי T נמוכים לבאר במשולש הוסף tregs לשורה B ולבארות המסומנות כ-tregs רק של התרבות המשותפת ביחס של 1 ל-10 כפי שמוצג כאן. לאחר מכן דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5% CO2 בלחות רוויה למשך 72 שעות. לאחר מכן, דופק את התאים עם מיקרו קירי אחד של תימידין טריטי ולאחר מכן המשך את הדגירה ב-37 מעלות צלזיוס במשך 16 השעות הבאות לאחר שילוב התימידין בשעות האחרונות של התרבית המשותפת.

השתמש בקציר בן זוג מסנן כדי לקצור את התאים על צלחת קציר מרובת מסכים. לאחר מכן מכסים את צלחת הקטיף בכיסוי פלסטיק שקוף שמולא בעבר בנוזל נצנוץ. לבסוף קרא את ה-CPM לכל באר.

באמצעות מונה נצנוץ, ניתן לבודד תת-קבוצות של תאי T לטוהר גבוה על ידי מערכת זו, כפי שניתן לראות בסדרה הבאה של תרשימי נקודות: CD ארבעה תאי T חיוביים CD 25 שליליים מוצגים כאן בשער התחתון. באיור הבא ניתן לראות כאן ארבעה תאי CD חיוביים 25 נמוכים מטוהרים מאוד. אוכלוסייה טהורה של זרימה ממוינת CD ארבע חיובי.

CD 25 תאי טרג גבוהים מוצגים בבקרת השער העליון. תרביות מסוג תא בודד של APCs ו-tregs מנבדקים בריאים הראו התפשטות מועטה עד ללא התפשטות על פני הרקע כפי שנמדד על ידי שילוב תימידין, בעוד שתאי CD 25 נאיביים שליליים ומופעלים ב-vivo CD 25 נמוכים הראו התפשטות ניכרת המדוכאת כאשר סוגי תאי תגובה אלה מתורבתים יחד עם תאי treg. למרות שנצפו הבדלים קלים ביכולת של tregs לדכא את המגיב, CD 25 נאיבי ומופעל in vivo, CD 25 נמוך, נצפו תאי T נמוכים.

זו לא הייתה שליטה משמעותית. תרביות מסוג תא בודד של APCs ו-Tregs מנבדקים בסיכון הראו התפשטות מועטה עד ללא התפשטות על פני הרקע כפי שנמדד על ידי שילוב תימידין. בעוד שתאי CD 25 שליליים נאיביים ו-InVivo המופעלים על ידי InVivo, תאי T נמוכים הראו רמות נמוכות יותר של התפשטות בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה.

תאי ה-T המגיבים דוכאו עוד יותר על ידי טרגים ותרביות משותפות מכיוון שהבדיקה מניבה תוצאות אמינות. בנוסף אנו יכולים להסיק כי ערכי CPM נמוכים מצביעים על פגמים פוטנציאליים בהעברת אותות, אותם יש לחקור עוד יותר בסוג אחר של מחקר. עם זאת, ההבדל ביכולת של תאי T שליליים CD 25 לעומת תאי T עם תגובה נמוכה CD 25 בנבדקים בסיכון היה משמעותי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחבר בצורה חלקה את כל השלבים הדרושים לבדיקה תפקודית מוצלחת ואמינה לנוכחות Tregs אצל נבדקים בריאים ונבדקים עם מערכת חיסונית פגומה. לדוגמה, בנבדקים עם סוכרת מסוג 1.