אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשתמש במבחן דיכוי אנושי in vitro כדי למדוד את תפקוד תאי ה-treg ולחזות פוטנציאלית אובדן עתידי בתפקודם. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנה ובדיקה של חרו지를 קוד (coded beads), שישמשו כממריצים תאיים. השלב השני הוא בידוד של תאי T נאיביים טהורים CD4+ CD25-, תאי T מופעלים in vivo שהם CD4+ CD25 low, ותאי T רגולטוריים CD4+ CD25 high, יחד עם תאי PP BMCs שהוקרנו לשימוש כתאים מציגי אנטיגן (APCs).

בשלב הבא מקימים תרביות בודדות של תאי T נאיביים או מופעלים כמרכיבי תגובה, יחד עם BMCs של פציינטים כ-APCs, או תרביות משותפות (co-cultures) תחת אותם תנאים, אך בתוספת של tregs ביחס של 1 ל-10. השלב הסופי הוא קצירת התאים ומדידת השגשוג שלהם באמצעות שילוב של Thymidine טריטיומי. התוצאות המתקבלות בסופו של דבר יכולות להדגים הבדלים בדיכוי של תגובות תאי T נאיביים לעומת תאי T שהופעלו in vivo.

שמי ג'ף וודקליף. תאי T רגולטוריים אינם מבטאים סממנים ייחודיים על פני התא. לכן, כדי למדוד את תפקודם באופן מהימן, יש לבודד אותם באמצעות טכניקות המעניקות את ההפרדה הטובה ביותר.

היתרון המרכזי בשימוש במיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) על פני שיטות אחרות כגון בידוד מקסימלי, הוא אוכלוסיות התאים הטהורות שניתן להשיג באמצעות FACS. תפקוד התאים ניתן לאחר מכן לבדיקה באופן מהימן במבחני דיכוי in vitro כפי שהודגם כאן. למרות זאת, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תפקוד ה-Treg בנבדקים בריאים ובנבדקים הקשורים לסוכרת מסוג 1. ניתן ליישמה גם במחלות אוטואימוניות אחרות כגון דלקת מפרקים שיגרונית בבני אדם, לופוס סיסטמי (ery mitosis), טרשת נפוצה ואחרות. כדי לצפות חרוזי TAAL מופעלים ב-anti-human CD3.

הוסיפו מיליליטר אחד של חרוזי M four 50 toil מופעלים מהבקבוק המקורי לשפופרת של 1.5 מיליליטר, והניחו את השפופרת במעמד מגנטי עד שכל החרוזים ייצמדו לדופן השפופרת. לאחר מכן, הסירו את בופר החרוזים על ידי שאיבתם בעזרת פיפטה בעוד השפופרת נמצאת במעמד המגנטי. הוציאו את השפופרת מהמעמד המגנטי והוסיפו מיליליטר אחד של בופר 1.

הצב את המבחנה במעמד המגנטי שוב ושוב. הסר את התמיסת הבופר בעוד המבחנה נמצאת במעמד המגנטי. השהה מחדש את החרו지를 ב-1 mL של בופר 1.

הפעם נוסיף גם 40 µL של anti-human CD3. יש לערבב את החרו지를 והנוגדן בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, נוסיף 0.1% w/v BSA ונמשיך בערבוב למשך 16 השעות הבאות.

בשלב הבא, שטפו את החרו지를 פעמיים בבופר 2 על ידי דגירה של החרוזים ב-1 mL של בופר 2 למשך חמש דקות בטמפרטורה של 2°C עד 8°C, ולאחר מכן הסירו את הבופר בעוד המבחנה נמצאת במעמד המגנטי. לאחר מכן, שטפו את החרוזים פעם נוספת תחת אותם תנאי סטריליות.

הפעם, באמצעות שימוש ב-1 mL של בופר 3, בדקו את יעילות ציפוי הנוגדנים על ידי הוספה של מספר משתנה של חרו지를 מצופים ב-CD3 לכל תא, וזאת כדי לקבוע את היחס האופטימלי ואת ה-ALI; זריעו 50,000 PBMC לכל באר בשלוש חזרות בלוח 96 באערות. לאחר 72 שעות של תרבית ב-37 °C, הוסיפו 1 µCi של תימידין טריטיום והמשיכו בדגירה למשך 16 השעות הבאות. קצרו את התאים בלוח קציר רב-מסננת או בלוח דומה.

הוסיפו נוזל סינצילציה ומדדו את מספר הספירות לדקה (CPM) לכל באר. באמצעות מונה סינצילציה מסוג TopCount NXT, או מכשיר דומה, קבעו את היחס בין החרוזים לתאים; מניסיוננו, היחס המתאים הוא זה שנותן CPM בעקביות מעל 5,000 אך פחות מ-15,000. יחס של שלושה חרוזים לתא נותן בדרך כלל את הגירוי האופטימלי הן עבור תאי responder והן עבור תאי treg בכל הנבדקים האנושיים שנבחנו.

מלאו מבחנה קונית של 50 milliliter ב-15 milliliters של fal plus. לאחר מכן בצעו דילול של אחת לשש ל-50 milliliters של buffy coat על ידי הוספת 250 milliliters של PBS למבחנה עם הדם. העבירו באיטיות 25 milliliters של ה-buffy coat המדולל מעל ה-fial pack, מבלי להפר את השכבות.

בצעו סרטיפוגה במהירות של 800 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כאשר הבלם (brake) כבוי, אספו בזהירות את שכבת ה-PBMC, שהיא הפאזה הבינונית הלבנה שבין ה-fial לבאפר. במידת הצורך, גרדו תאים מדפנות המבחנה.

המתינו מספר דקות ואספו אותם שוב מהפאזה הבינונית. העבירו את התאים למבחנות חדשות של 50 milliliter ושטפו אותם על ידי מילוי המבחנות ב-PBS pellet. ה-PBM cs.

חזור על שלב השטיפה פעמיים בכל פעם. איחד שני משקעי תאים לשפופרת אחת, ובסופו של דבר איחד את כל משקעי התאים לשפופרת אחת של 50 milliliter. לאחר מכן, השתמש ב-20 microliters של התאים התלויים כדי לקבוע את חיוניות התאים באמצעות הדחה של tripan blue.

ייצרו APCs לצורך בדיקה על ידי העברה של 1 mL של pbmc חיות למבחנה חדשה. לאחר מכן, הוסיפו 4 mL של מצע גידול והקרינו את התאים ב-5,000 rads. מלאו עד הסוף את המבחנה המכילה את יתר ה-P BMCs בתמיפת PBS. לאחר סבוב של התאים ב-250 ×g למשך 10 דקות ב-4 °C, שפכו את העלייה ותלה את התאים ב-4 mL מאותה תערובת.

לאחר מכן, הוסף 200 µL של max anti CD4 microbeads ל-pbmc והדגר את תערובת התאים והחרוזים בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות. לאחר ההדגרה, שטוף את התאים ב-40 mL של PBS buffer, ולאחר מכן השק תאים. לאחר מכן, שפוך את העלייה (supernatant) ותלה את התאים שוב ב-8 mL של Degas PBS buffer בטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, השתמשו במסנני הפרדה כדי לסנן ולהפריד את תרחיף התאים. לאחר מכן, חלקו את ה-PBM CS לשתי מבחנות של 15 מיליליטר. הוסיפו ארבעה מיליליטר של P BMCs לכל מבחנה.

הצמד שתי עמודות למפריד minimax והצב מבחנות איסוף מתחת לכל עמודה. לאחר מכן, הוסף 3 mL של בופר DGAs PBS לכל עמודה. כאשר לא יישאר בופר, שפוך את כל 4 mL של תמיסת התאים מכל מבחנה על העמודות לפני שסספנסיות התאים יגמרו לחלוטין. הוסף 3 mL של בופר DGAs PBS בטמפרטורת החדר לכל עמודה והנח לבופר לזרום אל מבחנות האיסוף.

הוסיפו עוד בופר עד שנוזל השטיפה יהיה צלול. העבירו בעזרת פיפט 5 mL נוספים של בופר DGAs על עמודי ה-LS, ולאחר מכן הוציאו את עמודי ה-LS מהמפריד minimax. העבירו את העמודים למבחנות איסוף סטריליות חדשות בנפח 50 mL.

הניחו לחצי מיליליטר לזרום החוצה ולאחר מכן דחפו באיטיות את שאר הנפח, שהם כארבעה מיליליטרים. כעת, שלבו את שני השברים החיוביים ל-CD4. לאחר מכן, הוסיפו עד 50 מיליליטר של PBS למבחנה וספרו את התאים לאחר סבוב (spinning) של התאים ב-400 $\times$g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

יש להשעות מחדש את התאים בשני מיליליטר של בופר PBS. יש לשלב בשפרובה אחת את הנוגדנים שישמשו לצביעה: anti CD 14, CD 32, CD 16 ואופציונלית anti CD 4. יש לקחת מנה (aliquot) מהתערובת לצביעת שפרובת הפחות-פלואוכרום (FLUOROCHROME minus one).

הכינו את מבחנת ה-FMO על ידי העברה של 5 µL מתלי השהייה של התאים למבחנת fax וצבעו את התאים עם 2 µL מתערובת הנוגדנים שהוכנה מראש. לאחר מכן, העבירו תאים לא צבועים וחרו지를 מצופים ב-mouse IgG לצביעה עם פלואורוכרום בודד למבחנות fax נפרדות וחדשות, לשימוש כביקורות פיצוי (compensation controls) עבור מיון תאים. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של anti-human CD 25 PE לתערובת והוסיפו את התערובת לשארית תלי השהייה של התאים.

דגרו את המבחנות בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. לאחר דגירת התאים עם תערובת הנוגדנים, הוסיפו לתאים באפר PBS ולאחר מכן השקיעו אותם בצנטריפוגה. השביו את המשקע בבאפר PBS בריכוז של 10⁷ תאים ל-mL.

השתמש במבחנת ה-FMO כדי לקבוע את סף המיון של תאי T חיוביים ל-CD 25. באמצעות אסטרטגיית הגבוב (gating) זו, קבע תחילה גבוב סביב התאים השליליים ל-fitz כדי להוציא את התאים החיוביים ל-fitz, הכוללים מונוציטים, מקרופאגים וכל שאר התאים שאינם תאי T והם חיוביים ל-CD four, כפי שמוצג באיור זה. בגרף נפרד, שרטט גבובים עבור תאי T שליליים ל-CD 25 ותאי T עם ביטוי נמוך של CD 25, ועבור תאי treg עם ביטוי גבוה של CD 25, כפי שמוצג באיור זה.

לאחר הזרימה ומיון תתי-אוכלוסיות התאים, השקיעו את התאים במבחנות האיסוף ושמרו את תאי ה-T על קרח עד לזריעה. סמנו פלטת 96 בארות בעלת תחתית בצורת U כפי שמוצג בטבלה. תלו בתוך פלטת 96 הבארות מנה של 50 µL של חרוזי CD3 מצופים, בריכוז שחושב ל-3 חרוזים לכל תא מגיב לכל באר, בתוך מצע גידול מלא עם 10% pooled human AB serum, ולאחר מכן דללו את תאי ה-APCs שהוקרנו קודם לכן במצע לריכוז של 5×10⁵ תאים ל-mL.

הוסיפו 50 µL של תאים ללוחית 96 בארות, ולאחר מכן הוסיפו 2.5 × 10⁴ תאי T מסוג CD4⁺ CD25⁻ או CD4⁺ CD25ˡᵒ לכל בארה בשלוש חזרות. הוסיפו Tregs לשורה B ולבארים המסומנות כ-Tregs בלבד של התרבית המשולבת (co-culture) ביחס של 1:10 כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, דגרו את הלוחית בטמפרטורה של 37 °C בתוך אינקובטור עם 5% CO2 בלחות רוויה למשך 72 שעות. בשלב הבא, בצעו דחיפה (pulse) של התאים עם 1 µCi של thymidine טריטיומי, והמשיכו בדגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך 16 השעות הבאות, לאחר שה-thymidine נטמע בשעות האחרונות של התרבית המשולבת.

השתמשו ב-filter mate harvester כדי לקצור את התאים מלוח קצירה רב-מסננים (multi-screen harvest plate). לאחר מכן, כסו את לוח הקצירה במכסה פלסטיק שקוף שמולא מראש בנוזל סינצילציה. לבסוף, קראו את ה-CPM לכל באר.

באמצעות מונה סינטילציה, ניתן לבודד תתי-אוכלוסיות של תאי T בדרגת טהרה גבוהה באמצעות מערכת זו, כפי שניתן לראות בסדרה הבאה של תרשימי פיזור (dot plots); תאי T חיוביים ל-CD4 ושליליים ל-CD25 מוצגים כאן בשער התחתון (bottom gate). בדמות הבאה, ניתן לראות תאי T שעברו טיהור גבוה, חיוביים ל-CD4 ונמוכים ל-CD25. אוכלוסייה טהורה של תאים חיוביים ל-CD4 שבודדו במיון זרימה (flow sorted).

תאי treg עם ביטוי גבוה של CD 25 מוצגים בבקרת השער העליונה. תרביות של סוגי תאים בודדים של APCs ותאי tregs מנבדקים בריאים הראו פרוליפרציה מועטה עד אפס מעל הרקע, כפי שנמדד על ידי שילוב תימידין, בעוד שתאי T נאיביים שליליים ל-CD 25 ותאי T עם ביטוי נמוך של CD 25 שהופעלו in vivo הראו פרוליפרציה ניכרת, המדוכאת כאשר סוגי תאי רספונדר אלו גודלים בתרבית משותפת עם תאי treg. עם זאת, נצפו הבדלים קלים ביכולתם של תאי tregs לדכא תאי T נאיביים שליליים ל-CD 25 ותאי T עם ביטוי נמוך של CD 25 שהופעלו in vivo.

זו לא הייתה ביקורת משמעותית. תרביות של סוג תא בודד של APCs ו-Tregs מנבדקים בסיכון הראו פרוליפרציה מועטה עד לא קיימת מעל לרקע, כפי שנמדד על ידי שילוב תימידין. לעומת זאת, תאי T נאיביים CD 25 negative ותאי T שהופעלו InVivo עם CD 25 low הראו רמות נמוכות יותר של פרוליפרציה בהשוואה לביקורות בריאות.

תאי T המגיבים עוכבו עוד יותר על ידי tregs ובתרביות משותפות (co cultures), מאחר שהבדיקה מניבה תוצאות מהימנות. ניתן להסיק בנוסף כי ערכי CPM נמוכים מרמזים על פגמים פוטנציאליים בהעברת אותות (signal transduction), אשר יש לבחון אותם מעמיק יותר בסוג אחר של מחקר. עם זאת, ההבדל ביכולתם של tregs לדכא תאי T מגיבים שליליים ל-CD 25 לעומת תאי T מגיבים עם ביטוי נמוך של CD 25 בנבדקים בסיכון היה מובהק.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחבר בצורה חלקה את כל השלבים הדרושים לביצוע בדיקה תפקודית מוצלחת ואמינה לנוכחות של Tregs בנבדקים בריאים ובנבדקים עם מערכת חיסונית פגועה. לדוגמה, בנבדקים עם סוכרת מסוג 1.