Name: במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: למדו את שיטת מבחן כיס הקרנית בעכברים לחקר אנגיוגנזה באמצעות basic FGF. מודל זה מאפשר מדידה מדויקת של צמיחת כלי דם חדשים בקרנית האווסקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחקר שלנו הוא נתמך על ידי תוכנית המחקר עירונית של, NIH National Eye Institute.

כל ציוד ריאגנטים בהם נעשה שימוש הם עקרים. פרוטוקול שאושר על ידי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה (ACUC) בשעה ניי / NIH (פרוטוקול המחקר בבעלי חיים ניי-553), וכן בוצע על פי הנחיות NIH והתקנות. 1. הפקת angiogenic גורם המכילים כדוריות בחלק זה, כדורי המכיל את גורם angiogenic עניין מוכנים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את 10% (w / v) פתרון sucralfate עם PBS. חנות מתחת לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את 12% (w / v) poly-המה עם אתנול אבסולוטי. חנות מתחת לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא 1 מיקרוגרם / פתרון bFGF μl. חנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את 50 כדורי, לערבב 5 μl של poly-המה, 1μl של sucralfate ו 4 μl של פתרון מניות bFGF, מערבולת ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת parafilm נקי בצלחת פטרי, לחשוף אותו תחת אור UV במשך 15 דקות במנדף בתרבית רקמה. Drop 0.2 μl של התערובת פתרון parafilm אחת גלולה. לפיכך, 10 μl של התערובת צריך פתרון תשואה 50 כדורי. בואו כדורי יבש בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. כדורי יבשים ניתן לאחסן 4 מעלות במשך כמה ימים, או -80 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השימוש, לחלץ ולאסוף את כדורי בקצות בזוג מלקחיים. היזהרו מאוד לא לשבור אותם או להפוך אותם באביב משם. </li></ol> 2. ביצוע הקרנית עכבר assay כיס בחלק זה, נדגים כיצד להכין כיס בתוך הקרנית העכבר כיצד להוסיף גלולה לכיס. גורם angiogenic הכלול גלולה ישוחררו בהדרגה והסביבה של הקרנית (איור 1). בהפגנה זו, אנו משתמשים 8 שבועות הנקבה C57/Bl6 עכברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכבר הוא עמוק בהרדמה שיטתי בתערובת של קטמין (75 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (5mg/kg, הזרקת ip). זה ימשיך את העכבר תחת הרדמה מדינה דקות 30-60. הרדמה מקומית (0.5% proparacaine HCl) על הקרנית. לאחר 5 דקות, לתקן עין אחת תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך עדין מאוד מורכב באמצע של 1.2 מ"מ -1.4 קרנית מן לימבוס הקרנית (כפי שמוצג באיור 1) עם סכין גרפה קטרקט פון. היזהרו מאוד לא לחתוך הקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיס עשוי מתחת לשכבת האפיתל של הקרנית על ידי החדרת אופקית את הסכין באמצע הקרנית ולהרחיב את הסכין לעבר בזהירות לימבוס (תמונה 1). גודלו של כיס צריך להיות גדול מספיק כדי להכיל גורם אחד המכיל angiogenic גלולה. היזהרו מאוד לא לנקב דרך הקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס גלולה עם זוג מלקחיים לכיס לאט. נסו להפוך את גלולה ישר ככל הניתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההשתלה של גלולה, משחה אנטיביוטית אקטואלי עיניים מוחל על העין. מכשירים הם ניגב עם רפידות אלכוהול 70% בין בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את העכבר לאזור חם ויבש ולנטר אותו, עד שהוא מסוגל לשמור על יציבה זקופה, ואז להחזיר אותו בכלוב בבית שלה. משככי כאבים מערכתית (למשל, עצירות, 2 מ"ג / ק"ג, הזרקת IP) משחה אנטיביוטית מקומית (למשל גנטמיצין) ניתנות פעמיים ביום למשך 2 ימים לאחר הניתוח והעכבר הוא פיקוח הדוק במשך 3 ימים. ריפוי צפויה להשלים בתוך 48 השעות הראשונות שלאחר הניתוח. העין עם הכיס תיבחן תחת בהיקף biomicro מנורת סדק בין 4-10 ימים לאחר ההשתלה גלולה. </li></ol> 3. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבעה ימים לאחר ההשתלה גלולה, העכבר הוא הרדים מערכתית ו topically כמתואר 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב כלי דם בקרנית הנגרמת על ידי גורם angiogenic תחת מיקרוסקופ לנתח. ב הקרנית שטופלו רכב, צמיחה אין כלי דם ניתן לראות (איור 2A, רכב שטופלו הקרנית). ב הקרנית שטופלו bFGF, אנגיוגנזה חזקים ניתן לראות (איור 2 ב). צמיחת כלי הדם ניתן להעריך באמצעות האורך המרבי של כלי הדם (מכלי limbal נורמלי העליון של כלי דם חדשים), וכן כלי דם באזורים הכולל (איור 2B, שמסומן עם קו מקווקו אדום bFGF שטופלו הקרנית). שיטות כימות אחרים יש גם תיאר 2,5. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הקרנית. רגיל עם H &amp; E מכתים. אין כלי דם קיים קרנית רגילה. B. הפוך כיס מתחת לשכבת האפיתל של הקרנית. ג. הטבעת גלולה לכיס. ד. גורם angiogenic הוא שוחרר מן גלולה, ואת כלי דם חדשים לגדול מ כלי limbal נורמלי. <img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. התוצאה נציג חמישה ימים לאחר imמטע של גלולה.. קרנית עם גלולה המכילה רק את הרכב. ללא היווצרות כלי דם חדשים בתוך הקרנית. רק קיימים כלי limbal נורמלי גלויים. B. קרנית עם bFGF גלולה המכילה. חסון כלי דם חדשים (dot מצופה) גדל מ קיימים כלי limbal נורמלי.

<ol><li>Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+angiogenic+activity+and+hypoxia+induction+of+heterodimers+of+placenta+growth+factor%2Fvascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor.</a> The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).</li>
<li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nature. 2, 2545-2550 (2007).</li>
<li>Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+as+a+transplantation+site+for+live+imaging+of+engineered+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-B+is+dispensable+for+blood+vessel+growth+but+critical+for+their+survival%2C+and+VEGF-B+targeting+inhibits+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).</li>
<li>Tong, S., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+angiogenesis+to+basic+fibroblast+growth+factor+in+rat+corneal+pocket+assay%3A+I.+Experimental+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations.</a> Microvascular research. 75, 10-15 (2008).</li>
<li>Muthukkaruppan, V., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the mouse cornea.</a> Science. 205, 1416-1418 (1979).</li>
<li>Ziche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+assay+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Corneal assay for angiogenesis.</a> Methods in molecular medicine. 46, 131-142 (2001).</li>
<li>Ziche, M., Morbidelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+pocket+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The corneal pocket assay.</a> Methods in molecular biology. 467, 319-329 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

קרנית העכבר כיס מודל assay תוארה לראשונה על ידי Muthukkaruppan VR ו R אורבך 6 בשנת 1979. פרוטוקולים מפורטים פורסמו על ידי מעבדות שונות 2,3,7,8. במעבדה שלנו יש שינוי בשימוש בשיטה זו במחקרים שלנו במשך שנים רבות 4. קרנית עכבר assay בכיס הוא מודל פשוט יחסית עם שחזור נהדר. יתרון נוסף של מודל זה היא כי מאז הקרנית בדרך כלל חסר כלי דם, יש כמות מינימלית של רקע assay זה. לכן, מודל זה הוא הנפוץ ידי השדה כדי לחקור את ההשפעה של גורמים angiogenic מולקולות שונות....

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> הביתור מיקרוסקופ </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> PZMIV-BS </td></tr><tr><td> פון גרפה קטרקט סכין (להב 1.5x25mm, שטוחה) </td><td> אמבלר כירורגי </td><td> 3401E </td></tr><tr><td> דומון # 5 מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11252-50 </td></tr><tr><td> מנורת סדק </td><td> Zeiss </td><td> 30 SL-M </td></tr></tbody></table> טבלה 1. ציוד <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> חברה </th><th> קטלוג # </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> bFGF (גורם בסיסי הצמיחה פיברובלסטים) </td><td> PEPROTECH בע&quot;מ </td><td> 100-18 ב </td><td></td></tr><tr><td> Sucralfate (octasulfate אלומיניום מורכבים סוכרוז) </td><td> סיגמא </td><td> S0652 </td><td> 10% PBS </td></tr><tr><td> poly-המה (פולי (2-hydroxyethyl methacrylate)) </td><td> סיגמא </td><td> P3932 </td><td> 12% אתנול </td></tr></tbody></table> טבלה 2. ריאגנטים וחומרים

במודל עכבר של assay את הקרנית pocket לחקר אנגיוגנזה

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

קרנית נורמלית ברורה של רקמות כלי הדם. עם זאת, כלי הדם יכול להיגרם לגדול לשרוד הקרנית כאשר גורמים angiogenic חזק מנוהלים 1. הייחוד הזה הפך את הכיס הקרנית assay אחד המודלים הנפוצים ביותר ללימודי אנגיוגנזה. קרנית מלחינה מספר שכבות של תאים. לפיכך, ניתן להטביע גלולה המכילה את גורם angiogenic עניין הקרנית לחקור השפעה angiogenic שלה 2,3. כאן, אנו מספקים צעד אחר צעד הפגנה של איך (אני) לייצר את גורם המכילים angiogenic גלולה (II) להטביע את הכדור לתוך הקרנית (III) לנתח את אנגיוגנזה הנגרמת על ידי גורם angiogenic של עניין. מאז פיברובלסטים בסיסי גורם הגדילה (bFGF) ידוע בתור אחד הגורמים החזקים ביותר angiogenic 4, הוא משמש כאן כדי לגרום אנגיוגנזה בתוך הקרנית.

הקרנית היא ייחודית בכך שהיא חסרה רקמות כלי הדם. עם זאת, כלי דם חזקים צמיחה והישרדות יכול להיגרם על הקרנית על ידי גורמים angiogenic עוצמה. לכן, הקרנית יכול לספק לנו עם כלי רב ערך עבור מחקרים angiogenic. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע את המודל של העכבר assay הקרנית כיס וכיצד להעריך את אנגיוגנזה המושרית על ידי גורמים angiogenic באמצעות המודל הזה.

במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה

קרנייה תקינה נקייה מרקמות וסקולריות. עם זאת, ניתן להשרות צמיחה והישרדות של כלי דם בקרנייה כאשר גורמים אנגיוגניים חזקים הם...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש במודל של בדיקת כיס בקרנית כדי לבחון את ההשפעה האנגיוגנית של basic FGF. הדבר משיג על ידי יצירת כיס בקרנית והחדרת גלולה של basic FGF לתוך הכיס. לאחר מכן, basic FGF משתחרר מהגלולה ומעודד צמיחה של כלי דם חדשים מכלי הדם הלימבליים.בסופו של דבר, פרוטוקול זה יכול להוביל לצמיחה חסונה של כלי דם חדשים מכלי הדם הלימבליים לעבר כדורית ה-basic FGF. שלום, אני Shuan מהמעבדה של Dr.Shiley במכון הלאומי INIH. היתרון המרכזי של מודל זה הוא היותו מודל פשוט יחסית עם הדירות גבוהה.יתרון נוסף הוא מכיוון שהקרנית הנורמלית נטולת כלי דם, הרקע נקי מאוד. כעת, לאחר שהבנו את הרעיון הכללי של המודל, אראה לכם שלב אחר שלב כיצד ליצור את מחלת נשירת תאי הקרנית.אם כן, נתחיל. כדי להיערך לפרוצדורה זו, הכינו את התמיסות הבאות: sate בריכוז 10% weight by volume ו-PBS, poly hema ואתנול בריכוז 12% weight by volume, ו-basic FGF בריכוז one gram per microliter. יש לאחסן את ה-basic FGF בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius, אך את שתי התמיסות האחרות ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר.כדי להכין 50 כדוריות של גורם אנגיוגני, ערבבו חמישה µL של תמיסת poly hema, מיקרוליטר אחד של תמיסת sate וארבעה µL של תמיסת basic FGF בתוך מבחנה ל-PCR בנפח 200 µL, ולאחר מכן ערבבו את התערובת היטב במכשיר vortex. כעת, הניחו מקטע של parfu

a-mouse-model-of-the-cornea-pocket-assay-for-angiogenesis-study

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הרקמות מבוגר vascularized יונקים כי חסרה אנגיוגנזה פיזיולוגי שלא נחשף התערבות כירורגית משמש המחקר: (i) ייזום ופיתוח של אנגיוגנזה הבאים הממשל intraperitoneal של סוכני הבדיקה; (ii) שינוי של אנגיוגנזה הבאים מערכתית של הממשל נבחרת סוכני הבדיקה.

עכברוש mesentery Assay אנגיוגנזה

סרטון זה מדגים את הפיתוח של מודל ex vivo של הנבטה כורואידית לחקר אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית. הבדיקה כוללת תרבית של צמחי עין עכבר המכילים את רקמת הכורואיד המחוברת ללובן העין ולאפיתל פיגמנט הרשתית בתנאים ספציפיים המקדמים הנבטה מיקרו-וסקולרית כורואידית.

בדיקת הנבטת כורואיד לחקר התפשטות כלי דם עיניים Ex Vivo

Neovascularization (NV) של הקרנית יכול לסבך פתולוגיות חזותיות מרובות. ניצול מודל פציעה מבוקרת, אלקלי צריבה, רמת כימות של NV בקרנית יכולה להיות מיוצרת למחקר מכניסטית של NV והערכה של קרנית של טיפולי פוטנציאל להפרעות neovascular.

פגיעה דגם אלקלי לשרוף של הקרנית neovascularization בעכבר

הפרוטוקול מתאר את assay micropocket הקרנית כפי שפותח בעכברים.

קרנית Micropocket Assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול הניאו-וסקולריזציה הכורואידלית (CNV) המושרה על ידי לייזר עכבר, מודל ניסיוני המשחזר את סימני ההיכר של כלי הדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל ניאו-וסקולרי (AMD). לאחר שליטה, הוא יכול לגרום באופן אמין ויעיל ל-CNV כמערכת מודל לבדיקת אמצעים ניסיוניים שונים.

מודל עכבר לneovascularization Choroidal מושרה לייזר

איריס כורוידאלית, סיבוך נפוץ של מחלת רשתית איסכמי, עלול להוביל סכנת הראייה neovascular גלאוקומה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מאתר להשראת כורוידאלית איריס ניסיוני העשויות לשמש להערכה לא פולשנית של חומרים להתכוונן אנגיוגנזה.

ניקוב-Induced כורוידאלית איריס כמודל העכבר של Rubeosis Iridis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתק את תאי הקרניות של הקרנית (CEC) מהקרום של האישה (DM) באמצעות "YAG" (בלייזר) של ממברנה הvivo לשעבר של המחלה של keratopathy בולולס (BK).

פיתוח של מודל פולשני, בסיוע לייזר של הקרנית הפסד של תא אנדותל

פרוטוקול זה מציג בדיקה נבטי choroid, מודל vivo לשעבר של התפשטות מיקרוווסקולרית. בדיקה זו יכולה לשמש כדי להעריך מסלולים המעורבים בהתרבות כלי מיקרו choroidal ולהעריך טיפולים תרופתיים באמצעות סוג פראי רקמת עכבר מהונדסים גנטית.

אקס ויוו צ'רויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית

פרוטוקול זה מתמקד בניאו-וסקולריזציה של הקרנית הנגרמת על ידי כוויות אלקליות בעכברים. השיטה מייצרת מודל למחלות קרנית הניתנות לשחזור ולשליטה כדי לחקור אנגיוגנזה פתולוגית ואת המנגנונים המולקולריים הקשורים ולבדוק סוכנים פרמקולוגיים חדשים למניעת ניאו-וסקולריזציה של הקרנית.

מודל עכבר לניאו-וסקולריזציה של הקרנית על ידי כוויה אלקלית

כאן, אנו מציעים שלוש שיטות שונות לפגיעה בסיבי החישה המעצבבים את הקרנית. שיטות אלה מקלות על חקר התחדשות האקסון בעכברים. שלוש שיטות אלה, הניתנות להתאמה למודלים אחרים של בעלי חיים, אידיאליות לחקר הפיזיולוגיה וההתחדשות של עצבוב הקרנית.

שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

חקירת אנגיוגנזה ברמה תפקודית ומולקולרית על ידי מינוף בדיקת נדידת פצע השריטה ובדיקת הנבטת הספרואיד

למדו את שיטת מבחן כיס הקרנית בעכברים לחקר אנגיוגנזה באמצעות basic FGF. מודל זה מאפשר מדידה מדויקת של צמיחת כלי דם חדשים בקרנית האווסקולרית.

במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה

גלה סרטונים נוספים