מיפוי מעגלים עצביים מעכבים ידי Photostimulation סריקת הליזר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את הארגון התפקודי המקומי של מעגלים עצביים מעכבים. ההליך מתחיל בהכנת פרוסות מוח חיות מקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית של עכברים. השלב הבא הוא לדמיין ולהקליט מ-GFP ממוקד המבטא סוגי תאים מעכבים בפרוסת המוח.

בעקבות גירוי צילום סריקת לייזר זה באמצעות גלוטמט, נעשה שימוש בפירוק להפעלת אשכולות קטנים של נוירונים פרה-סינפטיים כמעוררים או מעכבים. זרמים פוסט-סינפטיים נרשמים ב-GFP המבטאים בין נוירונים. השלב האחרון הוא לעבור גירוי תמונות, ניתוח נתונים ויצירת מפות כמותיות של קלט סינפטי לתאי העצב המוקלטים.

בסופו של דבר, גירוי צילום סריקת לייזר בשילוב עם הקלטות תאים שלמים מאפשר בניית מפות מפורטות של קלטים סינפטיים לסוגים ספציפיים של נוירונים מעכבים, מה שעשוי לאפשר קביעת הארגון והתפקוד של מעגלים מעכבים מקומיים בקליפת המוח. הטכניקה המבוססת על גירוי פוטו הייתה חלוצה על ידי ד"ר לארי כץ, נד קאלוויי, ופותחה עוד על ידי ד"ר קרולס וואבודה, ה-pi שלי, ד"ר שינג Z הוכשר עם ד"ר קאלוויי, מכון סאלק, שם הוא הוביל מחקרים רבים שחקרו מעגלים בין-אורליים. הקבוצה שלנו מרחיבה וממשיכה כעת את המחקרים הללו, וחוקרת מעגלים בין-אורליים.

כדי להתחיל בהליך זה, הקריבו עכבר טרנסגני שבועיים-שלושה לאחר הלידה על ידי עריפת ראש והסירו במהירות את המוח, הניחו את המוח בתמיסת חיתוך קפואה ומחומצנת. לאחר מכן השתמשו במשקפי GFP כדי לסנן חזותית את המוח ולבדוק אם יש ביטוי GFP. לאחר מכן, חתכו את קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית למקטעים בעובי של 400 מיקרומטר בעזרת ויברטור.

דגרו את הפרוסות בסוכרוז המכיל A CSF מבעבע עם 95% O2 ו-5% CO2 ב-32 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעה. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות ל-A CSF הרגיל בטמפרטורת החדר כדי להכין את הלייזר לניסוי, הפעילו את מערכת קירור הלייזר וספק הכוח. לאחר מכן הפעל את כל החומרה הקשורה לבקרת גירוי צילום, כולל מערכת מראות הסריקה והמודולטור האופטי והתריס האלקטרוני, ומגבר כניסת פוטו-דיודה.

לאחר מכן, הפעל את הציוד האלקטרופיזיולוגי כגון מגבר מולטי מהדק 700 B ומניפולטורים מיקרו. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, גירוי צילום והדמיה מתבצעות בתא זלוף הפרוסות המותקן על הבמה הממונעת של המיקרוסקופ. לאחר מכן, הפעל את מצלמת ההדמיה, הפרוסה תוצג במיקרוסקופ זקוף עם DIC אינפרא אדום ואופטיקה פלואורסצנטית אפי דרך מערכת ההדמיה.

לאחר מכן פתח את תוכנת FS מבוססת MATLAB ותוכנת מצלמת לכידת Q על הצג. לפני הפעלת הניסוי, בדוק את מערכת גירוי צילומי הלייזר וודא שהיא במצב עבודה. הנח פיסת נייר מתחת למטרת המיקרוסקופ ארבע x כדי לצפות בדפוס סריקת הלייזר בזמן שהמערכת פועלת.

כדי ליצור את המיקרו אלקטרודה עם התנגדות של ארבע עד שש מגה OM, משוך אלקטרודת זכוכית עם מושך הפיפטה. לאחר מכן מלאו את האלקטרודה בתמיסה פנימית המכילה 0.1% ביוטין לתיוג תאים וזיהוי מורפולוגי. לאחר מכן, הפעל את מערכת הזלוף בלחץ כדי לשאוב CSF לתוך החדר.

הקפידו על רמת נוזלים קבועה של 2.0 מילימטרים מעל הפרוסה בתא. תוספת של תמיסת המלאי של גלוטמט בכלוב MNI מתווספת ל-25 מיליליטר של A CSF במחזור לריכוז של 0.2 מילי-מולרי גלוטמט בכלוב. לאחר מכן העבירו פרוסת מוח אחת לתא ההקלטה.

הפעל את מערכת ההדמיה כדי לבדוק את איכות הפרוסה ולאתר אנטומית את האזור הסומטוסנסורי הראשוני. לאחר מכן, עגנו את הפרוסה בטבעת פלטינה מיתרים בהתאמה אישית, והקפידו לא להניח את העוגן על אזור המוח המיועד להקלטה. דמיין את התאים עם מטרה של פי 60 המבוססת על הדמיה של ביטוי GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי DIC.

זהה ובחר את סוגי התאים המעכבים. שימו לב כי ההקלטה תתבצע בשליטה חזותית בסיוע DIC אינפרא אדום. ניטור וידאו ומעבר בין מצבי DIC ופלורסנט נחוצים כדי לאשר את מיקום תא ה-GFP תוך הורדת האלקטרודה לתא המטרה.

שימוש בטכניקת הידוק התיקון הקונבנציונלית. ראשית, הפעל לחץ חיובי על האלקטרודה. הזיזו אותו קרוב לפני התא כדי ליצור גומה ניכרת על קרום התא הממוקד.

לאחר מכן הפעל לחץ שלילי במהירות כדי ליצור חותם ג'יגה ולשבור את התא תוך ניטור תגובות ההזרקה הנוכחיות על צג הווידאו. עם הפריצה, צלם את התמונות של ה-GFP המוקלט המבטא תא עצב תוך בהגדלה של פי 60 תחת מצבי DIC ופלורסנט לאימות המקוון. לפני איסוף נתוני גירוי הצילום, הזרקו פולסים של זרם היפרפולריזציה ודה-פולריזציה כדי לבחון את התכונות האלקטרופיזיולוגיות הבסיסיות של כל תא.

לאחר יציבות, הקלטת תא שלם מושגת עם התנגדות גישה טובה, שהיא בדרך כלל פחות מ-20 מגה אוהם, החלף את מטרת המיקרוסקופ מהגדלה של 60 x לארבע x לגירוי תמונות סריקת לייזר, רכוש תמונת פרוסה בהגדלה של פי ארבעה והשתמש בה להנחיה ורישום אתרי גירוי הצילום. הגדר את הפרמטרים של גירוי הצילום ורכישת הנתונים על ידי הפעלת מודול מתג התצורה של phys. השתמש בפולס לייזר של אלפית שנייה של כ-20 מילי-וואט עם מרווח גירוי של שנייה אחת.

למיפוי גירוי תמונות, רכוש עקבות נתונים של שנייה אחת שנדגמה ב-10 קילו-הרץ. לאחר מכן, טען את תמונת ארבע x פרוסות למודול הממפה של phys. הגדירו את מיקום הסומה והגדירו את אתרי גירוי הצילום של תבנית 16 על 16 עם 80, מיקרומטר על 80 מיקרומטר.

מרווח סביב מיקום התא, המכסה את כל שכבות קליפת המוח. לאחר מכן מפה את פרופיל העירור של הנוירון המוקלט על ידי בחינת מיקומי הזינוק בתגובה לגירוי צילום במצב המהדק הנוכחי. התוכנה הידידותית למשתמש שלנו עם תכונות התצוגה המקוונת מקלה על ניסויי המיפוי.

לאחר מכן, מפה את חיבורי המעגל המעורר המקומי על ידי זיהוי הזרמים הפוסט-סינפטיים המעוררים מהתא המוקלט בעזרת סריקת לייזר במקומות שונים, החזק את התא ב-70 מילי-וולט שלילי במצב מהדק מתח כדי לזהות זרמים מעוררים פנימה. לאחר מכן חזור על מפות הזרם הפוסט-סינפטי המעורר פעמיים עד שלוש כאשר דפוס גירוי הצילום מסובב או מתהפך. כדי למפות את חיבורי המעגלים המעכבים המקומיים, זהה את הזרמים הפוסט-סינפטיים המעכבים מהתא המוקלט.

החזק את התא קרוב לאפס מילי-וולט במקרה זה, שלילי 15 מילי-וולט במצב מהדק מתח על מנת לזהות זרמים מעכבים כלפי חוץ. לאחר השלמת כל הבדיקות הפיזיולוגיות, הסר את האלקטרודה בעדינות מהתא המוקלט. הוציאו את פרוסת המוח מהתא, ואז קבעו אותה ב-4%para פורמלדהיד למשך הלילה, וצבעו את התאים המוקלטים כנגד ביוטין.

בניסוי זה נעשה שימוש בשילוב של ביטוי GFP, אלקטרופיזיולוגיה פנימית ומאפיינים מורפולוגיים כדי לסווג את הנוירונים המעכבים. המוצג. להלן הדוגמה ומפת נתונים גולמית להמחשת גירוי צילום סריקת הלייזר, המאפשר מיפוי נרחב של חיבורי מעגל קליפת המוח המקומיים לנוירון המעכב המוקלט. להלן הדוגמאות למפות הקלט הכמותיות המקודדות בצבע הנגזרות מהעקבות הגולמיות המוצגות זה עתה באיור D.משרעות האירועים הסינפטיים שזוהו בתא העצב המוקלט מקודדות בצבע ומונחות טופוגרפית על מיקומי גירוי הצילום.

מיקום גוף התא מסומן על ידי העיגול הפתוח האדום בסרגל קנה המידה. הצבעים החמים מצביעים על כניסות סינפטיות חזקות וצבעים קרים מצביעים על קישוריות חלשה או ללא קישוריות לתא הממוקד. באופן דומה, איור E מציג את מספר האירועים הסינפטיים לכל מיקום לא מדגום לנוירון המתועד.

איור F מדגים את זמן ההתחלה של האירוע הסינפטי הראשון שזוהה לתא המוקלט לאחר גירוי צילום בסרגל קנה המידה. הצבעים החמים מצביעים על קלט קצר, חביון וצבעים קרים יותר מצביעים על השהיה סינפטית ארוכה יותר. לפיכך, LSPS מאפשר בניית מפות מפורטות של המיקום, החוזק, ההשהיה ומספר הכניסות הפוגעות בסוגים ספציפיים של נוירונים מעכבים.

ובכן, בהשתתפות בהליך זה, חשוב להיות סבלני, לעשות מצב ניסוי נקי, אבל נוירון ביעילות ובזהירות רבה כדי לעבור מהגדלה גבוהה של אובייקט לשינוי נמוך. ואז השימוש האחרון בתוכנת קרקע טוב מאוד.