הדמיה ומיפוי של מסלולים עצביים בפרוסת מוח של אמיגדלה

במוח העכבר, האמיגדלה מכילה תאי עצב שיוצרים קשרים סינפטיים עם קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית, או נוירונים של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית.

קחו לדוגמה פרוסת מוח אמיגדלה שבה תאי העצב של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית מבטאים רודופסין ערוץ רגיש לאור שהתמזג לחלבון פלואורסצנטי.

הניחו את הפרוסה בתא הקלטה ודמיינו אותה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאתר את תאי העצב של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית.

עבור לתצוגת שדה בהיר והצג פיפטת תיקון המכילה פתרון פנימי.

הפעל לחץ חיובי כדי לקדם את הפיפטה לעבר נוירון אמיגדלה.

במגע עצבי נוצרת גומה.

החל יניקה ליצירת אטימה הדוקה.

המשך יניקה כדי לקרוע את הממברנה, וליצור מגע עם פנים התא.

האירו את הפרוסה כדי להפעיל את התעלה העצבית של mPFCרודופסין, לעורר זרם יונים חיובי, יצירת פוטנציאל פעולה ושחרור נוירוטרנסמיטרים.

המוליכים העצביים נקשרים לקולטני נוירונים באמיגדלה פוסט-סינפטיים, וגורמים לזרם יונים וליצירת זרם.

רשום את הזרם העצבי הפוסט-סינפטי כדי לנתח קישוריות mPFC-אמיגדלה.

כדי להכין את מיקרוסקופ התיקון להפעלה אופטוגנטית של סיבים ותאים, מרכז את הדיודה פולטת האור המותקנת, או LED, על מסלול אספקת האור. השתמש במד כוח כדי למדוד את עוצמת אור ה-LED במישור המוקד האחורי, ובפלט של כל מטרה באורך גל של 470 ננומטר. השתמש בגיליון אלקטרוני כדי לחשב את עוצמת האור במילי-וואט למילימטר בריבוע, וצור עקומת כיול עבור כל מטרה.

לאחר מכן, שלפו פרוסת אמיגדלה חריפה מתא הממשק, והניחו אותה בתא הפרוסות המותקן על המיקרוסקופ. מקם את הפרוסה כך שמשטח הפרוסה הפונה כלפי מעלה בתא הממשק פונה גם כלפי מעלה בתא ההקלטה. טפטפו את הפרוסה ב-ACSF טרי ומחומצן בקצב של 1 עד 2 מיליליטר לדקה. הטמפרטורה צריכה להיות בערך 31 מעלות צלזיוס. הפעל את מנורת הפלואורסצנט ובחר את ערכות המסננים המתאימות לחלבון הפלואורסצנטי הספציפי המתבטא. השתמש במטרה פי 5 כדי לקבל סקירה כללית.

לאחר מכן, פתח או הגבל את הצמצם במסלול האור של המיקרוסקופ, לפי הצורך לניסוי. כדי להשיג הקלטת תיקון, מלאו פיפטת תיקון בתמיסה פנימית והרכיבו אותה במחזיק האלקטרודה. הפעל לחץ חיובי על פיפטת התיקון, והורד אותה לאט לתמיסת האמבטיה. לאחר מכן, תחת שליטה חזותית, השתמש במיקרומניפולטור כדי להוריד את פיפטת התיקון לתוך הפרוסה. התקרב לנוירון המעניין עם פיפטת התיקון מהצד ומלמעלה.

שחרר את הלחץ החיובי כאשר הפיפטה מגיעה לפני השטח של התא, כפי שמצוין על ידי גומה הנראית על פני התא. הפעל לחץ שלילי כדי להשיג ג'יגה-סיל. הפעל יניקה נוספת כדי לקרוע את תיקון הממברנה ולהשיג את הקלטת התא השלם. לאחר מכן, גירוי הסיבים המסומנים עם הנורית המחוברת על ידי הפעלת channelrhodopsin עם אור באורך גל של 470 ננומטר תוך רישום תגובות חשמליות מהתא.

לגירוי סינפטי, השתמש ביציאות הדיגיטליות של תוכנת רכישת הנתונים כדי להפעיל את ה-LED. כוונן את עוצמת גירוי ה-LED באופן ידני. חזור על הגירוי עם צמצם פתוח או מוגבל לפי הצורך עבור התא המוקלט הבא, או בנוכחות חומרי בדיקה ספציפיים.