כימות של אקטין פונקטה נימה בתאי עצב קליפת המוח של חולדה

קחו את תאי העצב הראשוניים בקליפת המוח של חולדות בצלחת עם תחתית זכוכית מצופה פולימר.

תקן את הנוירונים עם פרפורמלדהיד כדי לשמר מבנים תאיים.

שוטפים את עודפי הפרפורמלדהיד.

הוסף חומר ניקוי לא יוני כדי לחלחל לתאים.

טפל בתאים בכתם פלואורסצנטי ירוק המכוון לחלבון המבני אקטין חוטי, או F-actin.

הסר את הכתם העודף.

יש למרוח חומר חוסם כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפית.

דגירה עם נוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבונים דנדריטיים.

הסר את הנוגדנים הלא קשורים.

הוסף נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור אדומים כדי להיקשר לנוגדנים הראשוניים. שטפו את עודפי הנוגדנים.

מרחו צבע פלואורסצנטי כדי להכתים את הגרעינים. הסר את הצבע הלא כרוך.

הוסף מגיב נגד דהייה כדי למנוע הלבנת אור פלואורופור.

באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, צלם תמונות של הנוירונים.

זהה אזור עשיר ב-F-actin בתוך הדנדריט המסומן.

באמצעות תוכנה, ספרו את הפונקטה או הכתמים של F-actin ועקבו ידנית אחר אורך הדנדריט כדי לחשב את צפיפות ה-F-actin.

תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שתי שטיפות PBS. לאחר מכן, חדרו את התאים עם 0.1% Triton X-100 ב-PBS למשך 5 דקות ותייגו אותם עם כתם ספציפי ל-F-actin בטמפרטורת החדר. לאחר 20 דקות, שטפו את התאים פעמיים עם PBS וחסמו כל צביעה לא ספציפית על פני התא עם סרום עזים רגיל של 10%.

בתום הדגירה, סמנו