צביעה פלואורסצנטית של תאי פסגה עצבית שגודלו על הידרוג'לים בעלי קשיחות משתנה

קח תרביות תאי פסגה עצבית דבקות הגדלות על כיסויים מצופים בהידרוג'לים בעלי קשיחות משתנה. שוטפים את התאים עם מאגר.

הוסף פרפורמלדהיד כדי לתקן את התאים ולשמור על מורפולוגיה תאית.

שטפו את התאים עם חיץ כדי להסיר עודפי פרפורמלדהיד.

לאחר מכן, הוסף חומר ניקוי לא יוני כדי לחלחל את קרומי התאים.

שטפו את התאים עם מאגר כדי להסיר עודפי חומר ניקוי.

לאחר מכן, הציגו פתרון חסימה כדי למנוע כריכה לא ספציפית.

דגרו על התאים עם בדיקת אקטין חוטית בעלת זיקה גבוהה שנקשרת לחוטי אקטין.

שטפו את התאים עם מאגר כדי להסיר בדיקות לא קשורות.

הוסף צבע גרעיני פלואורסצנטי כדי להכתים את הגרעינים, ולאחר מכן שטוף עם חיץ כדי להסיר עודפי צבע.

החל אמצעי הרכבה על הכיסויים ובחן את התאים המוכתמים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תאים הגדלים על הידרוג'לים נוקשים יותר מראים היווצרות מוגברת של חוטי אקטין ומורפולוגיה מפוזרת יותר מאלה הגדלים על הידרוג'לים רכים יותר.

השתמש בפינצטה כדי להעביר את הכיסויים לצלחת חדשה כדי למזער אותות שווא מהתאים הגדלים ישירות על הצלחת. לאחר מכן, יש לתקן את התאים באמצעות 500 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות, לפני שמטפלים בתאים ב-500 מיקרוליטר של 0.1% טריטון X-100 בטמפרטורת החדר.

לאחר 15 דקות יש לחסום את התאים עם 250 מיקרוליטר של סרום חמור 10%. צבעו את התאים עבור F-actin עם פלואידין בדילול של 1 עד 400 ב-250 מיקרוליטר של סרום חמור 10%, ולאחר מכן דגירה עם DAPI למשך 10 דקות.

שטפו את התאים עם PBS למשך שתי דקות לפני הוספת שלוש עד ארבע טיפות של מדיום הרכבה לכל באר. במיקרוסקופ פלואורסצנטי, צלם את התמונות של לפחות שלוש פריימים אקראיים לכל דגימת הידרוג'ל המייצרת ערוצים בודדים וממוזגים.