מניפולציה ניסויית של גודל הגוף על הערכת יחסי דרוג מורפולוגי ב תסיסנית
1 באוקטובר 2011
יחסים דרוג מורפולוגי ללכוד ולתאר בצורה האורגניזם. אנו מציגים שיטה למדידת יחסים דרוג מורפולוגיים במגוון הטבעי של הגוף גדלים חרקים מותמרים מלא. בעזרת מניפולציה פשוטה דיאטה נגדיל את התפלגות הגדלים תכונה, המתיר תיאור מדויק של כיצד הצורה והגודל שיתוף להשתנות.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשתמש במניפולציה של זמינות מזון המותאמת לזמני התפתחות כדי ליצור טווח רחב של גדלי גוף, שניתן להשתמש בהם לאחר מכן להערכת קשר הסקלה (scaling relationship) בין תכונות מורפולוגיות. ראשית, נאספים ביצים מאותה אוכלוסייה של זבובים לאורך שלושה ימים, ובכך נוצרות שלוש קבוצות גיל (cohorts). כאשר קבוצת הזחלים המבוגרת ביותר מתחילה להתרכך (pate), מזילים את הזחלים מכל הקבוצות מהמזון.
תוצאתה של התאמה תזונתית זו היא טווח מוגבר של שונות בגדלי הבועות. לאחר מכן, מצולמות תמונות של האישונים וכנפי המבוגרים של כל הפרטים, כדי לאפשר את הערכת קשר השקילה המורפולוגי בין גודל הגוף לגודל הכנף. לבסוף, מתקבלים תוצאים המראים כיצד גודל הכנף משתנה ביחס למגוון המלא של גדלי הגוף האפשריים, וזאת באמצעות התאמת רגרסיה ליניארית מסוג שני לנתונים.
במחקר זה, אנו משתמשים במניפולציה של זמן הגישה לתזונה במהלך ההתפתחות כדי להגדיל באופן ניסיוני את השונות בגודל הגוף בקרב זבובים בוגרים. דבר זה מאפשר לנו להעריך קשרי סקאלינג מורפולוגיים לאורך מלוא טווח גדלי הגוף. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לסוגיות מרכזיות הנוגעות לביטוי ולאבולוציה של סקאלינג מורפולוגי, כגון זיהוי הבסיס הפרוקסימלי לווריאציה בפרמטרים של קשרי סקאלינג בין קבוצות ביולוגיות.
העבירו אוכלוסיית זבובים לתא הזדווגות ואספו ביצים בכל 24 שעות למשך שלושה ימים. צרו בסופו של דבר שלוש קבוצות גיל בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה. העבירו קבוצות של 50 ביצים מכל קבוצת גיל לבקבוקוני ויאל (vials) המכילים 10 milliliters של מזון זבובים סטנדרטי.
דגרו את המבחנות בטמפרטורה הרצויה להתפתחות הזחלים. כאשר הקוהורט הוותיק ביותר מגיע לשלב הנדודים (wandering stage), יש לבצע את המניפולציה התזונתית על ידי הסרת הזחלים מהמקור למזון. בשלב זה, הזחלים בקוהורט הוותיק ביותר עברו זמן רב את המשקל המינימלי ההכרחי לסגירה (occlusion) ויהיו קרובים לגודל הגוף המקסימלי הטבעי.
זחלים בקוהורט הביניים חרגו ממשקל ההישרדות המינימלי, אך יפיקו בוגרים קטנים יותר מאשר זחלים מהקוהורט המבוגר ביותר. זחלים מהקוהורט הצעיר ביותר קרובים מאוד למשקל ההישרדות המינימלי ולפיכך יפיקו בוגרים קטנים מאוד. להוצאת הזחלים מהמצע המזין.
הוסיפו למבחנות כ-5 מיליליטר של תמיסת סוכרוז 40%, ולאחר מכן ערבבו במשך 15 עד 20 דקות על שולחן ניעור בהגדרה בינונית. לאחר הערבוב, הסירו את הזחלים הצפים מתמיסת הסוכרוז בעזרת מכחול עדין והעבירו אותם לפי קבוצות למבחנות המכילות פקק צמר גפן רטוב לשמירה על הלחות. הדגירו בטמפרטורה הרצויה עד להתרחשות הבובנציה.
סדרו את הpupae על זכוכית מיקרוסקופ כאשר הצד הגחוני (ventral) פונה כלפי מעלה. לאחר שה-pupae ממוקמות, צלמו תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית המחוברת למיקרוסקופ. ודאו כי הגדרות הצילום מכוונות כך שכל pupa תופיע כצללית כהה על רקע לבן.
לאחר הצילום, העבירו כל בובנאי למבחנה מסוג epit בנפח 2 מיליליטר המכילה 1 מיליליטר של מזון לזבובים. העריכו את גודל הבובנאי על פי מספר הפיקסלים של צללית הבובנאי. ניתן להשתמש במדדי גודל אחרים, כגון אורך או רוחב, תחת מיקרוסקופ סטריאוסקומי.
הרדמו קלות את הזבוב באמצעות פחמן דו-חמצני ומקמו בעזרת תופס כנפיים, התקן יניקה השואב את הכנף בין שתי פיסות זכוכית ומחזיק אותה בניצב לגוף הזבוב. לצורך הדמיה, אף שבמחקר זה נעשה שימוש בתופס כנפיים להדמיית כנפיים של זבובים חיים, ניתן להוציא כנפיים ותכונות אחרות ולהדמיות אותן באמצעות כלים רגילים. הדמיקו את הכנף באמצעות מצלמת המיקרוסקופ המחוברת למחשב וציינו את מינו של הזבוב. לאחר שהכנף הודמיה ונשמרה, העריכו את גודל הכנף על ידי שימוש במולטיגון הקמור המינימלי החסום על ידי נקודות סימון שוליים קבועות כמדידות ליניאריות, או לפי ספירת הפיקסלים של צללית הכנף. כאן, הבוביות שהודמיו הראו את קיצוניות התפלגות הגודל עקב מניפולציה תזונתית.
לאחר שהבובה הגיעה למשקל המינימלי ההכרחי לאוקלוזיה. מוצגות גם הצלליות התואמות למדידת גודל האישון. תמונות הכנפיים התואמות לאותם פרטים הנמצאים בקצוות של התהודה בגודל מוצגות כאן לצד הצללית.
משמש להערכת גודל הכנף כחלק מהסקת יחסי הגדילה (scaling relationship). פרמטרים המתארים כיצד גודל הכנף משתנה ביחס לגודל הגוף מאפשרים להשוות את האופן שבו הצורה הכללית משתנה עם הגודל בין קבוצות שונות. כאן מוצגים נתונים עבור פרטים מכל מין אשר ניזונו באופן מלא, או שהורעבו למשך יום אחד או יומיים כזחלים.
למרות שהמרכיבים הבודדים של פרוצדורה זו הם מהירים, באופן כללי היא עלולה להיות עתירת עבודה. בדרך כלל, נדרשות כ-350 שעות עבודה כדי לעבד כ-3,500 זבובים משלב הביצה ועד לבגרות. עם תרגול, ניתן לשפר משמעותית את זמני הטיפול בזבובים, וניתן להשתמש בפרוצדורה זו למדידת תכונות מורפולוגיות אחרות, מה שמאפשר להעריך יחסי קנה מידה מורפולוגיים נוספים.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה למדידת יחסי קנה מידה מורפולוגיים בחרקים בעלי מטמורפוזה מלאה, באמצעות מניפולציה של התזונה להגברת השונות בגודל הגוף. על ידי הערכת האופן שבו גודל הכנף משתנה ביחס לגודל הגוף, המחקר מספק תובנות לגבי הביטוי והאבולוציה של תכונות מורפולוגיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- אנטומולוגיה
רקע
- יחסי סקלה מורפולוגיים הם חיוניים להבנת צורתו של האורגניזם.
- מניפולציה תזונתית יכולה להגביר את השונות בגודל באוכלוסיות של חרקים.
- הערכת יחסי סקלה מסייעת בהבנת הביולוגיה האבולוציונית.
- מחקרים קודמים לא בחנו באופן מלא את השפעת התזונה על השונות בגודל בקרב חרקים.
מטרת המחקר
- להערכת יחסי הגדילה (scaling relationship) בין גודל הגוף לגודל הכנף בזבובים.
- לבדיקת השפעת הגישה התזונתית על תכונות מורפולוגיות.
- לספק שיטה לבדיקת יחסי גדילה בין קבוצות ביולוגיות שונות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- איסוף ביצים מאוכלוסיית זבובים ליצירת קבוצות גיל (cohorts).
- מניפולציה של התזונה על ידי הסרת זחלים מהמצע כדי להשראת שונות בגודל.
- צילום בובות וכנפי זבובים בוגרים להערכת גודל.
- שימוש ברגרסיה לינארית מסוג שני (type two linear regression) לניתוח קשר הסקאלינג (scaling relationship).
תוצאות עיקריות
- מניפולציה תזונתית הגדילה בהצלחה את טווח גדלי הגוף של הזבובים.
- נמצא כי גודל הכנף משתנה באופן פרופורציונלי (scaling) לגודל הגוף באוכלוסייה שנחקרה.
- התוצאות מספקות תובנות לגבי הבסיס הפרוקסימלי של יחסי הגדילה (scaling relationships).
- ניתן להחיל את השיטה על תכונות מורפולוגיות אחרות לצורך מחקרים נוספים.
מסקנות
- מחקר זה מדגים גישה חדשנית לחקר קנה מידה מורפולוגי בחרקים.
- הבנת יחסי קנה מידה יכולה לספק מידע לתחומי הביולוגיה האבולוציונית והאקולוגיה.
- הממצאים מדגישים את חשיבות התזונה בעיצוב תכונות מורפולוגיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ביסוס קשרים מורפולוגיים חזקים של קנה מידה (scaling relationships) מאפשר אפיון פנוטיפי מדויק באורגניזמי מודל, ובכך תומך בתיקוף של מטרות באמצעות ניתוח כמותי של תכונות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי קישור הפרעות גנטיות או סביבתיות לתפליטים מורפולוגיים מדידים. השיטה מספקת מסגרת ניתנת להרחבה להפחתת סיכונים בהשערות שלבים מוקדמים של גילוי במחקר תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות האופן שבו תכונות מורפולוגיות משתנות יחד עם גודל הגוף תחת הפרעה ניסיונית.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה סטנדרטית להפקת נתונים פנוטיפיים תחת תנאים גנטיים או סביבתיים.
- ערך אסטרטגי: תומך בהערכת רמת הביטחון במטרה באמצעות אומדן בר-שחזור של פרמטרי סקלה (scaling) על פני קבוצות ביולוגיות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: יצירת מערכות ביולוגיות מתוקפות עם התפלגויות גודל מוגדרות לצורך סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- ערך תפעולי: הבטחת מוכנות הבדיקה באמצעות פנוטיפיקה מורפולוגית הניתנת לשחזור ותוצרי תמונה כמותיים.
- ערך אסטרטגי: קידום שימוש חוזר בפלטפורמה על ידי ביסוס פרוטוקולים ניתנים להרחבה למדידת תכונות במודלים של חרקים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר מידול של מערכות רלוונטיות למחלה על ידי תיעוד האופן שבו הצורה משתנה יחד עם הגודל בקבוצות שעברו שינוי גנטי.
- ערך תפעולי: תומך בהתאמה של סמנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים באמצעות ניתוח מתאמי של סקאלינג מורפולוגי ותוצאות תפקודיות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות על קידום פרויקטים מותאם סיכונים, על ידי קביעת יחסי סקאלינג בסיסיים למחקרים השוואתיים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי יצירת מערכי נתונים פנוטיפיים הניתנים להרחבה, המנחים את זיהוי המועמדים (leads) והערכה פרה-קלינית באמצעות ניתוח כמותי של תכונות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות למדידה של תגובות מורפולוגיות למניפולציות תזונתיות או גנטיות.
- סריקה: מספק קבוצות מוכנות לבדיקה עם וריאציה מוגברת בגודל הגוף לצורך זיהוי מהימן של השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק פלטי רגרסיה ליניארית מסוג שני המכמתים יחסי קביעת קנה מידה (scaling) של תכונות לצורך השוואה בין קבוצות.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי קביעת פרמטרי קנה מידה בסיסיים לתיקוף מודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת לשימוש חוזר לצורך פנוטיפוינג מורפולוגי במערכות מודל מבוססות חרקים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במערכות יחסים בין תכונה לגודל.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות השפעה על הגודל באמצעות תזונה ובדיקה עיוורת של תמונות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור קבלת החלטות מוקדמתים של go/no-go המבוססת על ספי הפנינוטיפ.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים באמצעות הפחתת סיכונים מורפולוגית מדידה על פני מחלקות מטרה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגידול חרקים, קביעת שלבי התפתחות וטכניקות של דימיון מורפולוגי.
- תלוי בתשתית מיקרוסקופיה המסוגלת להדמיית צלליות בניגודיות גבוהה ומורפומטריה מבוססת פיקסלים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של איסוף קוהורטות, תזמון מניפולציות תזונתיות ופרוטוקולים למדידת תכונות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על מיני חרקים שאינם Drosophila, בעלי תזמון התפתחות שונה.
- מוגבל בשל עצימות העבודה בקוהורטות רחבות היקף, אם כי הדבר מומתן באמצעות זרימות עבודה של טיפול יעיל ועיבוד במקבצים.
