PDMS ייצור המכשיר ושינוי פני השטח
October 1st, 2007
שמי קן קוץ. אני פוסט-דוקטורנט כאן במרכז המשאבים של Bio MAs המסונף לבית החולים הכללי של מסצ'וסטס. פרויקט המחקר העיקרי שלי כולל בידוד נויטרופילים באמצעות מכשיר לכידת זיקה חיסונית עם מבנים מיקרופלואידיים.
אנו משתמשים במכשיר זה בחמישה בתי חולים שונים ברחבי הארץ כדי לבודד RNA לניתוח גנומי במורד הזרם. בעיקרון מה שיש לך זה מאסטר של SU שמונה התנגדות צילום על גבי סיליקון. אנחנו הולכים לשפוך אלסטומר דו-חלקי A-P-D-M-S על גבי המאסטר הזה וה-PDMS הזה ייצור תבנית.
אנו מוציאים את תבנית המאסטר מהמארז שלה ומניחים אותה בצלחת פטרי. המאסטר מאובטח על ידי סרט בתחתית צלחת פטרי. על המשקל אנו שוקלים תערובת של PDMS, מקשה ושרף בסיס.
היחס הוא מקשה חלק אחד לשרף 10 חלקים. בדרך כלל, עבור המכשירים שלנו שנחתכו, אנו שוקלים 20 עד 30 גרם מהשרף ושניים עד שלושה גרם בהתאמה של המקשה. לאחר ששפכנו גם את המקשה וגם את השרף לתוך סירת מי הגבינה הקטנה, אנו משתמשים במזלג פלסטיק רגיל כדי לערבב את השניים יחד.
אתה רוצה לוודא שאתה מערבב במרץ ומקפל את התערובת זו על גבי זו כדי להבטיח שהמקשה יתפזר באופן שווה בתוך השרף. בדרך כלל, אנו עוקבים אחר מידת הערבוב בין השניים. על ידי התבוננות במספר בועות האוויר, אנו מנסים לקבל פיזור שווה של בועות אוויר קטנות ברחבי האלסטומר.
לאחר מכן אנו שופכים את ה-PDMS על גבי מאסטר ה-SU 8 שנמצא בצלחת הפטרי. אנו מניחים את המאסטר עם ה-PDMS מעליו בצנצנת פעמון ואקום, ומפנים את התא כדי לנקות את האוויר שערבבנו לתוכו. בדרך כלל, תהליך הסרת הגז אורך 30 דקות עד שעה.
לאחר הסרת הגז, אנו מוציאים את המכשירים מתא הוואקום ומכניסים אותם לתנור בחום של 65 עד 80 מעלות צלזיוס. זמן הריפוי המינימלי בטמפרטורות אלה הוא שלוש עד שש שעות. במעבדה שלנו, אנו בדרך כלל משאירים את המכשירים בתנור למשך הלילה.
בדרך כלל, אנו משתמשים בסכין פלדה כירורגית מספר 11. אנו מבצעים חתכים ישרים כחצי סנטימטר מקצה מאסטר הסיליקון, ואנחנו חותכים סביב קצה המאסטר ויוצרים דיסק גדול. אנו מקלפים את תבנית ה- PDMS מהמאסטר ומניחים את צד התכונה כלפי מעלה בצלחת פטרי נקייה.
אנו מוציאים את התבנית המשוחררת מצלחת הפטרי ומניחים אותה על משטח חיתוך באמצעות סכין או סכין המותקנת על מסילה ליניארית. אנו חותכים את המכשירים הכלולים בתבנית. לאחר מכן כל מכשיר קטע מוחזר לצלחת פטרי להמשך עיבוד.
בדרך כלל, כדי לממשק את המכשירים שלנו עם נוזלים, ננקב חורים במכשיר ה-PDMS. המכשיר בו אנו משתמשים לניקוב חורים הוא מזרק סטנדרטי של שלוש טחנות. בקצה מזרק שלושת הטחנה נמצאת מחט נירוסטה עם קצה קהה.
בתוך מחט הנירוסטה יש חוט המתאים לקוטר הפנימי של המחט. החוט הזה מחובר לבוכנה של המזרק על ידי משיכת הבוכנה לאחור והחזרת המחט הזו, אתה יכול לנקב חור או לנקב תקע לתוך ה-PDMS. הפוך את מכשיר ה-PDMS והוצא אותו על ידי לחיצה על הבוכנה.
הסוד למכשירי ניקוב הוא לשמור על הבוכנה אנכית ככל האפשר ולא לסובב את מכשיר הניקוב כלל. כשאתה מחורר דרך ה-PDMS, אתה מרים את כל המכשיר, את כל מכשיר ה-PDMS למעלה עם זוג פינצטה, הופך אותו ומוציא את התקע על ידי לחיצה כלפי מטה על הבוכנה. אתה תופס את התקע עם פינצטה ונפטר ממנו.
ואז אתה מחזיר שוב את הבוכנה, הופך את המכשיר בחזרה כלפי מטה ושולף את מכשיר החיתוך. אתה חוזר על זה עד שכל החורים שלך מנוקבים. אז לתהליך ההדבקה, אנו מחברים את מכשירי ה-PDMS שלנו לשקופיות זכוכית.
עבור המכשירים שלנו, אנו הולכים לחבר באופן בלתי הפיך או לחבר את ה-PDMS באופן קוולנטי לשקופיות זכוכית. הדרך לעשות זאת היא על ידי הכנסתם לתוך א, הכנסתם לפלזמה אשר וחשיפתם לפלזמת חמצן תגובתית. אז השלבים לעשות זאת הם לקחת את מכשיר ה-PDMS ולהניח אותו על המגש של הפלזמה אשר.
כאשר תכונות המכשיר פונות כלפי מעלה, אתה יכול להשתמש בכל שקופית מיקרוסקופ זכוכית סטנדרטית. אנו משתמשים בשקופית מיקרוסקופ מוגדלת מעט בגודל אינץ 'וחצי כדי להתאים למכשיר שלנו. אתה יכול להשתמש בהם ישר מהאריזה.
אנחנו מעדיפים להתייחס אליהם בתמיסת פיראנה. זה מנקה את כל המזהמים האורגניים שעלולים להיות על פני מגלשת הזכוכית. לאחר שאתה מניח את המכשיר ואת מגלשת הזכוכית על גבי המגש עבור אשר, אתה מחליק את המגש לתוך אשר הפלזמה וחושף אותו לפלזמת החמצן התגובתית.
לאחר השלמת התוכנית של הפלזמה אשר, אנו פותחים את התא ומוציאים את הצלחת עם המכשירים שלנו לראש הספסל. בעזרת פינצטה אנו מרימים בזהירות את מכשיר ה- PDMS, נזהרים לא לגעת במשטחי ההדבקה באצבעותינו. אנו הופכים את צד ההדבקה על הזכוכית, על מגלשת הזכוכית, ואז אנו מוודאים שאין בועות אוויר בין ה-PDMS למגלשת הזכוכית.
אנו מניחים את מכשיר ה-PDMS המחובר כעת לזכוכית על פלטה חמה בטמפרטורה של 65 עד 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להשיג קשר כימי טוב יותר. אז בחלק הזה, בחלק הזה, אנחנו הולכים לשנות כימית את משטחי ה-PDMS בזכוכית בעקבות הדבקה בחדר הנקי, נשארנו עם משטח PMS שיש לו קבוצות OL תגובתיות על, על פני השטח. אנו זקוקים לכך שהמשטח הריאקטיבי הזה הוא הידרופילי ובסופו של דבר יתפזר לחלק הארי של ה-PMS.
אז כימיה של פני השטח מושגת בצורה הטובה ביותר מיד לאחר טיפול בפלזמה, אנו הולכים להשתמש בתמיסה של 5% של כובע me. זה שלוש לי קפטו, פרופיל, טרימת' אוקסי. זה פתרון של 5% בנפח, ובעצם מה שאנחנו עושים זה להזריק אותו לכניסה ולוודא שאתה ממלא את המכשיר לחלוטין ללא בועות אוויר.
אם קיימות בועות אוויר, אתה דוחף אותן החוצה בעזרת פינצטה. זה, ברגע שהזרקת את הסלאן, אתה נותן לו לשבת במשך 15 עד 30 דקות. בטמפרטורת החדר, אתה בדרך כלל, אנו מזריקים נפח שני של הסלאן 10 דקות לתוך התגובה.
אז לאחר שהצילין הגיב במשך כחצי שעה, ניקח א, נשטוף את כל המכשירים בשלושה עד ארבעה נפחי מכשיר של אתנול טהור. העודף שאנו פולטים פשוט ינגב עם מגבון כימי לאחר שטיפת המכשירים, אנו מרימים את המכשירים ומניחים אותם על פלטה חמה, המכוונת למאה מעלות צלזיוס, ובעצם נאפשר לאתנול שנמצא שם להתאדות. זה עוזר לכרוע ברך על משטח ההשתקה.
לאחר ייבוש המכשיר, ניתן לאחסן אותו בחומר מיובש במשך חודשים או שהוא יכול, אתה יכול לקחת את המכשיר ולהמשיך מיד לשלב הבא. לאחר שהמכשירים נרפאו, הם נרפאו עם ציפוי סינוס כעת הן על הזכוכית והן על משטח ה-PDMS. הסינוס הוא סינוס קאפטו עם קבוצת התיול, אשר יגיב עם הצלב הדו-פונקציונלי ההטרו שלנו, שהוא GMBS.
הוא מדולל באתנול טהור. הוא מגיב למים, לכן עליכם להיזהר לא לחשוף אותו לתנאים מימיים. אנחנו מזריקים אותו למכשירים ואנחנו מסירים את כל בועות האוויר עם פינצטה כפי שאני עושה כאן כדי לוודא שכל המשטחים מחוברים למולקולה הזו.
אנחנו מכסים אותו ונותנים לו להגיב במשך חצי שעה. לאחר שה-GMBS הגיב במשך חצי שעה, אנו הולכים לשטוף את המכשירים במים מיוננים כדי להסיר עקבות של אתנול שנמצאים במכשיר. ואז אנחנו הולכים לזרום דרך נוי טראווין, שהוא חלבון קושר ביוטין.
לאחר מכן מדולל הנוי טראוואין מראש לריכוז של 10 מיקרוגרם למיל. אם, אם מוזרק בטעות אוויר כלשהו למכשיר, יהיה צורך לשטוף את המכשיר מחדש באתנול כדי להסיר ביעילות את כל האוויר שאתנול רטוב, המכשיר עולה טוב יותר ומאפשר לך להסיר בועות אוויר שהוכנסו בטעות למכשיר. וברגע שהמכשירים נשטפו במים המיוננים, בדרך כלל נמלא את המכשיר בשניים עד ארבעה נפחי מכשיר של תמיסת הראיה הנייטרלית המדוללת T travain.
ה-Nutt travain יגיב עם ה-GMBS, המשותק לפני השטח באמצעות כל אמצעי ראשוני ב-Nutt travain. תהליך זה יכול להתרחש בטמפרטורת החדר למשך שעה. בדרך כלל, אני מניח את המכשירים בחדר הקירור בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
אבל לפני שנוסיף את הנוגדן, אנחנו רוצים לשטוף החוצה כל עדן, שאינו קשור בתמיסה. ואנחנו עושים זאת על ידי זרימה דרך תמיסה של 1% BSA מדוללת ב-PBS. מכיוון שהשבבים האלה ישמשו לניתוח גנומי במורד הזרם, כל הפתרונות שאנו משתמשים בהם הם נטולי RNA.
בדרך כלל, מה שאנחנו עושים זה לשטוף את המכשיר עם ארבעה עד חמישה נפחים של תמיסת BSA של 1%. ואז לאחר מכן, אנו מוסיפים את הנוגדן שלנו. הנוגדן לניסוי זה הוא CD 66 B ונוגדנים ספציפיים לגרנולוציטים בדם מלא.
אנחנו משתמשים בריכוז של בין 10 ל-25 מיקרוגרם למיל, ומזריקים את הנוגדן. נזריק 200 מיקרוליטר נוגדנים לכל מכשיר. נבצע שתי הזרקות של מאה מיקרוליטר, אחת לכל יציאה של המכשיר.
בדרך כלל, נזריק מאה מיקרוליטר ליציאה אחת, נחכה 30 דקות ונזריק עוד מאה מיקרוליטר ליציאה הנגדית.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בבידוד נויטרופילים באמצעות מכשיר לכידת זיקה חיסונית המשולב עם מבנים מיקרופלואידים. המכשיר משמש בבתי חולים מרובים לבידוד RNA וניתוח גנומי.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- גנומיקה
רקע
- נויטרופילים ממלאים תפקיד קריטי בתגובה החיסונית.
- בידוד נויטרופילים חיוני לחקר תפקודם והתנהגותם.
- מכשירים מיקרופלואידיים מציעים שליטה מדויקת על דינמיקת הנוזלים.
- ניתוח RNA חיוני להבנת ביטוי הגנים בנויטרופילים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה אמינה לבידוד נויטרופילים.
- להקל על ניתוח גנומי עוקב של תאים מבודדים.
- לשפר את ההבנה של ביולוגיית הנויטרופילים במסגרות קליניות שונות.
שיטות ששימשו
- שימוש במכשיר לכידת זיקה חיסונית.
- יישום מבנים מיקרופלואידיים לבידוד תאים.
- שיתוף פעולה עם בתי חולים מרובים לאיסוף דגימות.
- מיצוי RNA לניתוח גנומי.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של נויטרופילים באמצעות המכשיר שפותח.
- השגת RNA באיכות גבוהה לניתוח נוסף.
- הוכחת יעילות המכשיר במסגרות קליניות שונות.
- פוטנציאל ליישומים רחבים יותר במחקר אימונולוגי.
מסקנות
- מכשיר לכידת הזיקה החיסונית יעיל לבידוד נויטרופילים.
- הטכנולוגיה המיקרופלואידית משפרת את יעילות לכידת התאים.
- שיטה זו יכולה לקדם מחקר בתפקוד ובגנומיקה של הנויטרופילים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
PDMS device fabrication and surface modification underpin the reproducible isolation of neutrophils for downstream genomic analysis across multiple clinical sites. This workflow enables standardized sample preparation, supporting high-confidence data generation for translational research and biomarker discovery. Reliable device performance at scale is critical for portfolio-wide assay development and cross-site comparability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust immunoaffinity capture of target cell populations for mechanistic studies.
- Supports functional validation of cell-surface markers in disease-relevant systems.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of immune cell biology.
Screening & Assay Development
- Provides standardized microfluidic platforms for reproducible sample processing.
- Ensures quantitative and consistent RNA isolation for downstream assays.
- Enables scalable preparation of validated biological inputs for screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sample preparation with requirements for genomic biomarker studies.
- Maintains continuity from clinical sample acquisition to preclinical model validation.
- Reduces variability in multi-site translational research initiatives.
Pipeline & Workflow Integration
This PDMS device workflow integrates from early discovery through translational research, supporting lead identification and biomarker validation when coupled with genomic analysis.
- Discovery Biology: Enables isolation and analysis of specific immune cell subsets for pathway elucidation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs for assay development.
- Analytics: Supports statistical comparison of cell capture efficiency and RNA yield across conditions.
- Translational Research: Provides harmonized sample processing for multi-center studies.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse cell isolation needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune cell profiling and target validation.
- Operational Value: Standardizes device fabrication and surface chemistry for reproducibility.
- Strategic Value: Enables scalable, cross-site implementation for large portfolio studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of immune-related discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication and surface chemistry protocols.
- Needs access to plasma asher, cleanroom, and analytical infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for multi-site reproducibility.
- Adaptable to different antibody targets and cell types with protocol optimization.
- Surface reactivity and device storage conditions must be tightly controlled.
