PDMS ייצור המכשיר ושינוי פני השטח

שמי קן קוץ. אני פוסט-דוקטור כאן במרכז למשאבי ביו-MAS המסונף לבית החולים הכללי של מסצ'וסטס (Massachusetts General Hospital). פרויקט המחקר המרכזי שלי עוסק בבידוד נויטרופילים באמצעות התקן ללכידה באפניות אימוניות עם מבנים מיקרופלואידיים.

אנו משתמשים במכשיר זה בחמישה בתי חולים שונים ברחבי המדינה כדי לבודד RNA עבור אנליזה גנומית בהמשך. ביסודו של הדבר, מה שיש לנו הוא שכבת SU 8 photo resist על גבי סיליקון. אנו עומדים לשפוך אלסטומר דו-רכיבי PDMS על גבי התבנית הזו, וה-PDMS יעצב תבנית.

אנו מוציאים את תבנית המקור מהמארז שלה ומניחים אותה בתוך צלחת פטרי. תבנית המקור מקובעת בעזרת סרט דביק לתחתית צלחת הפטרי. במאזניים אנו שוקלים תערובת של PDMS, חומר מקשה ושרף בסיס.

היחס הוא חלק אחד של מקשה ל-10 חלקים של שרף. בדרך כלל, עבור המכשירים שלנו שנגזרו, שוקלים 20 עד 30 גרם של השרף ושני עד שלושה גרם של המקשה בהתאמה. לאחר מזיגת המקשה והשרף לכלי שקילה קטן, משתמשים במזלג פלסטיק סטנדרטי כדי לערבב את השניים יחד.

יש לוודא שערבוב התערובת נעשה בעוצמה ובקיפולים זה על זה, כדי להבטיח שהמקשה יתפזר באופן אחיד בתוך השרף. בדרך כלל, אנו עוקבים אחר מידת הערבוב של השניים. על ידי בחינת מספר בועות האוויר, אנו שואפים להשיג פיזור אחיד של בועות אוויר קטנות בכל רחבי האלסטומר.

לאחר מכן, אנו שופכים את ה-PDMS על גבי תבנית ה-SU eight הנמצאת בצלחת פטרי. אנו מניחים את התבנית עם ה-PDMS שמעליה בתוך פעמון ואקום, ומרוקנים את הלשכה כדי להוציא את בועות האוויר שהערבבנו פנימה. בדרך כלל, תהליך הוואקום נמשך בין 30 דקות לשעה.

לאחר ניתון הגזים, אנו מוציאים את המכשירים מתא הוואקום ומניחים אותם בתנור בטמפרטורה של 65 עד 80 °C. זמן האשייה המינימלי בטמפרטורות אלו הוא שלוש עד שש שעות. במעבדה שלנו, אנו בדרך כלל משאירים את המכשירים בתנור למשך הלילה.

בדרך כלל, אנו משתמשים בסכין כירורגית מפלדה מספר 11. אנו מבצעים חתכים ישרים לעומק של כחצי סנטימטר מקצה התבנית המאסטר מסיליקון, וחותכים מסביב לקצה המאסטר כדי ליצור דיסק גדול. אנו מקלפים את תבנית ה-PDMS מהמאסטר ומניחים אותה, כאשר הצד עם התבליטים פונה כלפי מעלה, בתוך צלחת פטרי נקייה.

אנו מוציאים את התבנית המשוחררת מתוך צלחת הפטרי ומניחים אותה על משטח חיתוך באמצעות סכין או סכין המורכבת על מסילה ליניארית. אנו חותכים לפרוסות את ההתקנים הנמצאים על התבנית. כל התקן חתוך מוחזר לאחר מכן לצלחת הפטרי לצורך עיבוד נוסף.

בדרך כלל, כדי לחבר את המכשירים שלנו לנוזלים, ננקב חורים במכשיר ה-PDMS. המכשיר שבו אנו משתמשים לניקוב החורים הוא מזרק סטנדרטי של 3 mm. בקצה המזרק של ה-3 mm נמצא מחט מפלדה אל-חלודה בעלת קצה קהה.

בתוך מחט הפלדה ניצב תיל המתאים לקוטר הפנימי של המחט. תיל זה מחובר לבוכנה של המזרק. על ידי משיכת הבוכנה לאחור ונסיגת המחט, ניתן להכין חור או להוציא פלאג מה-PDMS. הפוך את התקן ה-PDMS והוצא אותו על ידי לחיצה על הבוכנה.

הסוד בעבודה עם מכשירי ניקוב הוא לשמור על הבוכנה אנכית ככל האפשר ולא לסובב את מכשיר הניקוב כלל. כאשר מנקבים דרך ה-PDMS, מרימים את כל המכשיר, את כל התקן ה-PDMS, באמצעות פינצטה, הופכים אותו ומוציאים את הפקק על ידי לחיצה מטה על הבוכנה. תופסים את הפקק בעזרת פינצטה ומשליכים אותו.

לאחר מכן, החזירו את הבוכנה למעלה, הפכו את המכשיר חזרה למטה והוציאו את מכשיר החיתוך. חזרו על פעולה זו עד שכל החורים יהיו מחוררים. עבור תהליך ההדבקה, אנו מדביקים את מכשירי ה-PDMS לשקופיות זכוכית.

עבור המכשירים שלנו, אנו נבצע הדבקה בלתי הפיכה או קישור קוולנטי של ה-PDMS למשטחי זכוכית. פעולה זו תתבצע על ידי הנחתם בתוך שורף פלזמה (plasma Asher) וחשיפתם לפלזמה חמצנית ריאקטיבית. השלבים לביצוע פעולה זו הם לקיחת מכשיר ה-PDMS והנחתו על מגש שורף הפלזמה.

כאשר מאפייני המכשיר פונים כלפי מעלה, ניתן להשתמש בכל זכוכית כיסוי סטנדרטית למיקרוסקופ. אנו משתמשים בזכוכית כיסוי גדולה מעט, במידה של שפה וחצי אינץ', כדי להתאימה למכשיר שלנו. ניתן להשתמש בהן ישירות מהאריזה.

אנו מעדיפים לטפל בהם בתמיסת פיראנה. פעולה זו מנקה זיהומים אורגניים שעלולים להימצא על פני השטח של פלטת הזכוכית. לאחר הנחת המכשיר ופלטת הזכוכית על מגש ה-plasma Asher, החליקו את המגש לתוך ה-plasma Asher וחשפו אותם לפלסמת חמסן ריאקטיבית.

עם סיום תוכנית ה-plasma Asher, אנו פותחים את התא ומוציאים את הפלטה עם המכשירים שלנו לסביבת העבודה. באמצעות פינצטה, אנו מרים בזהירות את מכשיר ה-PDMS, תוך הקפדה לא לגעת במשטחי ההדבקה עם האצבעות. אנו הופכים את צד ההדבקה כלפי מטה על גבי זכוכית, על גבי תגית זכוכית (glass slide), ולאחר מכן אנו מוודאים שאין בועות אוויר בין ה-PDMS לבין תגית הזכוכית.

אנו מניחים את התקן ה-PDMS, המחובר כעת לזכוכית, על פלטה מחוממת בטמפרטורה של 65 עד 75 °C למשך 10 דקות כדי להשיג קשר כימי טוב יותר. לכן, בחלק זה אנו הולכים לשנות כימית את פני השטח של ה-PDMS והזכוכית. לאחר ההדבקה בחדר נקי, נותרנו עם פני שטח של PDMS שבהם קבוצות OH ריאקטיביות על פני השטח. אנו זקוקים למשטח ריאקטיבי זה, שהוא הידרופילי ובסופו של דבר יפעפע אל תוך גוף ה-PDMS.

כיוון שכימיה של פני השטח משיגה את התוצאות המיטביות מיד לאחר טיפול בפלזמה, נשתמש בתמיסה של 5% של 3-mercaptopropyltrimethoxysilane. זוהי תמיסה של 5% לפי נפח, ובשורה בסיסית אנו מזריקים אותה לכניסה ומוודאים שההתקן מלא לחלוטין ללא בועות אוויר.

אם קיימות בועות אוויר, יש להוציאן באמצעות פינצטה. לאחר הזרקת ה-slan, יש להמתין 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. בדרך כלל, מזריקים נפח שני של slan לאחר 10 דקות מהתחלת התגובה.

לאחר שהסילן הגיב במשך כחצי שעה, נשטוף את כל המכשירים בשלוש עד ארבעה נפחי מכשיר של אתנול טהור. את העודפים שנשפוך ננקה באמצעות מגבון כימי. לאחר שטיפת המכשירים, נרים אותם ונניח אותם על פלטה מחוממת, המכוונת ל-100 °C, ונאפשר לאתנול שנשאר בהם להתאדות. פעולה זו מסייעת בייבוש של פני השטח של הסילן.

לאחר שהמכשיר התייבש, ניתן לאחסנו במייבש חומרים (desiccator) למשך חודשים, או שניתן לקחת את המכשיר ולהמשיך מיד לשלב הבא. לאחר שהמכשירים התייבשו, הם מצופים כעת בשכבת sine הן על פני השטח של הזכוכית והן על פני השטח של ה-PDMS. ה-sine הוא capto sine עם קבוצת thiol, שתגיב עם ה-crosslinker ההטרו-ביפונקציונלי שלנו, שהוא GMBS.

הוא מדולל באתנול טהור. הוא מגיב עם מים, לכן יש להיזהר שלא לחשוף אותו לתנאים מימיים. אנו מזריקים אותו למכשירים ומסירים בועות אוויר באמצעות פינצטה, כפי שאני עושה כאן, כדי להבטיח שכל המשטחים יהיו מצופים במולקולה זו.

אנו מכסים את הכלי ומניחים לו להגיב למשך חצי שעה. לאחר שה-GMBS הגיב למשך חצי שעה, נשטוף את המכשירים במים דה-יוניים כדי להסיר עקבות של אתנול שנשארו במכשיר. לאחר מכן, נזרימ אותו עם NeutrAvidin, שהוא חלבון קושר ביוטין.

לאחר מכן מדללים מראש את ה-neutravain לריכוז של 10 micrograms per mil. אם הוזרק בטעות אוויר אל תוך המכשיר, יהיה צורך לשטוף אותו שוב עם ethanol כדי להסיר ביעילות את כל האוויר; ethanol מרטיב טוב יותר את פני השטח של המכשיר ומאפשר להסיר בועות אוויר שהוכנסו למכשיר בטעות. לאחר ששטפנו את המכשירים עם מיון דה-יוניזציה (ionized water), נמלא בדרך כלל את המכשיר בשני עד ארבעה נפחי מכשיר של תמיסת neutravain מדוללת.

ה-Nutt travain יגיב עם ה-GMBS, המקובע לפני השטח באמצעות כל אמצעי ראשוני על ה-Nutt travain. תהליך זה יכול להתרחש בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. בדרך כלל, אני מניח את המכשירים בחדר קירור בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה.

עם זאת, לפני שנוסיף את הנוגדן, ברצוננו לשטוף כל ADEן שאינו קשור בתמיסה. אנו עושים זאת על ידי זרימה של תמיסת BSA בריכוז 1% המדוללת ב-PBS. מכיוון ששבבים אלה ישמשו לניתוח גנומי בהמשך, כל התמיסות שבהן אנו משתמשים הן נקיות מ-RNA.

בדרך כלל, נבצע שטיפה של המכשיר עם ארבעה עד חמישה נפחים של תמיסת 1%BSA. לאחר מכן, נוסיף את הנוגדן שלנו. הנוגדן עבור ניסוי זה הוא CD 66 B, שהם נוגדנים ספציפיים לגרנולוציטים בדם מלא.

אנו משתמשים בריכוז שנע בין 10 ל-25 מיקרוגרם למיליליטר, ונזריק את הנוגדן. נזריק 200 µL של נוגדן לכל התקן. נבצע שתי הזרקות של 100 µL, אחת לכל פתח במכשיר.

בדרך כלל, נזריק מאה מיקרוליטר לתוך פתח אחד, נמתין 30 דקות ונזריק מאה מיקרוליטר נוספים לתוך הפתח הנגדי.