Name: פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: למדו שימוש בפוטוליזה של תרכובות כלואה לחקירת תפיסה ריחנית בנוירונים סנסוריים של עכברים באמצעות רישומי patch-clamp. שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת במסלולי מעבר אותות עצביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+compounds%3A+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).</li>
<li>Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide-gated+ion+channels+in+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction.</a> FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).</li>
<li>Bozza, T. C., Kauer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+properties+of+convergent+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons.</a> J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).</li>
<li>Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+and+Ultrafast+Phototriggers+for+cAMP+and+cGMP+by+Using+Long-Wavelength+UV%2FVis-Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).</li>
<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).</li>
<li>Rapp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+lamp-based+irradiation+of+caged+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Flash lamp-based irradiation of caged compounds.</a> Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).</li>
<li>Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGurney%2C+AM+%22Microelectrodes%3A+Theory+and+Applications%22">Microelectrodes: Theory and Applications</a>. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).</li>
<li>Lagostena, L., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+and+photolysis+of+caged+compounds+in+olfactory+sensory+neurons+isolated+from+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse.</a> Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).</li>
<li>Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+adaptation+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+does+not+require+the+activity+of+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase.</a> J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).</li>
<li>Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+development+of+cyclic+nucleotide-gated+and+Ca2%2B+-activated+Cl-+currents+in+isolated+mouse+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).</li>
<li>Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+jumps+reveal+dynamic+ion+selectivity+of+calcium-activated+chloride+currents+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+and+TMEM16B-transfected+HEK+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells.</a> J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).</li>
<li>Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+Functional+Analysis+of+Ion+Channels+Heterologously+Expressed+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).</li>
<li>Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Responses+of+Mouse+Olfactory+Sensory+Neurons+Using+the+Air-phase+Electroolfactogram+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording.</a> J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).</li>
<li>Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+using+a+light+emitting+diode%3A+an+efficient%2C+compact%2C+and+affordable+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution.</a> Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Photolysis פלאש של תרכובות בכלוב בשילוב עם תיקון-clamp ההקלטות היא טכניקה יעילה כדי להשיג קופץ מהירים מקומיים ריכוז מולקולות פעילות פיזיולוגית הן בתוך והן מחוץ לתאים. מספר סוגים של compounds1 בכלוב היה מסונתז, ואת הטכניקה הזאת ניתן ליישם סוגים שונים של תאים, כולל תאים בתרבית להביע תעלות יונים כי יכול להיות מופעל או מווסתת על ידי photolysis של כמה תרכובות בכלוב זמינים 11. Photolysis של תרכובות בכלוב דור...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> מתאם מודול מנורת פלאש כדי מיקרוסקופ </td><td> ראפ אופטו </td><td> FlashCube 70 </td><td></td></tr><tr><td> שולחן האוויר </td><td> TMC </td><td> מיקרו גרם 63-534 </td><td></td></tr><tr><td> Digitizer </td><td> אקסון מכשירים </td><td> Digidata 1322A </td><td></td></tr><tr><td> נתונים רכישת תוכנה </td><td> אקסון מכשירים </td><td> pClamp 8 </td><td></td></tr><tr><td> ניתוח נתונים תוכנה </td><td> WaveMetrics </td><td> איגור </td><td></td></tr><tr><td> מראה מתאם עבור מודול </td><td> ראפ אופטו </td><td> M70/100 </td><td></td></tr><tr><td> מחזיק אלקטרודה </td><td> אקסון מכשירים </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> כלוב פאראדיי של </td><td> מותאמים ללקוח </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סנן קוביה </td><td> אולימפוס </td><td> U-MWU </td><td> פילטר עירור הוסר </td></tr><tr><td> מנורת פלאש </td><td> ראפ אופטו </td><td> JML-C2 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים דומון # 55 </td><td> העולם מכשירים Precision </td><td> 14099 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית נימי </td><td> העולם מכשירים Precision </td><td> PG10165-4 </td><td></td></tr><tr><td> בתחתית צלחת זכוכית </td><td> העולם מכשירים Precision </td><td> FD35-100 </td><td></td></tr><tr><td> הפנס </td><td> אולימפוס </td><td> הדגש 3100 </td><td></td></tr><tr><td> הפוך מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> IX70 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulators </td><td> Luigs &amp; נוימן </td><td> אני SM </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette פולר </td><td> Narishige </td><td> PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> צג </td><td> HesaVision </td><td> MTB-01 </td><td></td></tr><tr><td> הצפיפות מסננים ניטרלי </td><td> אומגה אופטי </td><td> משתנה </td><td></td></tr><tr><td> המטרה 100x </td><td> Zeiss </td><td> Fluar 440285 </td><td> או צייס או Olympus </td></tr><tr><td> המטרה 100x </td><td> אולימפוס </td><td> UPLFLN 100XOI2 </td><td> או צייס או אולימפוס </td></tr><tr><td> UV מסנן אופטי shortpass </td><td> ראפ אופטו </td><td> SP400 </td><td></td></tr><tr><td> Patch-clamp מגבר </td><td> אקסון מכשירים </td><td> Axopatch 200B </td><td></td></tr><tr><td> תמונה העצרת דיודה </td><td> ראפ אופטו </td><td> מחשב כף יד </td><td></td></tr><tr><td> מדריך קוורץ אור </td><td> ראפ אופטו </td><td> משתנה </td><td> אנו משתמשים בקוטר 600 מיקרומטר </td></tr><tr><td> חוט כסף </td><td> העולם מכשירים Precision </td><td> AGT1025 </td><td></td></tr><tr><td> כסף הקרקע גלולה </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-1309 </td><td></td></tr><tr><td> מנורת קסנון קשת </td><td> ראפ אופטו </td><td> XBL-JML </td><td></td></tr></tbody></table> <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> BCMCM-בכלוב cAMP </td><td> BioLog </td><td> B016 </td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין (BSA) </td><td> סיגמא </td><td> A8806 </td></tr><tr><td> CaCl2 תקן 0.1 פתרון M </td><td> Fluka </td><td> 21059 </td></tr><tr><td> Ca Caged: DMNP-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> D6814 </td></tr><tr><td> ציסטאין </td><td> סיגמא </td><td> C9768 </td></tr><tr><td> Concanavalin סוג V (ConA) </td><td> סיגמא </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> סיגמא </td><td> C4036 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> סיגמא </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> אני DNAse </td><td> סיגמא </td><td> D4527 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> סיגמא </td><td> E4378 </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G5767 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמא </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> סיגמא </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> סיגמא </td><td> P1767 </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> סיגמא </td><td> L0649 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> Fluka </td><td> 63020 </td></tr><tr><td> Papain </td><td> סיגמא </td><td> P3125 </td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P1274 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> סיגמא </td><td> S9888 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> סיגמא </td><td> S5881 </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> סיגמא </td><td> P2256 </td></tr></tbody></table>

פלאש photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis של תרכובות בכלוב מאפשר ייצור של עליות מהירה מקומי בריכוז של חומרים פעילים מבחינה פיזיולוגית שונים 1. תרכובות בכלובים הם מולקולות עשה פעילות פיזיולוגית של כלוב כימי ניתן לשבור על ידי הבזק של אור אולטרה סגול. כאן, אנו מראים כיצד ניתן להשיג תיקון-clamp הקלטות בשילוב עם photolysis של תרכובות בכלוב לחקר התמרה חוש הריח של העכבר ניתק עצב ההרחה חושית. תהליך התמרה חוש הריח (איור 1) מתקיים cilia של נוירונים חושי הריח, שם odorant קשירה לקולטנים מובילה כדי להגדיל את המחנה שנפתח מחזורית נוקלאוטיד-מגודרת (CNG) בערוצים 2. כניסה Ca בערוצים מפעילה CNG Ca המופעל ערוצי Cl. אנחנו מראים איך לנתק את הנוירונים מפני אפיתל ההרחה העכבר 3 ואיך להפעיל ערוצי CNG או CA-מופעל על ידי תעלות Cl photolysis המחנה בכלוב 4 או בכלוב Ca 5 &lt;/ Sup&gt;. אנו משתמשים מנורת פלאש 6,7 ליישם גלי אולטרה לאזור ריסי אל uncage cAMP או Ca תוך תיקון-clamp הקלטות ננקטים כדי למדוד את הזרם בתצורה מתח מהדק כל תא 8-11.

Photolysis של תרכובות בכלוב מאפשר ייצור של עליות מהירה מקומי בריכוז של חומרים פעילים מבחינה פיזיולוגית שונים. כאן, אנו מראים כיצד ניתן להשיג תיקון-clamp הקלטות בשילוב עם photolysis המחנה בכלוב או בכלוב Ca לחקר התמרה חוש הריח של העכבר ניתק עצב ההרחה חושית.

פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

פוטוליזה של תרכובות כלואות (caged compounds) מאפשרת יצירת עליות מהירות וממוקמות בריכוזם של תרכובות שונות הפעילות פיזיולוגית1. ...

חוש הריח שלנו מאפשר לנו לזהות ולהכיר כימיקלים נדיפים בסביבה החיצונית. אלו נקשרים לקולטנים בסינפסים של נוירונים תחושתיים אולפקטוריים ומפעילים קסקדת התמרה שמובילה לפתיחה של תעלות המופעלות על ידי נוקלאוטיד ציקלי, ולאחריהן תעלות כלוריד המופעלות על ידי סידן. המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד להפעיל תעלות אלו באופן ישיר באמצעות פוטו-שחרור של תרכובות כלוב; תרכובות כלוב הן מולקולות שהפכו ללא פעילות פיזיולוגית באמצעות כלוב כימי.מבזק של אור על-סגול שובר כלוב ומשחרר תרכובות פעילות פיזיולוגית כלואות. Cycl, mp, או סידן כלוא (cage calcium) נכללים בתמיסה התוך-תאית, ממלאים פיפטת patch, ומפיצים אל תוך ה-C של נוירונים תחושתיים ריחוניים. מבזק אולטרה מופעל על אזור ה-Cary כדי לשחרר cycling, MP או סידן, בעוד שנע conducting של רישומי patch clamp למדידת הזרם ובתצורת voltage clamp של תא שלם.שלום. היום נדגים לכם פרוצדורה להקלטות patch clamp בשילוב עם מדידות FE של תרכובות כלוב. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור תעלות המופעלות על ידי CMP ותעלות כולין המופעלות על ידי סידן בנוירונים של חיישנים ריחוניים. אז בואו נתחיל.מערכת רישום ה-patch clamp המשמשת כאן כוללת מיקרוסקופ הפוך, מערכת פרפוזיה, מיקרו-מניפולטור, אלקטרודת רישום ואלקטרודת ייחוס המחוברת לשלב הראש (head stage) של מגבר ה-patch clamp, כאשר כולם מורכבים על שולחן נגד רעידות בתוך כלוב פאראדיי. מגבר ה-patch clamp מחובר לממיר דיגיטלי במחשב עם תוכנה לרכישת נתונים. כדי להפיק הבזק בעוצמה גבוהה של אור על-סגול, אנו משתמשים במנורת הבזק excelon.ניתן להפעיל את הבזק האור באופן ידני או באמצעות המחשב, תוך שימוש באותה תוכנה השולטת ברכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים. אורכי הגל המיטביים לניסויי פוטו נבחרים על ידי הכנסת מסנן UV לחריץ הפלט או למנורת הבזק. ניתן לשנות את עוצמת הבזק האור על ידי שינוי המתח או הקיבול של מנורת הבזק.שליטה מדויקת יותר בעוצמת האור מושגת על ידי הצבת מסנני צפיפות ניטרלית (neutral density filters) בחריץ פלט שני של מנורת הפלאש. הבזק האור מופנה אל הנוירון המגודל על מבחנות בעלות תחתית זכוכית באמצעות מוליך אור אופטי מסיב קוורץ. מוליך האור מחובר למתאם הפלואורסצנציה האפי (epi fluorescence) של המיקרוסקופ ההפוך.באמצעות מתאם, קוביית פילטר שונו ללא פילטר עירור מכוונת קרן UV אל הנוירון באמצעות מראת הסטה. האור ממוקד דרך עדשת שימור שמן 100x. השטח המכוסה על ידי הרקמה מוצג באמצעות הכנסת מוליך אור למאיר.התמונה נצפית על גבי מסך באמצעות מצלמת CCD המחוברת למיקרוסקופ. סימון השטח מבוצע על המסך כדי למקם את אזור הבשר הפרופציונלי (UV flesh area) עבור הניסויים לפני הניתוח; הכינו שלוש צלחות עם תחתית זכוכית מצופות conna a ו-poly. כהכנה לניתוח, מלאו שתי צלחות פטרי בנפח 50 מילימטרים מצופות סוכר בתמיסת רינגר.הנח אותם על קרח. קירר גם אותם. יש לערבב 0.5 milliliter של תמיסת ה-stop mix עם המזרק המכיל כ-10 milliliters של תמיסת ringer.התחל עם העכבר שהוקרב. הסר את העור המכסה את הגולגולת, חתוך לאורך קווי הלסת והנח את הראש בתוך צלחת פטרי מצופה כסף. הנח את הצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי ובצע חיתוך סגיטלי באמצעות סקאלפל.בצעו נתיחה של הראש לאורך קו האמצע. הפכו מחצית מהראש כך שהצד המדיאלי פונה כלפי מעלה. הסירו בזהירות את המחיצה כדי לחשוף את ה-terminates.כאן אנו מציגים תמונה מוגדלת של הסרת המחיצה (septum) באמצעות פינצטה מספר 3 וסקלפל. הסר בזהירות את הקצוות המצופים באפיתל השומן. העבר לכלי פטרי מצופה כסף אחר באמצעות פינצטה עדינה מאוד (super fine) מספר 55 וסקלפל.הפרידו חתיכות של אפיתל רירית האף מהרקמות התומכות שמתחתיהן. העבירו את חתיכות האפיתל הרירית למבחנה המכילה 1 mL של תמיסת רינגר נטולת divalent cations. לאחר מכן, הוסיפו פפאין.השתמשו במספרי מיקרו כדי להוציא את התאים האפיתליאליים, דגרו בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות, ועברו שוב בעדינות על הדגימה בעזרת מספרי מיקרו. המתינו חמש דקות נוספות, והעבירו באמצעות פיפטת פסטור מלוטשת בלהבה בעלת פיה רחבה למבחנה המכילה את תמיסת העצירה; סבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות והסִירו את supernatant. הוסיפו כ-1 mL של תמיסת Ringer מסוננת, וערבבו בעדינות באמצעות פיפטת פסטור מלוטשת בלהבה בעלת פיה בקוטר של כ-1 mm.העבירו את התמיסה המכילה את התאים למרכז של שלוש צלחות פטרי מזכוכית. אפשרו לתאים לשקוע למשך כשעה אחת בטמפרטורה של 4°C. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת רינגר.עבדו בתאורה עמומה כדי למנוע פירוק של תרכובות הכלוב עקב חשיפה לאור הסביבה. מרחו טיפה של שמן טבילה על העדשה של העדשת האובייקטיב 100 x. הניחו צלחת אחת בעלת תחתית זכוכית המכילה נוירונים חושיים מופרדים מהאיבר המחוש על במה של מיקרוסקופ ההיפוך perfu.עם תמיסת רינגר. הגנו בנייר אלומיניום מפני אור את המזרק המכיל את התמיסה התוך-תאית עם תרכובות כלוב ושמרו אותו בקירור. חפשו נוירון חושי ריח מבודד עם סיליים (cilia) שלמים.הזז את במה המיקרוסקופ כדי למקם את אזור ה-Cary בתוך השטח המסומן על המסך. כדי לאתר את אזור ההבזק של ה-UV, מלא פטה-פיפט (patch pipette) בתמיסה תוך-תאית המכילה את תרכובת ה-cage. הכנס את הפיפט למחזיק של ראש הבמה של מגבר ה-Apache clamp.באמצעות טכניקות סטנדרטיות של patch clamp. התקרבו לגוף התא של הנוירון עם פיפט patch והשיגו giga seal. לאחר מכן, עברו למצב whole cell במחשב.התחילו פרוטוקול גרייה והקליטו את התגובה. פרוטוקול גרייה טיפוסי מקבע את המתח בערך קבוע ומפעיל פולס UV לצורך ליזיס של תרכובת ה-cage. כעת נראה לכם מספר הקלטות מייצגות; מוצגת כאן התגובה של נוירון תחושתי מבודד מעכבר (OR) לליזיס של cage cyclic cAMP.החץ למעלה מציין את זמן השחרור של פולס UV. הזרם שהופעל על ידי Cycl MP נמדד במינוס 60 millivolt בתמיסת ריינגר חוץ-תאית דלה בסידן. שלב העלייה של הזרם היה מהיר והותאם לפונקציה מעריכית בודדת.כאן אנו רואים הקלטה מאותו נוירון שטבול בתמיסת רינגר רגילה, המכילה 1 mM סידן. שלב העלייה של הזרם ב-60- mV הפך לנמוך בהרבה ולרב-מופעי. זאת בשל פעולת הסידן החודר דרך תעלות ה-C recycling P gated, המפעילה זרם כלוריד משני.בדוגמה זו, קיבענו את המתח ל-60+ millivolt. זוהי דרך נוספת להפחית את זרימת הסידן פנימה. שלב העלייה של התגובה עקב שחרור ה-cyclone PN ב-60+ millivolt תואר היטב על ידי פונקציה מעריכית אחת, מה שמעיד על נוכחותו של רכיב זרם אחד בלבד.דוגמה לתגובות שהתקבלו על ידי שחרור פוטו-כימי של סידן בתוך ה-Celia מוצגת כאן; זרם זה מובל על ידי יוני כלור. המתח היה 50- millivolt. תגובות בעוצמות גדלות הושרו על ידי שחרור פוטו-כימי של סידן כלוב באמצעות הבזקי UV בעוצמות גדלות.הרגע הדגמנו כיצד לבצע הקלטה מנוירונים תחושתיים מפוזרים של מפעל בעת ביצוע פרוצדורה זו. חשוב לזכור להיות סבלניים מאוד. תודה שצפיתם, ובהצלחה בניסוי.

flash-photolysis-caged-compounds-cilia-olfactory-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת שליטה של ​​פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה עם חדירה עמוקה אופטי phototoxicity מופחת. אנו מתארים את השימוש בטכנולוגיה זו עבור תיוג תא חי עוברי דג הזברה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לזירוז, תמונה של אור תגובה מולקולות שונות.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

השיטה מתוארת להכנת יחיד photoreceptor תאים חיים ממינים שונים חוליות דימות פלואורסצנטי. השיטה יכולה לשמש התמונה פלואורסצנציה של fluorophores אנדוגני, כגון NADH או ויטמין A, או של exogenously צבעי ניאון הוסיף רגיש...

הכנת מבודדים תאים חיים בעלי חוליות photoreceptor עבור דימות פלואורסצנטי

אנו מתארים טכניקה הוקמה כדי למדוד ולנתח ריח עוררו תגובות סידן באונה מחושים...

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

מאמר זה מציג את הפרוטוקולים של אותות אופטיים flavoproteins מהותי autofluorescence הדמיה אותות ריח עורר פעילויות המפה על פני השטח של הנורה חוש הריח אצל עכברים.

פעילויות הדמיה ריח ועוררה הנורה חוש הריח באמצעות עכבר אופטי החזר אותות autofluorescence

למבוגרים יליד נוירונים להביע ChR2 ניתן לטפל בהכנות פרוסה אלקטרו על מנת לבחון את תרומתם כלפי פונקציה של מעגלים עצביים חוש הריח.

באמצעות מערכי LED משתלמת עבור גירוי-תמונה של נוירונים

סרטון זה מדגים שיטה להדמיית סידן in vivo באמצעות חיישני סידן סינפטיים מקומיים בזבובים. הוא מתאר את השלבים להכנת הזבובים למיקרוסקופיה, ביצוע מיזוג חוש הריח, והדמיית זרימת סידן הנגרמת על ידי ריח.

ב Vivo הדמיית סידן באמצעות חיישני סידן סינפטיים מקומיים בדרוזופילה מלנוגסטר

עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים...

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

אנו מתארים את השילוב של תמונה-הפעלה מושרה UV מוקד של תרכובות נוירו פעיל עם כל תא תיקון מהדק והדמיה רב פוטון של עוברי נתרן תאיים בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב בהיפוקמפוס בחתכי רקמה חריפים של מוח העכבר.

רב פוטון תאית נתרן הדמיה בשילוב עם משחרר רפרוף מיקוד בתיווך UV של גלוטמט בCA1 פירמידת נוירונים

פתחנו שיטה חדשנית במיקרוסקופ אלקטרונים, "פלאש-ו-הקפאה," המאפשרת ויזואליזציה של דינמיקה הממברנה עם רזולוצית ms זמנית. טכניקה זו משלבת את גירוי optogenetic של נוירונים עם מקפיא בלחץ גבוה. הנה, אנחנו מדגימים את הנהלים לתאר את הפרוטוקולים בפירוט.

פלאש-ו-Freeze: שיטה חדשנית לכידה Dynamics ממברנה עם מיקרוסקופית אלקטרונים

שלפוחית סינפטית (SV) רכיבה על אופניים היא מנגנון הליבה של המערכת הסנסור הסינפסות עצביים. FM לצבוע ספיגת המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות האמצעי העיקרי של באופן כמותי assaying SV אנדו - ו אקסוציטוזה שחרור. כאן, אנו משווים את כל השיטות גירוי לנהוג FM1-43 רכיבה על הסינפסה דגם צומת עצב-שריר (NMJ) דרוזופילה .

צבען FM רכיבה על הסינפסה: השוואה בין דפולריזציה אשלגן גבוהה, חשמל וגירוי Channelrhodopsin

כאן אנו מציגים פרוטוקול שבו ניתן לדמיין את הסידן הטרום ו/או הפוסט-סינפטיות בהקשר של למידה וזיכרון של דרוזוהילה . בשנת הדמיה vivo סידן באמצעות synaptically חיישנים סידן מקומי משולב עם הפרדיגמה הקלאסית מיזוג ריח כגון הפלסטיות הסינפטית הבסיסית בבסיס סוג זה של למידה אסוציאטיבית עשוי להיקבע.

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

למדו שימוש בפוטוליזה של תרכובות כלואה לחקירת תפיסה ריחנית בנוירונים סנסוריים של עכברים באמצעות רישומי patch-clamp. שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת במסלולי מעבר אותות עצביים.

פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

גלה סרטונים נוספים