הדמיה של קולטן אסטרוגן α ב Arterioles Pial עכברוש באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי Immunofluorescent

המטרה הכוללת של נוהל זה היא לתאר טכניקה פשוטה לאופטימיזציה של צביעה וויזואליזציה של estrogen receptor alpha באמצעות חתכים רוחביים של עורקי הקליפה (peel arterials) שהופקו ממוחות של חולדות נקבה. דבר זה מושג תחילה על ידי הסרת עורקי קליפה הצבועים בצבע Evan's blue מפני שטח המוח, וחיתוך שלהם לטבעות בעובי שמונה מיקרון באמצעות קריוסטט לאחר החתכים. החתכים הרוחביים מורכבים על עלויות ומודגדים עם הנוגדן הראשוני נגד estrogen receptor alpha.

בשלב הבא, מדגגי הרקמה מדוגרים עם הנוגדן המשני ועם צבע נגדי באמצעות תמיסות קיבוע המכילות dpi. לבסוף, מקטעי כלי הדם של הקליפה המסומנים פלואורסצנטית מצולמים ומומרים לתמונות דו-ממדיות באמצעות תוכנה למיקוד בעומק מורחב (extended depth focus). בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את רצפטור האסטרוגן אלפא בארטריולות של הקליפה באמצעות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי של Nikon עם תוכנה לעומק מורחב.

שמי ד"ר Marguerite Littleton Kearney. היום, ד"ר Neil Farani, עמית פוסט-דוקטורט במעבדתי, ידגים פרוצדורה פשוטה לאופטימיזציה של הוויזואליזציה והצביעה של estrogen receptor alpha ב-peel.

הוצאת עורקים ממוח של חולדה שעבר פרפוזיה עם צבע Evan's blue ונשמר בטמפרטורה של 70- מעלות צלזיוס. באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה, זהו את העורקים הבולטים על פני השטח של המוח והסר אותם באמצעות פינצטה בעלת קצה דק. הסר בזהירות כל רקמת מוח דבוקה.

הניחו את העורקים במבחנה קטנה על קרח. קבעו את העורקים בפורמאלדהיד 2% קר ב-0.1 mole של PBS למשך 30 דקות. כדי להכין את העורקים לחיתוך, שפכו מדיום טמינה על דיסק הקפאה המכוון למינוס 20 מעלות צלזיוס.

הניחו קטע של עורק בצורה שטוחה על ה-chug והמתינו להקפאתו. לאחר שהוקפא באופן יציב, הניחו את העורק במצב אנכי בתוך מדיום הטמעה על דיסק ההקפאה של הקריוסטט. ודאו שקצה העורק פונה קדימה.

החזיקו את העורק באמצעות פינצטה עד שיהיה קפוא לחלוטין. הניחו את דיסק ההקפאה עם העורק בראש הקריוסטט, ולאחר מכן חתכו טבעות עורק בעובי של שמונה מיקרון ישירות על גבי שלחון. רכבו את חתכי העורק על ג'לטין כרום-פוטשיום.

יישרו את טבעות העורקים על השקופיות באמצעות שתי מברשות צבע. אחסנו את השקופיות המוכנות בתוך קופסת שקופיות במקרר בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך לילה. הוציאו את השקופיות מהמקרר והביאו אותן לטמפרטורת החדר על משטח העבודה.

שטפו את השקופיות ב-1 עד 1.5 מיליליטר של 0.1 מולרי PBS. לאחר 10 דקות, רוקנו את ה-PBS וחזרו על הפעולה פעמיים נוספות. לאחר שטיפת ה-PBS האחרונה, דגרו את השקופיות במיליליטר אחד של 50 מילימולרי ammonium chloride למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. כדי להפחית פלואורסצנציה אנדוגנית, שטפו את השקופיות ב-0.1 מולרי PBS שלוש פעמים, למשך 10 דקות לכל שטיפה, כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, חסמו את השקופיות בתמיסת PBS המכילה 0.1% Triton X 100 בתוספת 1% normal goat serum למשך 30 דקות כדי להפחית קישור לא ספציפי של הנוגדן הראשוני.

לאחר החסימה, דגרו את השקופיות עם הנוגדן הראשוני נגד ER alpha המדולל לריכוז של 1:500 בתמיסת החסימה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. הוציאו את השקופיות מהמקרר והביאו אותן לטמפרטורת החדר. שטפו את כל הנוגדן הראשוני שאינו קשור באמצעות 1 עד 1.5 milliliters של 0.1% PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות.

בכל פעם, דגרו את השקופיות עם Oregon Green, 4 88 secondary anti rabbit בתמיסת חסימה למשך שעתיים בחושך בטמפרטורת החדר; לאחר הדגירה, שטפו את השקופיות ב-0.1 molar PBS שלוש פעמים, למשך 10 דקות לכל שטיפה, ולאחר מכן העבירו אותן למכסה מreVentilated hood. הניחו טיפה של מדיום הרכבה המכיל dappy על הכליים, ולאחר מכן הניחו זכוכית כיסוי מעל הדגימה. מרחו לק שקוף כדי לאטום את שולי זכוכית הכיסוי והמתינו לייבוש מלא.

הכניסו את השקופיות שהוכנו עם מקטעי כלי הדם הצבועים אל המיקרוסקופ וכוונו את המכשיר כדי להוות ויזואליזציה של האזורים המסומנים פלואורסצנטית הנמצאים במוקד העניין. ויזואליזציה של ER alpha הצבוע היא השלב הקשה ביותר בפרוצדורה זו. מצאו את מישור החיתוך של כלי הדם שבו הרצפטורים ברורים ביותר.

התחילו בהגדלה של 100 פעמים ולאחר מכן הגבירו את ההגדלה ל-600 פעמים. השתמשו במצלמה כדי ללכוד תמונות בערוצי DPI ו-ZI עבור גרעיני התאים ו-DR alpha בהתאמה, ולאחר מכן השתמשו בתוכנה כדי להמיר תצפיות מרובות של מקטעי כלי דם לתמונות דו-ממדיות. כאן מוצגות תוצאות הצביעה האימונופלורסצנטית עבור ER alpha בירוק וצביעה נגדית עם DPI.

בכחול בטבעת עורק המבודדת ממוח של חולדה נקבה, התמונות הממוזגות מרמזות על נוכחות של רצפטור אסטרוגן אלפא גרעיני. באמצעות שילוב של תמונות Z-stack, ניתן להשיג תמונה ממוקדת של immunofluorescence של ER אלפא כדי להסביר זאת; יש לבצע בקרות שליליות לאוטופלואורסנציה עבור הנוגדן הראשוני והשני כאחד. שימו לב לאוטופלואורסנציה המובחנת לאורך הצד האנדותליאלי של עורק שלא הועבר אינקובציה עם נוגדן שני.

לאחר צפייה בסרטון זה, תבבינו כיצד לבודד ולקלף עורקים מפני השטח של המוח ולהכין טבעות בחתך רוחב בעובי שמונה מיקרון. בנוסף, תכיר את אופן השימוש ב-estrogen receptor alpha המסומן פלואורסצנטית, ואת הדרך לוויזואליזציה של הרצפטורים באמצעות מיקרוסקופ אימונופלוורסצנטי דיגיטלי ותוכנת Nikon extended.