ניבוי של שימוש בנגיף HIV-1 Coreceptor (זיקה) על ידי ניתוח רצף באמצעות גישת genotypic
1 בדצמבר 2011
החיזוי של שימוש coreceptor של HIV-1 נדרש לניהול קבוצה חדשה של תרופות תרופתיות, יריבי coreceptor כלומר. זה יכול להתבצע על ידי ניתוח רצף Env גן ופרשנות לאחר מכן באמצעות מערכת פרשנות מבוססת אינטרנט (geno2pheno [Coreceptor]).
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנבא את השימוש בקו-רצפטורים של HIV-1 לצורך מתן סוג חדש של תרופות אנטי-רטרו-ויראליות. דבר זה מושג על ידי בידוד חומצות גרעיניות גנומיות ויראליות, RNA ויראלי או DNA פרו-ויראלי מדם המטופל, לאחר הגברה של אזור המעטפת. אזור ה-V3 הוויראלי, המהווה את הגורם המכריע העיקרי לטרופיזם, מוגבר באמצעות nested PCR.
בשלב הבא, האמפליקון V3 מעובד בריצוף באמצעות פריימרים שונים כדי להפיק קובץ fasta. התוצאות המתקבלות מראות את הטרופיזם הויראלי ואת הרגישות לאנטגוניסטים של הקו-רצפטור, בהתבסס על שיעור התוצאות החיוביות השגויות (FPR) כפי שחושב באמצעות כלי הפרשנות המקוון geno to pheno coreceptor. בהתאם לשימוש ב-CORECEPTOR, נגיפי HIV מסווגים כ-R5 או X4.
Maraviroc נקשר לקולטן CCR5, ובכך מעכב את כניסת וירוסי R5 לתא המטרה. במהלך מהלך המחלה עשויים להופיע וירוסי X4 ולהגביש עליונות מספרית על וירוסי R5. לכן, קביעת סיום השימוש בקולטן, המכונה טרופיזם (tropism), היא הכרחית לפני מתן maraviroc, כפי שנדרש על ידי ה-EMA וה-FDA.
היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע קביעה מקבילה של העמידות למשפחות תרופות אנטי-רטרו-ויראליות אחרות בקלות רבה. שיטה זו מאפשרת רפואה מותאמת אישית הרבה יותר, שכן ניתן לשנות את ערכי הסף עבור תוצאות הטרופיזם בהתאם לצורכי המטופל. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה בתחילת שנות התשעים, כאשר רצינו להבין את הבסיס המולקולרי של קצבי הצמיחה השונים של זני HIV בתרביות תאים ואת התקדמות המחלה במטופלים; הפרוצדורה יודגש על ידי טכנאי מקבוצתנו לפני תחילת פרוטוקול זה.
הדגימות נאספות כדם ב-EDTA באתר הקליני ונשלחות למעבדה כדי להתחיל בבידוד חומצות גרעין של HIV מ-1000 µL של סרום או פלזמה של דם מלא באמצעות מערכת mag pure compact וערכה לבידוד חומצות גרעין לפי הוראות היצרן. ה-RNA או ה-DNA שהתקבלו מומסים לאחר מכן ב-50 µL של באפר TE. השלב הבא הוא הגברה של אזור המעטפת של החומצה הגרעינית באמצעות RT-PCR עבור RNA או PCR פשוט עבור DNA כפי שמתואר בטקסט; התגובה אמורה להפיק תוצר באורך 1,245 זוגות בסיסים הכולל את מרבית אזור חלבון המעטפת. להגברת אזור V3 של חלבון המעטפת, בצעו nested PCR תוך שימוש ב-5 µL מתגובת ה-PCR הראשונה כתבנית.
הכינו את התגובות באמצעות תערובת מאסטר (master mix) עבור nested PCR פנימי כפי שמתואר בטקסט. פרמטרי ההרצה של ה-Nested PCR מפורטים שם אף הם. לאחר הגברת אזור V3, נתחו את תוצר ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה בג'ל כדי לוודא את קיומו של התוצר הצפוי באורך 902 base pair לפני הריצוף.
טהרו את תוצר ה-PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר טיהור תוצר ה-PCR, בצעו את תגובת הריצוף כפי שמתואר בטקסט, ועם סיום התגובה, טהרו את דגימות הריצוף באמצעות cidex G 50 superfine ולוחית סינון רב-מסננת עם ממברנת durapore, בהתאם להוראות בחלק הכתוב של הליך זה. כדי לרצף את התוצר המטוהר, הכינו את הרצף על ידי בדיקת הפולימר והחלפת התמיסה הבאפר.
לאחר מכן טען את הדגימות, הגדר את התנאים והפעל את הריצה. עם סיום ריצת הריצוף, ניתן להשתמש בתוכנת DNA STAR laser gene כדי לבצע יישור ועריכה של הרצפים.
את האמפליקון V3 מרצפים באמצעות לפחות פריימר אחד קדמי ופריימר אחד אחורי. תוכנת Lasergene מיישרת את קבצי ה-ABI שהתקבלו מהרצף אל מול רצפי הייחוס. V3, consensus B ו-envelope laser gene יוצרים רצף קונסנזוס של הדגימה המנותחת תוך שימוש בכל הנתונים הגולמיים הזמינים, ללא רצפי הייחוס, ושומרים אותו כקובץ FASTA.
קובץ ה-FASTA הוא קובץ טקסט הכולל כותרת עם שם הדגימה ורצף הנוקלאוטידים. כדי להתחיל בפירוש הנתונים ובחיזוי הטרופיזם, העלו את קובץ ה-FASTA למערכת הפירוש מבוססת האינטרנט. ב-Geno Tono co-receptor בחרו את ערך ה-FPR cutoff שעד אליו הנגיף מסווג כ-R five.
על פי ההנחיות הגרמניות, הנגיף מסווג כ-R five. כאשר FPR גדול מ-20% או שווה לו, הוא מסווג כ-X four, וכאשר FPR קטן מ-12.5%. בחרו פרמטרים קליניים נוספים אם הם זמינים, ולאחר מכן בחרו ב-align and predict. שרת זה מתרגם את רצף הנוקלאוטידים לחומצות אמינו, מבצע יישור (align) אל מול רצף ה-V three consensus B, ומפיק סיווג של תת-סוג. בנוסף, הוא מייצר תחזית של השימוש בקו-רספטור המבוטאת כ-FPR.
הפלט מציג פרשנות מדורגת התלויה בסבירות של השימוש בקו-רספטור. עבור ערכי FPR גבוהים, ניתן להיות בטוח שהנגיס אינו X four, ועבור FPR נמוך לא ניתן להיות בטוח במראה הנגיס אם הפרשנות, הטקסט וצבע הרקע הם ירוקים. במצב זה מומלץ על מתן בטוח של Ravi Rock, בעוד שצבע צהוב מרמז על סיכון נמוך אפשרי בשימוש ב-Ravi Rock, וצבע אדום מציין שאין לרשום Ravi Rock.
בנוסף, השרת מפיק דוח PDF שניתן להדפיס ולשלוח לרופא. נתונים נוספים, כגון שם המטופל או תאריך דגימת הדם, ניתן להוסיף באופן ידני באמצעות תוכנת כתיבת PDF. במחשבו הפרטי של המשתמש ניתן להוסיף גם הערות ספציפיות.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לקבוע את ה-viral chops באמצעות כלי ה-geno pheno receptor. במהלך ביצוע הליך זה, חשוב לבצע בקרות איכות באופן שוטף. זכרו כי עבודה עם HIV עלולה להיות מסוכנת ביותר, ולכן יש להקפיד תמיד על נקיטת אמצעי זהירות ועל עבודה במעבדות ביו-בטוחות מאושרות.
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בניבוי השימוש בקו-רספטורים (co-receptors) של HIV-1 כדי להקל על מתן מעכבי קו-רספטורים. המתודולוגיה כוללת בידוד של חומצות גרעין ויראליות וניתוח של אזור V3 בגן המעטפת (envelope gene).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- וירולוגיה
- מחקר HIV
- טיפול אנטי-רטרו-ויראלי
רקע
- הבנת השימוש בקו-רספטורים של HIV היא קריטית לטיפול יעיל.
- מעכבי קו-רספטורים, כגון maraviroc, נמצאים בשימוש על בסיס תחזיה זו.
- טרופיזם ויראלי עשוי להשתנות במהלך התקדמות המחלה.
- תחזיה מדויקת משפרת גישות של רפואה מותאמת אישית.
מטרת המחקר
- לניבוי השימוש בקו-רצפטור של HIV-1 לצורך התאמת טיפול אנטי-רטרוביריאלי.
- לניצול ניתוח רצפים של הגן env לצורך ניבוי זה.
- לשיפור תוצאות הטיפול בחולים באמצעות אסטרטגיות טיפוליות מותאמות אישית.
שיטות שהושתמשו
- בידוד RNA או DNA נגיפי מדגימות דם של מטופלים.
- הגברה של אזור המעטפת באמצעות טכניקות PCR.
- ריצוף של אזור V3 וניתוח באמצעות הכלי geno2pheno.
- סיווג של זני HIV על בסיס השימוש בקו-רספטורים.
תוצאות עיקריות
- הגברה וריצוף מוצלחים של אזור V3.
- סיווג של HIV כ-R5 או X4 על סמך ערכי FPR.
- הפקת דוח PDF לשימוש קליני.
- הבנה משופרת של הטרופיזם הויראלי והשלכות הטיפול.
מסקנות
- ניתן להשיג חיזוי מדויק של השימוש בקו-רצפטור של HIV.
- שיטה זו תומכת בקבלת החלטות לגבי טיפול מותאם אישית.
- בקרת איכות קבועה היא חיונית בעת טיפול בדגימות HIV.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
חיזוי מדויק של השימוש בקו-רצפטור של HIV-1 חיוני למתן בטוח של maraviroc, אנטגוניסט של CCR5, כפי שנדרש על ידי גופי רגולציה. גישה גנוטיפית זו מאפשרת קביעה מהירה וחסכונית של הטרופיזם מדגימות בעלות עומס ויראלי נמוך, ובכך תומכת בהחלטות על טיפול אנטי-רטרוויראלי מותאם אישית. היא מספקת חלופה מבוזרת לבדיקות פנוטיפיות, ובכך מקלה על אימוץ קליני רחב יותר בתוך תהליכי בדיקה לעמידות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור וריאציות ברצף V3 לתחזיות של שימוש בקו-רספטורים.
- ערך תפעולי: תומך באישור המטרה באמצעות קורלציה גנוטיפית עם תוצאות טרופיזם פנוטיפיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר פלטי FPR כמותיים המאפשרים סיווג טרופיזם סטנדרטי לצורך כיול הבדיקה.
- ערך תפעולי: מקל על מוכנות לסריקה בעוצמה גבוהה (high-throughput) באמצעות nested PCR וריצוף התואמים לתהליכי בדיקת עמידות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר התאמת ערכי סף (cutoff) לצרכים ספציפיים של המטופל, ובכך מגביר את גמישות הבדיקה בפיתוח קליני.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק סיווג טרופיזם רלוונטי למחלה באמצעות דגימות ממטופלים עם עומס נגיפי של <1000 copies/µL.
- ערך תפעולי: מאפשר ניטור אורך של שינוי בקו-רצפטור במהלך התקדמות המחלה במודלים פרה-קליניים.
- סמן ביולוגי תרגומי: רצף V3 משמש כסמן ביולוגי חזוי לרגישות למאראבירוק (maraviroc) בניסויים בשלבים מוקדמים.
שילוב תהליכי עבודה ו-Pipeline
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי המולקולה המובילה, על ידי אספקת נתוני טרופיזם המנחים את בחירת התרכובת ואת הפרשנות המכנית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי אינטראקציות של Env-V3 עם קו-רצפטורים באמצעות חיזוי מבוסס רצף.
- סריקה: מספקת תוצאות טרופיזם כמותיות הניתנות לשחזור, המאפשרות הערכה מהימנה של תרכובות כנגד וריאנטים ויראליים.
- אנליטיקה: מייצרת ערכי FPR וסיווגי תתי-סוגים המאפשרים השוואה בין תנאים שונים וסטיפיקציית סיכונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין טרופיזם גנוטי לחיזוי תגובה קלינית, ובכך תומכת בהחלטות go/no-go בפיתוח תרופות אנטי-ויראליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מנצלת תשתיות קיימות לבידוד חומצות גרעיניות ול-PCR המשמשות לבדיקות עמידות, ובכך מצמצמת את הצורך בהשקעה במשאבים חדשים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בקביעת קורצפטור באמצעות קורלציה גנוטיפית-פנוטיפית.
- ערך תפעולי: מקצר את זמן התגובה ומפחית את העלות בהשוואה לבדיקות פנוטיפיות, ובכך מגביר את הנגישות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי כך שמאפשר זיהוי מוקדם של וריאנטים עם טרופיזם ל-X4 שעשויים לחמוק מעקיבה של CCR5.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהקדמה מותאמת-סיכון על ידי זיהוי מטופלים שסביר שיהיו מפיקים תועלת ממשטרי טיפול המבוססים על maraviroc.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד חומצות גרעין של HIV, ב-nested PCR ובריצוף סנגר (Sanger sequencing).
- תלוי בגישה לרצפים, למכשירים תרמיים ל-PCR ולאלקטרופורזה של ג'ל לאימות האמפליקונים.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים להגברה וריצוף של אזור V3 כדי להבטיח הדירות בין אתרים שונים.
- דורש הכשרה בשימוש בכלי geno2pheno ובפרשנות של סף FPR לקביעה מדויקת של הטרופיזם.
- מוגבל על ידי הצורך באיכות דגימה מספקת להגברת אזור V3 מדגימות עם עומס נגיפי נמוך.
