גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפיק תאי לב ישירות ובלעדית מתאי גזע עובריים אנושיים פלוריפוטנטיים באמצעות השראה באמצעות מולקולות קטנות. דבר זה מושג על ידי הוספת nicotinamide לתאי ES אנושיים לא מובחנים המוחזקים בתנאים מוגדרים. לאחר מכן, תאים בתהליך התמיינות לבבית מופרדים כדי ליצור cardio blasts, מקבצי תאים צפים בתרבית סספנסיה.

לאחר היווצרם, מוּעברים ה-cardio blasts למצע דיפרנציאציה לבבית שבו הם ממשיכים להתפתח לתאי שריר לב (cardiomyocytes) פועים. לבסוף, התוצאות מוערכות באמצעות אימונופלואורסצנציה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית או דה-קונבולוציה, וכן באמצעות רישומים אלקטרופיזיולוגיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת השראה יעילה של תאי גזע Embryonic Stem Cells אנושיים פלוריפוטנטיים באופן בלעדי לעבר שושלה לבבית, באמצעות אספקה פשוטה של מולקולות קטנות.

בעוד שבשיטות קיימות של גביעה רב-קוית, רק חלק קטן מהתאים מאמצים פנוטיפ קרדיאלי. ישנם מספר שלבים הדורשים זהירות בעת הכנת תמיסות המלאי. יש להקפיד על הפשרה איטית של matrigel ולמיננין אנושי מ-80- מעלות צלזיוס ל-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה, לאחסן את המדיום ב-4 מעלות צלזיוס, ותמיד לחמם את המדיום ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

בנוסף, בעת הכנת מצע גידול לתאי ES אנושיים, חלק מהתוספים מתווספים רק רגע לפני השימוש. אלה כוללים BFGF, ascorbic acid, human insulin active in A ו-transfer in. לאחר מכן, הכינו את תמיסות העבודה של matrigel או laminin אנושי מיד לפני ציפוי הפלטה.

דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C ב-5% carbon dioxide לאחר הכנת צלחות תרבית רקמה מצופות מראש בג'לטין. ניתן להחליף את הג'לטין בתמיסה עובדת של matrigel או laminin. צפו את הצלחות אלו על ידי דגירה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.

התחילו במתן אפשרות למושבות של תאי ES אנושיים לגדול במשך חמישה עד שבעה ימים, ולאחר מכן הכינו את השטח לפיצול של חלק מהם. בחרו מושבות עם יותר מ-75% תאי ES אנושיים לא מובחנים. הן בדרך כלל עכורות מעט עם קצוות מוגדרים ומושבות המכילות תאים שנערמו. סימן לתחילת בידול מופיע בדרך כלל כמושבות לבנות, בעוד שמושבות המכילות בעיקר תאים מובחנים נראות בדרך כלל שקופות.

אין לבחור מושבות לבנות או שקופות. החזיקו את הפלטות מול מקור אור והשתמשו בטוש כדי לסמן את גבולות המושבות העכורות במקצת בחלק התחתון של הפלטות. השתמשו בקצה של טיפ פחית P2 סטרילי כדי להפריד את שכבת הפיברובלסטים המקיפה את מושבת תאי ה-ES האנושיים.

לאחר מכן, הסירו את תאי הפיברובלסטים המקיפים וכן את כל החלקים המובחנים של המושבה. כעת, שאבו את המצע הישן המכיל את התאים המובחנים שהסתלקו. לאחר מכן, שטפו בכל באר את התאים הבלתי-מובחנים פעם אחת עם מצע לתאי ES אנושיים ללא BFGF, ואז הוסיפו שלושה מיליליטרים של מצע טרי לתאי ES אנושיים המכיל BFGF; את ה-BFGF מוסיפים למצע הטרי מיד לפני השימוש.

כעת השתמשו בטיפ של פיפט P2 סטרילי כדי לחתוך את המושבות לחתיכות קטנות ולהפריד אותן מהצלחית. העבירו את חתיכות המושבות המופרדות יחד עם המצע שלהן לשפופרת קונית של 50 מיליליטר. בצעו שטיפה נוספת של 1 מיליליטר מצע לכל באר.

התאים מוכנים כעת להמשך דיפרנציאציה באמצעות מולקולות קטנות. התחילו בחימום של פלטות שעברו ציפוי טרי ל-37 °C. שאבו את תמיסת הציפוי מהפלטות והוסיפו לכל באר מנה של 4 mL של מדיה המכילה חלקי מושבות, לאחר מכן העבירו בעדינות את הפלטות לאינקובטור ללא ניעור.

אין להפריע לצלחות כדי לאפשר לתאים להיקלט. לאחר מכן, יש להסיר את רוב המצע הישן, ולהשאיר כמות מספיקה של מצע כך שהתאים יישארו תחת המצע. אין לאפשר לתאים להתייבש בשום שלב.

ערבבו מצע גידול ESL אנושי טרי המכיל basic FGF וניקוטינמיד, והוסיפו מספר מיליליטרים של מצע זה לכל באר. ניתן לשמור את המצע למשך עד שבועיים בטמפרטורה של 4 °C, ובמהלך תקופה זו ניתן להשתמש בו כדי לרענן את תרבית התאים מדי יומיים לצורך גידול המושבות. לאחר שמונה עד 10 ימים, התאים יעברו שינויים מורפולוגיים לתאים מובחנים גדולים שהתרבו והצטברו.

לאחר מכן, המשיכו לתרבית סספנסיה; כדי להקים תרבית סספנסיה, התחילו בהפרדת מושבות ESL מתאים שעברו דיפרנציאציה ספונטנית ונדדו החוצה ליצירת שכבת פיברובלסטים. השתמשו בטכניקה שהוזכרה לעיל עם טיפ פחית סטרילי, ולאחר מכן שאבו את המצע הישן המכיל תאי פיברובלסטים מנותקים הצפים במצע. שטפו את התאים פעם אחת עם מצע HESC והשביו אותם לסספנסיה בשלושה מיליליטרים של מצע HESC, הפעם באמצעות טיפ פחית P2 סטרילי.

חלקו את המושבות לחתיכות קטנות ונתקו אותן מהצלחת. העבירו את המצע עם המושבות שנותקו למסורת קונית אחת בנפח 50 מיליליטר. שטפו את הבארים עם מיליליטר אחד של מצע והוסיפו את מי השטיפה למאגר המשותף.

לאחר מכן, העבירו מנות של 4 mL מהתאים המאוגדים לכל באער של פלטת 6 באערים בעלת היצמדות נמוכה במיוחד (ultra-low attachment plate) למשך ארבעה עד חמישה ימים. השאירו את הפלטה באינקובטור כדי לאפשר היווצרות של צבירי תאים צפים או קרדיובלסטים (cardio blasts), כדי לקדם את הקרדיובלסטים לפנוטיפ של קרדיומיוציטים פועמים. רכזו אותם בתוך מבחנה קונוית של 50 mL יחד עם המצע שלהם.

לאחר מכן, סובבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1,400 RPM למשך חמש דקות. שאבו את הנוזלים, שקלו כמות גדולה ככל האפשר של המצע הישן והוסיפו כמות שווה של מצע התמיינות לב cardiac טרי, המכיל 10 millimolar nicotinamide.

ערבבו את ה-cardio blasts הצפים באמצעות פיפטא, ולאחר מכן העבירו מנה של 4 mL מתלי ה-cardio blasts לכל באער של פלטות תרבית רקמה בעלות שישה באערים. העבירו את הפלטות לאינקובטור לח 37 °C כדי לאפשר ל-cardio blasts להיקשר לפלטות תרבית הרקמה במהלך הלילה. בכל יום שני בטיפוח התרבית.

החליפו את מצע ההגהיה הקרדיאלית המכיל 10 mM nicotinamide ביום השמיני. עברו למצע הגהיה קרדיאלית ללא nicotinamide. המשיכו להחליף את המצע בכל יום שני.

בתוך שבועיים לאחר הפסקת מתן הניקוטינאמיד יחילו קרדיומיוציטים פועים להופיע ומספרם יעלה; הניקוטינאמיד מספק כדי להוביל תאי ES אנושיים, המטופחים במערכת תרבית מוגדרת, לעבור ממצב של פלוריפוטנציות באופן בלעדי לפנוטיפ קרדיו-מזודרמלי. בעקבות חשיפת תאי ES אנושיים לא מבדלים לניקוטינאמיד, כל התאים בתוך המושבה עברו שינויים מורפולוגיים לתאים מבדלים גדולים שביניהם ירדה רמת הביטוי של OCT four. התאים החלו לבטא גם את גורם השעתוק הספציפי ללב, NK X 2.5, וכן לבטא alpha actinin.

שני המאפיינים עקביים עם הפנוטיפ של מזודרם לבבי. תאים מובחנים אלו ממשיכים להתרבות ולהגדיל את גודלם באזורי המושבות שבהם התרחשה הצטברות של תאים. ביטוי NKX 2.5 הפך לעוצמתי יותר. לאחר ניתוק, תאי ES אנושיים שעובדו בניקוטינאמיד יצרו קרדיובלסטים בתרבית סספנסיה.

לאחר מתן אפשרות לתאי ה-cardio blasts להיקשר, טופלו תאי ה-cardio blasts בניקוטינמיד למשך שבוע אחד; שבוע עד שבועיים לאחר הפסקת הטיפול בניקוטינמיד, החלו להופיע קרדיומיוציטים פועמים עם עלייה דרמטית ביעילות. אלו הופיעו כצבירים תאיים שפעםו בהתכווצויות קצביות; דיפרנציאציה ספונטנית רב-קוית של תאים שלא עברו טיפול IDE לא הביעה מאפיינים אלו. תאים בתוך צבירי הקרדיומיוציטים הפועמים ביטאו סממנים האופייניים לקרדיומיוציטים, כולל NK X 2.5 ו-alpha actinin.

התכווצויות התאים השריריים של הלב (cardiomyocytes) הפועמים אושרו באמצעות פרופילים חשמליים כחזקות, קצביות, מתואמות ומסונכרנות היטב; הם הראו דחפים סדירים המזכירים את קומפלקס ה-P-Q-R-S-T הנצפה באלקטרודות מפני השטח של הגוף באלקטרוקרדיוגרמות קליניות. יתרה מכך, התאים השריריים של הלב יכלו לשמר את יכולת ההתכווצות החזקה שלהם במשך למעלה משלושה חודשים. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן להשתמש בה כדי לייצר תאי קדם לבביים ותאים שריריים של הלב הפועמים באופן אחיד מתאי גזע עובריים אנושיים פלוריפוטנטיים בתוך כחמישה שבועות, במידה שהיא מבוצעת כהלכה.