בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים
20 בפברואר 2012
אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.
במאמר וידאו זה, פיברובלסטים בוגרים אנושיים מתוכנתים מחדש ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות וקטורים רטרו-ויראליים. ראשית, פיברובלסטים אנושיים מתמרים עם וקטורים רטרו-ויראלים המקודדים את גורמי השעתוק. T שלוש ארבע, SOX שתיים, KLF ארבע ו-cmic.
הפיברובלסטים הנגועים מתורבתים על תאי הזנה עובריים של עכברים למשך 14 עד 28 יום. התרביות המתקבלות מוכתמות בנוגדני TRA 180 1 כדי לזהות מושבות של תאים מתוכנתים מחדש. לאחר מכן מושבות חיוביות מועברות ל-MEF המכילות צלחות להתרחבות.
צביעה כימית של אימונו-ציטו מאשרת את הביטוי של סמני פלוריפוטנטיות והקמת קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים. לאחר מכן יש לבצע מחקרים נוספים כדי לאפיין עוד יותר את הקווים. בדרך כלל, אנשים חדשים בתכנות תאי התאים הסומטיים ותרביות תאי גזע פלוריפוטנטיות המושרות על ידי בני אדם יתקשו מכיוון שקשה לזהות את מושבות ה-IPSC הנכונות.
מישתדגים את ההליך תהיה ד"ר סולה פולק, פוסט-דוקטור או עמיתה מהמעבדה שלי. התחל הליך זה על ידי ציפוי תאי Phoenix AM FO בצפיפות של כשבעה עד 8 מיליון תאים לצלחת של 10 סנטימטר ב-10 מיליליטר של גלוקוז גבוה DMEM באינקובטור ובתרבית למשך הלילה. למחרת הכינו תערובות טרנספקציה המורכבות מ-12 מיקרוגרם של וקטור המקודד T שלוש ארבע SOX, שני klf, ארבעה cmic או גן GFP ו-35 מיקרוליטר מעט גן שש בנפח כולל של 500 מיקרוליטר של גלוקוז גבוה ללא סרום DMEM עם L גלוטמין.
דוגרים על התערובות למשך 20 דקות. לאחר מכן, כדי להעביר את תאי עוף החול, פיפטו בעדינות את קומפלקסי ה-DNA לתוך הלוחות המכילים תאי עוף החול, שאמורים להיות מתכנסים ב-70 עד 80%. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאחר שש עד שמונה שעות.
שאפו את המדיום והחליפו אותו בשמונה מיליליטר של גלוקוז גבוה DMEM עם אנטיביוטיקה. לאחר מכן החזירו את הצלחות לחממה למשך 12 שעות לאחר הדגירה. השתמש בפיפטה כדי לשאוף ולאסוף את המדיום המכיל את הנגיף.
לאחר מכן החלף את המדיום וחזור על תהליך זה כל 12 שעות עד שנאסף המדיום ארבע פעמים. אחסן את המדיום בארבע מעלות צלזיוס. לאחר איסוף כל המדיום, שלב את כל המנות, ואז שפך אותו דרך מסנן עליון של צינור 0.45 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי להסיר תאים מנותקים ופסולת.
את המדיום המסונן, המכיל חלקיקים נגיפיים, ניתן לשמור במקרר למשך שבועיים מבלי לאבד פעילות זיהומית. הקפאה אינה מומלצת. ביום שלפני הליך ההתמרה הפשירו את המלאי הקפוא של פיברובלסטים אנושיים בוגרים והוסיפו פעם אחת 10 לתאים החמישיים לכל באר של שש צלחות מצופות ג'לטין היטב.
למחרת בשפופרת חרוטית של 50 מיליליטר, שלבו 3.5 מיליליטר כל אחד מ-T ארבע SOX שתיים, klf ארבע ומדיום ויראלי cmic, והוסיפו פולי-מוח לריכוז סופי של שישה מיקרוגרם לליטר כביקורת. הכן מיליליטר אחד של מדיום ויראלי GFP, שלושה מיליליטר תרבית, מוח בינוני ופולי בריכוז סופי של שישה מיקרוגרם למיליליטר. שאפו את המדיום מהצלחת המכילה פיברובלסטים אנושיים.
לאחר מכן הוסף ארבעה מיליליטר של מדיה ויראלית מעורבת או צנטריפוגה בינונית בקרה על הצלחות ב -1600 גרם למשך שעה ב -20 מעלות צלזיוס לאחר הצנטריפוגה. דגרו את הצלחות למשך כ -12 שעות. לאחר מכן החלף את המדיום הנגיפי במדיום תרבית פיברובלסטים ודגר למשך 12 שעות נוספות.
חזור על תהליך זה מזיהום לתרבית במדיום פיברובלסטים, פעמיים נוספות לאחר ההדבקה האחרונה. תרבית את הפיברובלסטים ב-DMEM למשך 48 שעות. לאחר מכן בדוק את יעילות הזיהום של ההתמרות המקבילות עם המדיום הרטרו-ויראלי GFP.
הבא ליזום תכנות מחדש מתאים סומטיים לתאים פלוריפוטנטיים. הפיברובלסטים הנגועים מתורבתים במדיום תאי גזע עובריים אנושיים או עכבר זרע בינוני HES, פיברובלסטים או MEFs בצפיפות של בערך פי 10 עד חמישית תאים לכל באר של הג'לטין המטופל. צלחת שש בארות במדיום גידול פיברובלסטים למחרת.
פצלו את הפיברובלסטים האנושיים הנגועים באמצעות 0.05% טריפסין EDTA וזרעו אותם בצפיפות של כ-1.2 פעמים 10 עד הרביעית לבאר במדיום הגידול הפיברובלסטים. למחרת. החלף את המדיום במדיית HES המכילה 0.5 מילי-מולרי נתרן בוטיראט במשך שבעת הימים הראשונים של התכנות מחדש.
החלף את המדיום מדי יום. החלף את המדיה במדיה HES ללא נתרן בוטיראט והמשך בתכנות מחדש למשך שבעה עד 21 ימים נוספים. שנה את המדיום מדי יום.
בדוק את התאים המומרים לאיתור שינויים מורפולוגיים. מושבות של תאים יתחילו להופיע כ-10 ימים לאחר העברת הפיברובלסטים המומרים לתאי הזנה. המושבות המכילות את התאים המתוכנתים מחדש מכונות כיום תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים או תאי IPS אנושיים.
מושבות תאי ה-IPS האנושיות יהיו מוכנות לבידוד תוך 14 עד 28 יום לאחר ציפוין על תאי ההזנה MEF. בשלב זה, ניתן להעביר מושבות תאי IPS אנושיים לצלחות המכילות MEF או מכוסות מטריג'ל כאן. העברה לצלחות המכילות MEF מודגמת יום לפני בחירת מושבות תאי ה- IPS האנושיים זרע 24 צלחות באר המכילות תאי הזנה MEF מוקרנים גמא במדיום גידול פיברובלסטים.
דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ביום שבו ייבחרו מושבות תאי ה-IPS האנושיות. שאפו את מדיום הגידול הפיברובלסטים מה-ME Fs ושטפו אותם עם PBS כדי להסיר עקבות של FBS. לאחר מכן הוסף 0.5 מיליליטר של תאי גזע עובריים אנושיים או מדיום HES המכיל 10 מעכבי סלע מיקרו-מולארי Y 2 7 6 3 2 לכל באר לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ המותקן במכסה זרימה למינר, בחן את לוחות התכנות מחדש להיווצרות מושבת תאי IPS אנושית.
במידת הצורך, הסר את הפיברובלסטים המקיפים את מושבות תאי ה-IPS האנושיים בעזרת מחט בגודל 21. שטפו את הצלחות עם PBS והוסיפו מדיום HES טרי המכיל את הנוגדן הספציפי החי TRA 180 1. החזר את התאים לחממה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
לאחר 30 דקות, החלף את המדיום במדיום HES טרי בתוספת 10 מעכבי סלע מיקרו-מולרי. לאחר מכן צפו במושבות תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. סמן TRA 1 עד 81 מושבות חיוביות.
שימוש בסמן אובייקטיבי באמצעות מחט מד 21. חותכים את מושבות תאי ה- IPS האנושיים החיוביים TRA 180 1 למספר חתיכות קטנות. לאחר מכן, באמצעות פיפטה אוטומטית העבירו שברי מושבות תאי IPS אנושיים לבארות בודדות של צלחת 24 הבארות עם ME Fs.הימנע מהעברת תאים שאינם IPS.
הנח את הצלחות באינקובטור ואפשר למושבות תאי ה- IPS האנושיות להיצמד למשך 24 עד 36 שעות החלפת מדיום מדי יום. מושבות תאי ה-IPS האנושיות עם מורפולוגיה נכונה כמו HE יהיו גלויות 48 שעות לאחר ההעברה הראשונית לצלחת של 24 בארות לעבור ידנית מושבות תאי IPS אנושיות כל שישה עד שמונה ימים על ידי חיתוך שלהן עם לוחית מחט בגודל 21. הרחבת תרביות לבאר 12 ולאחר מכן על צלחת שש בארות לאחר הרחבה משובטת.
והקמת קווי תאי ה-IPS האנושיים מנתחים את הביטוי של סמני פלוריפוטנטיות TRA אחד 60 SSEA ארבע, T שלוש, ארבעה SOX שניים וננוג באמצעות אימונוכימיה לאחר הקמת הקווים. אפיון מפורט עשוי לכלול במבחנה וב-vivo. ניתוח התמיינות, ניתוח קריוטיפ, ניתוח מחקרי מתילציה להשתקת טרנסגנים ומחקרי ביטוי גנים.
התמרה יעילה עם מדיום המכיל רטרו-וירוס היא קריטית לתכנות מחדש מוצלח כדי לקבוע את היעילות של התמרה ויראלית. פיברובלסטים בוגרים אנושיים שמקורם בחולה אטקסיה פרידריכס הודגמו לאחר שני זיהומים רצופים במדיום רטרו-ויראלי GFP כאשר הפיברובלסטים נדבקו על ידי דגירה פשוטה עם מדיום נגיפי, פחות מ-20% מהתאים מתמרים. עם זאת, כאשר מיד לאחר הוספת המדיה הרטרו-ויראלית GFP יעילות ההתמרה גדלה באופן דרמטי.
כאן יותר מ-80% מהתאים מתמרים כדי לבצע אפיון ראשוני של מושבות תאי ה-IPS האנושיות המבודדות. הביטוי של סמני פלוריפוטנטיות האופייניים לתאי ES אנושיים הוערך על ידי אימונוכימיה כפי שמוצג כאן. מושבות תאי IPS אנושיות מבודדות היו חיוביות לסמני הפלוריפוטנטיות.
T שלוש ארבע SOX שני ננו SSEA ארבע ו-TRA אחד 60 DNA. צביעת Cos עם DPI המוצגת על הפאנלים העליונים מזוהה הן במושבות תאי ה-IPS האנושיים והן בתאי ההזנה. תוצאות אלה מדגימות כי תאי IPS אנושיים המתקבלים באמצעות פרוטוקול תכנות מחדש זה מבטאים סמני פלוריפוטנטיות מתאימים האופייניים לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לא מובחנים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנת מחדש בהצלחה פיברובלסטים אנושיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות טרנזקציה רטרו-ויראלית שזוהתה אינדוקציה אנושית נכונה, מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיות ולבצע אפיון ראשוני של מחשבי HI.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לתכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים בוגרים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים (hiPSC) באמצעות וקטורים רטרו-ויראליים. התהליך כולל טרנסדוקציה של פיברובלסטים עם וקטורים המקודדים לגורמי שעתוק מרכזיים וזיהוי של תאים שעברו תכנות מחדש באמצעות צביעה של תאים חיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של תאי גזע
- תכנות מחדש של תאים
- תפקוד של גורמי שעתוק
רקע
- ניתן להפיק תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (hiPSC) מתאים סומטיים.
- וקטורים רטרובירליים משמשים בדרך כלל להעברת גנים בתהליך התכנות מחדש.
- גורמי השעתוק המרכזיים המעורבים כוללים את Oct3/4, Sox2, Klf4 ו-c-myc.
- טכניקות של צביעה חיה מסייעות בזיהוי תאים שעברו תכנות מחדש בהצלחה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול יעיל ליצירת hiPSC מפיברובלסטים אנושיים.
- שימוש בווקטורים רטרו-ויראליים להחדרת גורמי שעתוק.
- זיהוי תאים שעברו תכנות מחדש באמצעות נוגדנים ספציפיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנסדוקציה של פיברובלסטים אנושיים באמצעות וקטורים רטרו-ויראליים.
- גידול של פיברובלסטים מזוהמים על תאי מאכל (feeder cells) עובריים של עכבר.
- צביעה של התרביות באמצעות נוגדן TRA-1-81 לזיהוי מושבות חיוביות.
- העברה של מושבות חיוביות לצלחות להתרחבות נוספת.
תוצאים עיקריים
- הושגה תכנות מחדש (reprogramming) מוצלח של פיברובלסטים ל-hiPSC.
- זיהוי המושבות שעברו תכנות מחדש אושש באמצעות צביעה.
- מושבות שהורחבו הראו מאפיינים של תאי גזע פלוריפוטנטיים.
- הפרוטוקול הדגים יעילות ביצירת hiPSC.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח יעיל לתכנות מחדש של תאי סומטיים אנושיים.
- וקטורים רטרו-ויראליים הם שיטה רלוונטית להחדרת גורמי שעתוק נחוצים.
- צביעה חיה היא טכניקה מהימנה לזיהוי תאים שעברו תכנות מחדש.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תכנות מחדש של תאים סומטיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים (hiPSC) מאפשר מידול של מחלות ותיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים של הגילוי. פרוטוקול זה תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי יצירת קווי תאים פלוריפוטנטיים ספציפיים למטופל לצורך בחינת מסלולים ביולוגיים. בידוד יעיל של מושבות והתרחבותן משפרים את רמת הוודאות החזויית בהערכת מטרות פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות פיברובלסטים המופקים מחולה שעברו תכנות מחדש למצב של פלוריפוטנציה.
- ערך תפעולי: מספק מקור מתחדש של תאים אנושיים המוגדרים גנטית למחקרי מעורבות מטרה (target engagement).
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות אפיון של סממני פלוריפוטנציה ופוטנציאלה דיפרנציאציה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: יצירת קווי hiPSC סטנדרטיים המתאימים לפיתוח בדיקות (assays) ולסריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: מאפשר ייצור בר-הרחבה של קווי תאים קלונאליים לקבלת תוצאות פנוטיפיות הניתנות לשחזור.
- מוכנות לבדיקה: מקל על הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של סריקה בשלבים הבאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך במעבר משלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית באמצעות מודלים של hiPSC הרלוונטיים למחלה.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר הערכה של מודולציית המטרה בהקשרים תאיים אנושיים לפני מחקרים in vivo.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר הערכה של השפעות on-target ומודולציה של מסלולים במערכות תואמות גנטית.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, מזיהוי המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולות המובילות, על ידי אספקת מודלים תאיים רלוונטיים לבני אדם הניתנים להרחבה.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בבדיקת היפותזות ובהבהרת מסלולים באמצעות hiPSC המופקים מפיברובלסטים של חולים וביקורות שעברו תכנות מחדש.
- סריקה: מספקת מושבות קלונליות מוכנות לבדיקה עם מורפולוגיה והבעת סמנים עקביים להערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של סממני פלוריפוטנציה ותוצרי דיפרנציאציה לצורך השוואת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לעבודות פרה-קליניות באמצעות הרחבה ואפיון של קווי hiPSC מבוססים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר ליצירת קווי תאים ספציפיים למחלה על פני מטרות ואינדיקציות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באמצעות יצירת תאים פלוריפוטנטיים עם ביטוי מסומנים מאומת (TRA-1-60, SSEA-4, Oct3/4, Sox2, Nanog).
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות שלבים מוגדרים של בחירת מושבות, בידוד והתרחבות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במחקרי תיקוף של מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון באמצעות מודלים תאיים אנושיים עם רקעים גנטיים מוגדרים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית תאי גזע, טרנסדוקציה ויראלית וטכניקות של אימונופלואורסצנציה.
- תלוי בייצור וקטור רטרו-ויראלי, ביעילות הטרנסדוקציה של פיברובלאסטים ובשמירה על תאי מאכילה (feeder cells).
- מצריך פרוטוקולים סטנדרטיים לבחירת מושבות, מעבר (passaging) ואנליזה של סמנים בין צוותים שונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת היישום על סוגי תאים שונים או מודלים של מחלות.
- מוגבל בשל הצורך בזיהוי קפדני של מושבות פלוריפוטנטיות אמיתיות בקרב תאים שעברו תכנות מחדש חלקי או זיהום של פיברובלאסטים.
