זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

ניסוי זה נועד למדידה ישירה של הפעילות ליצירת אצטט של אצטט קינאז. יש להתחיל את התגובה על ידי הוספת אנזים לתערובת תגובה המכילה אצטיל פוספט ומצעי DP. לאחר מכן, יש להוסיף הידרוקסילמין הידרוכלוריד כדי להמיר את האצטיל פוספט שנותר לאצטיל הידרוקסילאט.

הוסיפו תמיסת פיתוח כדי להמיר את ה-acetyl hydroxylate לקומפלקס ferric hydroxylate צבעוני שניתן למדידה. מדידה ספקטרופוטומטרית המבוססת על כמות סובסטרט ה-acetyl phosphate שנצרכה בתגובה מאפשרת קביעה של פרמטרים קינטיים של האנזים. יתרונה של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מבוססת על מדידה ישירה של צריכת acetyl phosphate, במקום צימוד של ייצור ATP להפחתה של ADP. מכיוון שבדיקה זו אינה מסתמכת על ייצור ATP, ניתן להשתמש בה עבור קבוצה חדשה של acetate kinases המייצרות pyrophosphate במקום ATP. עבור עקומת סטנדרט של שש עד שמונה נקודות, דללו את תמיסת המקור של acetyl phosphate ב-100 millimolar tris לנפח דגימה סופי של 300 µL; כללו גם דגימת ביקורת ללא acetyl phosphate. השתהו את כל הדגימות בבלוק חימום בטמפרטורה של 37 °C למשך דקה אחת.

כעת, הוסיפו 50 µL של hydroxylamine hydrochloride בריכוז 2 M, ערבבו על ידי ניעור שלוש פעמים והדגירו בבלוק חימום בטמפרטורה של 60 °C למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת פיתוח, ערבבו על ידי ניעור שלוש פעמים והמתינו לפיתוח הצבע למשך דקה אחת לפחות בטמפרטורת החדר. סובבו את הדגימות בצנטריפוגה תוך שימוש בקיובטות פלסטיק עבור הספקטרופוטומטר.

מדדו את הדגימות באורך גל של 540 nanometers. המשיכו ביצירת עקום סטנדרט של בליעה ב-540 nanometers אל מול מיקרומול של acetyl phosphate באמצעות תוכנה מתאימה לניתוח נתונים וגרפים. חשבו את ערך ה-r squared.

חלקו מנות של 300 µL מתערובת התגובה למבחנות מיקרו-צנטריפוגה. זכרו לכלול תגובת ביקור ללא אנזים והמתינו דקה להשגת שיווי משקל במבחנות בטמפרטורה של 37 °C. אם מבוצעות מספר תגובות, הוסיפו אנזים למבחנות במרווחי זמן ספציפיים והחזירו מיד כל מבחנה לבלוק חימום של 37 °C.

לאחר חמש דקות, הוסיפו 50 µL של hydroxy lamine hydrochloride בריכוז 2 M, ערבבו והדגירו למשך חמש דקות ב-60 °C. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת הפיתוח, ערבבו והניחו בטמפרטורת החדר לפיתוח הצבע. לאחר מכן, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-18,000 ×g למשך דקה אחת.

המשיכו למדידת הבליעה באורך גל של 540 ננומטרים. קבעו את כמות ה-acetyl phosphate הנוכחת באמצעות השוואה לעקומת הסטנדרט של acetyl phosphate. ניתן לשרטט את הנתונים ולהתאימם למשוואת McKayla Cementin לצורך קביעת פרמטרים קינטיים.

בדיקה זו קובעת את צריכת הסובסטרט acetyl phosphate כדי למדוד את פעילות ה-acetate kinase בכיוון של יצירת אצטט. acetyl phosphate שנותר לאחר זמן נתון במהלך התגובה האנזימטית הופך ל-acetyl Oxybate ולאחר מכן ל-ferric hydroxy ate complex, בעל צבע אדמדם שניתן למדוד ב-540 nanometers. לעקומת סטנדרט טיפית זו, המציגה absorbence ב-540 nanometers לעומת micromoles של acetyl phosphate, יש שיפוע של 1.2332 absorbence units ל-micromole של acetyl phosphate.

ערך ה-r squared שהתקבל, 0.99, מעיד על כך שהנתונים תואמים היטב למשוואה הליניארית כפי שמוצג כאן. ניתן להשתמש במדידה זו כדי לקבוע את ה-KM של אצטיל פוספט עבור תכשירי אנזים שונים. בריכוז של 5 millimolar של DP עם ריכוזים משתנים של אצטיל פוספט, acetate kinase רקומביננטי מטוהר מ-methanol Sarina thermophilic מראה קינטיקה סטנדרטית מסוג McKayla cementin עבור כל סובסטרט, מה שמוביל ל-KM נראה של 0.27 פלוס או מינוס 0.01 millimolar אצטיל פוספט.

בניגוד לבדיקה המצומדת הסטנדרטית, בדיקה ישירה זו יכולה למדוד פעילות של קינאזות אצטט המשתמשות בתסריטים שאינם TP. לדוגמה, בניצול של אצטיל פוספט על ידי קינאזת אצטט של *Entamoeba histolytica* המייצרת פירופוספט, סודיום פוספט הוחלף ב-DP בתערובת התגובה. העקומה שהתקבלה מעידה על ערך KM נראה של 0.50 פלוס או מינוס 0.006 millimolar של אצטיל פוספט. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן המדידה הישירה של פעילות קינאזת אצטט על ידי קביעת כמות אצטיל הפוספט שנצרכה.

גורם מרכזי להשגת תוצאות הניתנות לשחזור הוא שמירה על עקביות בכל שלב, במיוחד בהוספת האנזים ובשלב הערבוב.