Name: זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: למדו שיטה ישירה למדידת פעילות קינאז אצטט בכיוון יצירת האצטט באמצעות צריכת אצטיל פוספט. השיטה מאפשרת קביעת פרמטרים קינטיים אנזימטיים מדויקים ללא תלות בייצור ATP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הפרס NSF # 0920274 ודרום קרוליינה תחנת ניסוי פרויקט (SC-1700340) כדי KSS. נייר זה לא תרומה טכני 5929 של תחנת הניסיונות אוניברסיטת קלמסון.

התוכנית הכוללת של פרוטוקול זה הוא התווה באיור 1. 1. הפתרון הכנה Curves ואת מבחני תקן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 100 מ"ל של פתרון mol / L 2 של hydroxylamine-HCl. לשקול את 13.9 גרם של hydrochloride hydroxylamine (MW 69.49 g / mol) ו להתמוסס במים כ 50 מ"ל מזוקקים-deionized (DDH 2 O). התאם את ה-pH ל 7.0 באמצעות כדורי אשלגן הידרוקסידי או פתרון מרוכז. תביאו את נפח סופי 100 מ"ל. הפתרון יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר למשך עד 30 יום או 4 ° C עד 90 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 100 מ"ל של כלוריד וברזל / פתרון חומצה הידרוכלורית. לשקול את כלוריד 13.5 גרם וברזל (MW 270.32 g / mol) ו להמיס כ 50 מ"ל DDH 2 O. הוסף 41.3 מ"ל חומצה הידרוכלורית מרוכזת (12.1 mol / L) ומביאים נפח סופי של 100 מ"ל. הריכוז הסופי של כלוריד וברזל יהיה 0.5 mol / L ואת הריכוז הסופי של חומצה הידרוכלורית תהיה 5 mol/ ל ' הפתרון מאוחסן בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 100 מ"ל של פתרון mol / L 1.84 של חומצה trichoroacetic. לשקול את 30.0 גרם של חומצה Trichloroacetic (MW 163.39 g / mol), מתמוססים DDH 2 O ולהביא את נפח סופי 100 מ"ל. הפתרון מאוחסן בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מ"ל של פתרון mol / L 0.1 פוספט אצטיל. לשקול את פוספט 0.092 גרם אצטיל (MW 184.06 g / mol), מתמוססים DDH 2 O ולהביא את נפח הסופי מ"ל 5. הפתרון Aliquot לצינורות microcentrifuge (0.25 מ"ל לכל צינור) ולהקפיא ב -20 ° C עד השימוש. פתרון מופשר צריך להיות ממוקם על הקרח והוא יכול לשמש במשך שעה בערך 1. פתרון פוספט אצטיל כי הופשר לא צריך להיות refrozen מחדש בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מ"ל של פתרון mol / L 0.1 של ADP. לשקול את 0.24 גרם של ADP (MW 472.5 g / mol), מתמוססים DDH 2 O, ולהביא את נפח הסופי מ"ל 5. הפתרון Aliquot צינורות microcentrifuge (0.5 מ"ל לכל צינור) ולהקפיא ב -20 ° C עדהשימוש. שמור על פתרון מופשר על הקרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ"ל של פתרון mol / L 1 של טריס. לשקול את 6.06 גרם טריס (MW 121.14 g / mol), וכן להמיס 40 מ"ל DDH 2 O. התאם את ה-pH של התמיסה עד 7.0 באמצעות חומצה הידרוכלורית ולהביא בנפח 50 מ"ל הסופי. חנות פתרון בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ"ל של פתרון 1 mol / L מגנזיום כלוריד. לשקול את 2.03 גרם מגנזיום כלוריד (MW 203.31 g / mol), מתמוססים DDH 2 O, ולהביא בנפח 10 מ"ל הסופי. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 25 מ"ל פיתוח הפתרון על ידי ערבוב כמויות שוות של הפתרון כלור / חומצה הידרוכלורית וברזל והפתרון חומצה Trichloroacetic. פיתוח פתרון צריך להיות מוכן טרי כל יום לאחסן בטמפרטורת החדר. </li></ol> 2. הכנת עקומת פוספט אצטיל רגילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקומת אצטיל תקן פוספט נוצר באמצעות כמויות ידוע של פוספט אצטיל. עקומת סטנדרט של שישה עד בן שמונהנקודות לא מתאים. הסטנדרטים צריכים לנוע בין 0.03 ל 0.9 μmoles μmoles לכל 300 μL, אשר וקושרת לריכוזים הסופי של mmol 0.1-3 / ל ' לדלל את פוספט אצטיל מניות פתרון ריכוזי המתאים פתרון טריס 100 מ"מ נפח סופי של 300 μL. מדגם פקד ללא פוספט אצטיל צריך גם להיות מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל תקן ופיקוח על 37 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL הפתרון hydrochloride hydroxylamine לתקן כל שליטה ומערבבים על ידי ניעור שלוש פעמים. מניחים את תקן לתוך בלוק 60 בחום C ° ו דגירה במשך חמש דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של פתרון פיתוח הסטנדרטים ואת השליטה, מערבבים על ידי ניעור שלוש פעמים, צבע לאפשר לפתח במשך דקה אחת לפחות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל הסטנדרטים ואת השליטה microcentrifuge בבית XG 18,000 למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את דגימות spectrophotometricallyלא 540 ננומטר באמצעות 1mL cuvettes פלסטיק, באמצעות השלט כמו ריק עבור לספקטרופוטומטריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור עקומה סטנדרטית באמצעות ניתוח נתונים מתאימים תוכנה גרפים (למשל, תוכנה Kaleidagraph Synergy). R 2 ערכים של 0.99 או יותר רצויות. הנתונים להתוות כמו ספיגת ב 540 ננומטר לעומת μmoles ההווה פוספט אצטיל. </li></ol> 3. Assay עבור פעילות קינאז Acetate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פתרונות תיאר, להכין תערובת התגובה המכיל ריכוז סופי של 0.1 mol / L טריס חיץ, 10 mmol / L מגנזיום כלוריד, 5 mmol / L ADP, ו 2 mmol / L פוספט אצטיל. תגובה 10 מ"ל תערובת ידרוש 8.2 מ"ל DDH 2 O, 1.0 מ"ל פתרון טריס, 0.1 מ"ל מגנזיום כלוריד פתרון, פתרון 0.5 מ"ל ADP, ו 0.2 פתרון אצטיל מ"ל פוספט. הפץ את תערובת התגובה ב 300 aliquots μl לצינורות microcentrifuge. לקביעת פרמטרים קינטיים ואופטימיזציה של ריכוז המצע, אחד המצע יכול להיותמגוונים אחרים המוחזקים בריכוז קבוע התגובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום דגירה התגובות דקה 1 על 37 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כמות הרצוי של האנזים לתגובה ומיד להחזיר את הצינור כדי לחסום חום 37 מעלות צלזיוס. כמו כן כוללים תגובה שליטה אשר לא אנזים נוסף. אם מספר התגובות מבוצעות, להוסיף אנזים אל צינורות בזמנים קצובים. הקפידו לעקוב אחר פעם. (הערה: כמות אנזים לשמש צריך להיות מותאם על מנת להבטיח כי כל פוספט אצטיל או המצע ADP לא יהיה מדולדל - ראה סעיף דיון) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 5 דקות, להוסיף 50μl הפתרון hydrochloride hydroxylamine לתגובה כל הביקורת, לערבב, והמקום צינורות חום בלוק 60 מעלות צלזיוס. אם מספר התגובות הן מבוצעות, זה צריך להיעשות במרווח הזמן זהה אנזים נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובות והשליטה במשך 5 דקות על 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 &amp;mu: L הפתרון פיתוח לתגובה כל הביקורת, מערבבים, ומניחים מתלה צינור על הספסל המעבדה. אפשר צבע לפתח במשך דקה לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל צינורות microcentrifuge בבית XG 18,000 למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד דגימות spectrophotometrically ב 540 ננומטר באמצעות cuvettes פלסטיק 1mL ולקבוע את כמות להציג פוספט אצטיל בהשוואה עקומת פוספט אצטיל סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמות המצע פוספט אצטיל מדולדל יכול להיקבע על ידי הפחתת כמות פוספט אצטיל שנותר לאחר התגובה האנזימטית מהסכום של פוספט האנזים אצטיל נוכח הביקורת חסר. בצע ניתוח נתונים באמצעות נתונים מתאימים תוכנה גרפים (למשל, תוכנה Kaleidagraph Synergy). R 2 ערכים של יותר מ 0.97 רצויות. </li></ol> 4. נציג תוצאות: מטרת assay זה כדי למדוד פעילות קינאז אצטט את ישיריון של היווצרות אצטט. הדבר נעשה על ידי מדידת צריכת המצע פוספט אצטיל, שכן אין מדידה קל, ישיר לייצור אצטט. פוספט אצטיל שנותר לאחר זמן נתון במהלך התגובה האנזימטית מומר hydroxamate אצטיל ובהמשך לקומפלקס hydroxamate Ferric, בעלת צבע אדמדם (איור 2) שניתן למדוד ב 540 ננומטר. עקומת הסטנדרט זוממים ספיגת לעומת ההווה μmoles פוספט אצטיל בתקן משמש כדי לקבוע את כמות הפוספט אצטיל שנותרו התגובה לכל. עקומת תקן צריך להיות ליניארי דרך נקודת האפס. עקומת תקן נציג שמוצג באיור 3 יש מדרון של 1.2332 יחידות ספיגת לכל בהווה μmole פוספט אצטיל ואת ערך R 2 של 0.99, המציין את הנתונים מתאים למשוואה ליניארית היטב. המשוואה עבור להתאים ליניארי לנתונים עקומת הסטנדרטי הוא משמש לחישוב כמות של פוספט אצטיל שנותרו התגובה. Μmolesפוספט של אצטיל נצרך נקבעת כהפרש בין μmoles של פוספט אצטיל נוכח התגובה לשלוט חסר האנזים ואת μmoles של פוספט אצטיל שנותר לאחר התגובה האנזימטית. מטוהרים, רקומביננטי מ קינאז thermophila אצטט היה assayed באמצעות פרוטוקול המתואר. עבור הניסוי שמוצג באיור 4, ריכוז ADP שנערך קבוע בשעה 5 mmol / L ואת הריכוז של אצטיל פוספט בתגובת היתה מגוונת כדי לקבוע את מ K עבור פוספט אצטיל. כצפוי, הניסוי הזה מוכיח כי האנזים כדלקמן תקן מיכאליס-Menten כמו קינטיקה של המצע כל והפיק עקומת הרוויה היפרבולי כאשר זממו פעילות מול ריכוז פוספט אצטיל. הערך לכאורה K מ 'עבור פוספט אצטיל היה 0.27 ± 0.01 mmol / L, אשר משווה בחיוב את הערך שפורסם מ K של 0.47 ± 0.01 mmol / L באמצעות מצמידים כמולומר 13. Assay הישיר יכול לשמש גם כדי למדוד פעילות קינאז אצטט לנצל מצעים אחר מאשר ה-ATP, דבר שאינו אפשרי באמצעות assay מצמידים סטנדרטי. מטוהרים א רקומביננטי histolytica אצטט קינאז 16, אשר מייצר PP i במקום ה-ATP בכיוון אצטט להרכיב, היה נתון assay הזה באמצעות סודיום פוספט במקום ADP. הריכוז של נתרן פוספט בתגובה התקיים קבועה 0.2 mol / L ואת ריכוז פוספט אצטיל היתה מגוונת. באשר M. thermophila קינאז אצטט, E. קינאז histolytica אצטט בעקבות מיכאליס-Menten כמו קינטיקה של פוספט אצטיל ואת עקומת הרוויה היפרבולי נצפתה (איור 5). הערך לכאורה K מ 'עבור פוספט אצטיל היה 0.50 ± 0.006 mmol / L. ריבס גאתרי 15 נקבע ערך K m של 0.06 mmol / L עבור פוספט האנזים אצטיל עבור הילידים, איך פעם, אנזים שלהם היה רק ​​מטוהרים חלקית assay שלהם היו מעורבים ארבעה אנזימים צימוד שהיו גם מטוהרים באופן חלקי בלבד. לפיכך, קשה להשוות ישירות את הערכים הללו. פרוטוקול Scheme <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור עקומה אצטיל תקן פוספט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנזים מדולל לריכוז הרצוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את התערובת aliquot תגובה 300 μl לצינורות microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובות Preincubate על 37 מעלות צלזיוס למשך דקה 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל תגובות על ידי הוספת אנזים בזמנים קצובים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף hydroxylamine במרווחים אותו כדי לעצור את תגובות דגירה ב 60 ° C למשך 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כלור וברזל / פתרון חומצה Trichloroacetic לפיתוח צבע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב XG 18000 לרגע 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדד ספיגת ב 540 ננומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת כמות פוספט אצטיל הנצרכת על ידי השוואה עקומת סטנדרט </li></ol>tp_upload/3474/3474fig1.jpg "/&gt; 1. איור פרוטוקול Scheme <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> באיור 2. סטנדרטים פוספט אצטיל. הגדלת הריכוזים של פוספט אצטיל היו הגיב hydroxylamine וצבע פותחה כמתואר. השליטה חסר פוספט אצטיל הוא צהוב בהיר, ותגובות המכילות כמויות גדלות והולכות של פוספט הם אצטיל ברציפות כהה בצבעו. שינוי צבע זו נמדד ב 540 ננומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3"> באיור 3. פוספט אצטיל לדוגמא עקומת סטנדרטי. כמויות משתנות של פוספט אצטיל היו הגיב hydroxylamine ופיתוח צבע פתרון ספיגת נמדדה ב 540 ננומטר. ספיגת ב 540 ננומטר לעומת פוספט μmoles אצטיל היה זממו התאמה ליניארית לנתונים יושמה. &lt;/ P&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 4"> איור 4. ניצול פוספט אצטיל ידי ATP לייצור מ thermophila קינאז אצטט. הפעילות האנזימטית נקבע לכיוון היווצרות אצטט בנוכחות 5 mmol / L ADP עם ריכוזים שונים של פוספט אצטיל. כמות הנצרכת פוספט אצטיל נקבע על פי ההפרש בין הסכום ההתחלתי של פוספט אצטיל התגובה וכמות פוספט אצטיל שנותר לאחר התגובה האנזימטית. מבחני בוצעו בשלושה עותקים במוטות השגיאה המוצגת. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 5"> איור 5. ניצול פוספט אצטיל על ידי i-PP לייצר E. histolytica קינאז אצטט. הפעילות האנזימטית לכיוון היווצרות אצטט נקבע בנוכחות 0.2 mol / L נתרן זרחתי עם ריכוזים שונים של פוספט אצטיל. כמות הנצרכת פוספט אצטיל נקבע על פי ההפרש בין הסכום ההתחלתי של פוספט אצטיל התגובה וכמות פוספט אצטיל שנותר לאחר התגובה האנזימטית. מבחני בוצעו בשלושה עותקים במוטות השגיאה המוצגת.

<ol><li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins%2C+sugar+kinases%2C+actin%2C+and+hsp70+heat+shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).</li>
<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+evolution+of+similar+enzymatic+function+on+different+protein+folds%3A+the+hexokinase%2C+ribokinase%2C+and+galactokinase+families+of+sugar+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases.</a> Protein Sci. 2, 31-40 (1993).</li>
<li>Buss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urkinase%3A+structure+of+acetate+kinase%2C+a+member+of+the+ASKHA+superfamily+of+phosphotransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases.</a> J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).</li>
<li>Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sugar+kinase%2Fheat+shock+protein+70%2Factin+superfamily%3A+implications+of+conserved+structure+for+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).</li>
<li>Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+ATP-binding+fold+in+actin%2C+hexokinase+and+Hsc70%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70.</a> Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).</li>
<li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetate+kinase%3A+not+just+a+bacterial+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Acetate kinase: not just a bacterial enzyme.</a> Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).</li>
<li>Aceti, D. J., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+acetate+kinase+from+acetate-grown+Methanosarcina+thermophila.+Evidence+for+regulation+of+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis.</a> J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).</li>
<li>Latimer, M. T., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+sequence+analysis%2C+and+hyperexpression+of+the+genes+encoding+phosphotransacetylase+and+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).</li>
<li>Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+histidines+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).</li>
<li>Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutational+analysis+of+active+site+residues+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).</li>
<li>Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+transition+state+analog%2C+MgADP-aluminum+fluoride-acetate%2C+in+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).</li>
<li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li>
<li>Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+kinetic+analyses+of+arginine+residues+in+the+active+site+of+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).</li>
<li>Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase+mechanism+by+fluorescence+quenching%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching.</a> Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).</li>
<li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetate+kinase+%28pyrophosphate%29.+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li>
<li>Fowler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+and+structural+characterization+of+the+novel+PPi-dependent+acetate+kinase+from+the+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica.</a> , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lipmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+synthesis+of+acetyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic synthesis of acetyl phosphate.</a> J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).</li>
<li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).</li>
<li>Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+ATP-CoA-acetate+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol.+Suppl%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction.</a> J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).</li>
<li>Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+phosphorylation+of+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic phosphorylation of acetate.</a> J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).</li>
<li>Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+enzymes+involved+in+the+proponic+acid+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation.</a> Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).</li>
<li>Clarke, P. M., Payton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+assay+for+acetate+in+spent+bacterial+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants.</a> Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).</li>
<li>Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+assay+of+acetate+kinase+activity%3A+measurement+of+inorganic+phosphate+release+generated+by+hydroxylaminolysis+of+acetyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate.</a> Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).</li>
<li>Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+acetate+kinase+from+Bacillus+stearothermophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus.</a> J. Biochem. 84, 193-203 (1978).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הגילוי של פוספט אצטיל ב assay זה תלוי בריכוז מספיק hydrochloride hydroxylamine ואת ריכוז החומציות של התמיסה כלורי וברזל. שינוי של נפח assay ידרוש בדיקה מחודשת של שני רכיבים אלה. תגובות אנזימטיות המתואר כאן בוצעו על 37 מעלות צלזיוס עם סיום hydroxylamine שבוצעה ב 60 ° C במשך 5 דקות. זו טמפרטורה גבוהה היא קריטית כדי לאפשר המרה מהירה של פוספט אצטיל הנותרים hydroxamate אצטיל. העיתוי של הצעד פיתוח צבע ומדידה של ספיגת הוא קריטי פחות, יכול להתבצע תוך פחות מ 5 דקות עד 15 דקות לאחר תוספת של...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td width="160"> שם מגיב </td><td width="108"> חברה </td><td width="134"> מספר קטלוגי </td><td width="103"> תגובות </td></tr><tr><td> אצטיל פוספט </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 01409 </td><td> ליתיום מלח (97%) </td></tr><tr><td> סודיום פוספט monobasic (מייבשים) </td><td> ThermoFisher </td><td> S381 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום פוספט dibasic (anhydrous) </td><td> ThermoFisher </td><td> S374 </td><td></td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד (hexahydrate) </td><td> ThermoFisher </td><td> M33 </td><td></td></tr><tr><td> מאגר טריס </td><td> ThermoFisher </td><td> B152 </td><td></td></tr><tr><td> כלוריד Ferric (hexahydrate) </td><td> ThermoFisher </td><td> I88 </td><td></td></tr><tr><td> Trichloroacetic חומצה </td><td> ThermoFisher </td><td> A324 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylamine hydrochloride </td><td> ThermoFisher </td><td> H330 </td><td></td></tr><tr><td> אדנוזין 5&#39;-diphosphate מלח נתרן </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> A2754 </td><td></td></tr><tr><td> Biomate III ספקטרופוטומטר </td><td> ThermoFisher </td><td> 142982082 </td><td> ספקטרופוטומטר תקן UV / Vis </td></tr></table>

זיהוי ישיר של פעילות acetate יוצרי של קינאז acetate אנזימים

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

קינאז Acetate, חבר אצטט ו-kinase Hsp70-אקטין סוכר (ASKHA) אנזים superfamily 1-5, אחראי זירחון הפיך של אצטט כדי פוספט אצטיל ניצול ATP כמו המצע. קינאזות Acetate חיידקים נמצאים בכל מקום, נמצא סוג אחד של קדומים, והם נוכחים גם חיידקים של Eukarya 6. קינאז אצטט ביותר מאופיין גם הוא מן מתאן לייצור archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. קינאז אצטט אשר יכול לנצל רק PP i-ATP, אך לא בכיוון אצטיל פוספט יוצרי כבר מבודד Entamoeba histolytica, הסוכן סיבתי של דיזנטריה אמבית, ויש לו עד כה נמצאו רק 15,16 הסוג הזה. בכיוון של היווצרות אצטיל פוספט, פעילות קינאז אצטט נמדדת בדרך כלל באמצעות assay hydroxamate, שתוארה לראשונה על ידי ליפמן17-20, assay מצמידים שבו ההמרה של ה-ATP ל ADP היא מצמידים את החמצון של NADH ל NAD + ע&quot;י קינאז האנזימים pyruvate ו לקטט דהידרוגנז 21,22, או מדידה assay שחרורו של פוספטים אנאורגניים אחרי התגובה של המוצר פוספט אצטיל עם hydroxylamine 23. פעילות ההיפך, אצטט יוצרי כיוון נמדד על ידי צימוד היווצרות ATP מ - ADP לצמצום NADP + ל NADPH ידי hexokinase האנזימים וגלוקוז 6 פוספט דהידרוגנז 24. כאן אנו מתארים שיטה לגילוי של פעילות קינאז אצטט לכיוון היווצרות אצטט שאינו דורש צימוד אנזימים, אך הוא מבוסס על נחישות במקום ישירה של צריכת פוספט אצטיל. לאחר התגובה האנזימטית, פוספט אצטיל הנותרים מומר קומפלקס hydroxamate וברזל כי ניתן למדוד spectrophotometrically, כמו assay hydroxamate. לכן, בניגוד רחובassay מצמידים אנדאר עבור בכיוון הזה תלויה ייצור ATP מ - ADP, assay הזה ישיר יכול לשמש קינאזות אצטט המייצרים ATP או PP אני.

שיטה להגדרה של פעילות קינאז אצטט מתואר. Assay זה מנצל תגובה ישירה לקביעת פעילות האנזים ועל קינטיקה של קינאז אצטט בכיוון אצטט יוצרי עם acceptors phosphoryl שונים. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מנוצל עבור assaying פוספט אצטיל אחרים או אצטיל-CoA אנזימים ניצול.

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

אצטט קינאז (Acetate kinase), חבר במשפחת העל של אנזימי ה-acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA)1-5, אחראי על הפספורילציה ההפיכה של ...

ניסוי זה נועד למדידה ישירה של הפעילות ליצירת אצטט של אצטט קינאז. יש להתחיל את התגובה על ידי הוספת אנזים לתערובת תגובה המכילה אצטיל פוספט ומצעי DP. לאחר מכן, יש להוסיף הידרוקסילאמין הידרוכלוריד כדי להמיר את האצטיל פוספט שנותר לאצטיל הידרוקסילאט.הוסיפו תמיסת פיתוח כדי להמיר את ה-acetyl hydroxylate לקומפלקס ferric hydroxylate צבעוני שניתן למדוד באופן ספקטרופוטומטרי. התוצאות, המבוססות על כמות מצע ה-acetyl phosphate שנצרך בתגובה, מאפשרות קביעה של פרמטרים קינטיים של האנזים. היתרון של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מבוססת על מדידה ישירה של צריכת acetyl phosphate, במקום צימוד של ייצור ATP להרדוקציה של ADP. מכיוון שבדיקה זו אינה מסתמכת על ייצור ATP, ניתן להשתמש בה עבור קבוצה חדשה של acetate kinases, המייצרות pyrophosphate במקום ATP. עבור עקום סטנדרט בן שש עד שמונה נקודות, דללו את תמיסת המקור של acetyl phosphate ב-100 millimolar tris לנפח דגימה סופי של 300 µL; כללו גם דגימת ביקורת ללא acetyl phosphate. השביחו את כל הדגימות בבלוק חימום בטמפרטורה של 37 °C למשך דקה אחת.כעת, הוסיפו 50 µL של hydroxy lamine hydrochloride בריכוז 2 M, ערבבו על ידי ניעור שלוש פעמים והדגירו בבלוק חימום בטמפרטורה של 60 °C למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת פיתוח, ערבבו על ידי ניעור שלוש פעמים ואפשר

direct-detection-acetate-forming-activity-enzyme-acetate

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הנדרשים לביצוע בדיקות דה-אצטילציה במבחנה וב-vivo על מנת לבסס את תפקידם של חלבונים כמצעי דה-אצטילציה ספציפיים עבור סירטואינים ולחקור עוד יותר את תפקידו של הפיך - אצטילציה של ליזין כשינוי לאחר תרגום.

Deacetylation מבחנים כדי לפענח את יחסי הגומלין בין סירטואינים (SIRT2) ו-מצעי חלבון מסוימים

עבודה זו מציגה שיטה לסריקת תפוקה גבוהה באמצעות מערכת סינון אנזימים גנטית אוניברסלית שניתן ליישם באופן תיאורטי על למעלה מ-200 אנזימים. כאן, מערכת הסינון היחידה מזהה שלושה אנזימים שונים (ליפאז, צלולאז ופוספטאז אלקליין) פשוט על ידי שינוי הסובסטרט המשמש (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ופניל פוספט).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לכימות פעילות ATPase במבחנה. ניתן לבצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה על סמך רמת הפעילות והדרישות עבור ATPase מטוהר נתון.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

כאן, אנו מתארים את ההכנה והשימוש תחקיר מבוססי פעילות (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] carbamate) המאפשר איתור וכימות של צורה פעילה של amidase החומצה המעודד דלקת אנזים N -acylethanolamine (NAAA), הוא במבחנת vivo לשעבר.

הכנה<em&gt; In vivo</em&gt; השתמש של Probe פעילות מבוססת עבור<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine חומצה Amidase

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

הרחבת הקוד הגנטי מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל חלבון acetylation. כאן אנחנו מדגימים פרוטוקול נתיישב לנצל בטכניקה זו ליצירת homogeneously acetylated חלבונים באתרים ספציפיים בתאים Escherichia coli .

פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים Site-Specifically Acetylated Escherichia Coli

המטרה של פרוטוקול זה היא תווית להעשיר, לזהות סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תא lysate או homogenate הרקמה. שיטה זו ממנפת את ההיבטים הייחודיים של הביולוגיה CK2 למטרה זו.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

מוצג כאן מבחן פלואורסצנטי רגיש לניטור פעילות אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז באמצעות פפטיד דיאצילגליצריל ואלקין-פוספוליפידים כמצעים עם כימיה של קליקים.

בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה

במאמר זה מוצגות שיטות אקוטוקסיקולוגיות סטנדרטיות להערכת סמנים ביולוגיים במינים ניאוטרופיים של אנורן. באופן ספציפי, מאמר זה מפרט מספר מתודולוגיות בקני מידה שונים של הערכה אקוטוקסיקולוגית, כגון הרמה הגנטית, ההיסטולוגית-תאית, הביוכימית, המורפולוגית והאינדיבידואלית.

מתודולוגיות אקוטוקסיקולוגיות להערכת סמנים ביולוגיים בקני מידה שונים באנורנים ניאוטרופיים

בדיקות כימיות מהירות ומדויקות לסינון מעכבים ספציפיים הן כלי חשוב בארסנל פיתוח התרופות. כאן, אנו מציגים בדיקה כימית מדרגית של קליק אצטיל-קליק כדי למדוד את העיכוב של פעילות אצטילציה HAT1.

בדיקת כימיה של צטיל קליק למדידת אצטילטרנספראז היסטון 1 אצטילציה

למדו שיטה ישירה למדידת פעילות קינאז אצטט בכיוון יצירת האצטט באמצעות צריכת אצטיל פוספט. השיטה מאפשרת קביעת פרמטרים קינטיים אנזימטיים מדויקים ללא תלות בייצור ATP.

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

גלה סרטונים נוספים