הנפתח של calmodulin מחייב חלבונים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבדוק חלבונים הנקשרים ל-Cal Modlin באופן תלוי בסידן. זה מושג על ידי איסוף חלבונים מעניינים. לאחר מכן, מכינים את מהירויות הסרו של קלמודולין לקשירת חלבון.

לאחר מכן החלבונים מודגרים במהירויות סרו קלמודולין. לבסוף, נרמזים החלבונים הנקשרים באופן תלוי בסידן. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות חלבונים הנקשרים לקלמודולין בנוכחות או היעדר סידן באמצעות ניתוח דם מערבי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון כרומטוגרפיה רגועה ומשקעים חיסוניים, הוא שהיא דורשת פחות חלבון ופחות זמן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האיתות של מודלין פרה, כגון אילו חלבונים נקשרים למודלין פרה באופן תלוי סידן, וכיצד שינויים לאחר התרגום יכולים להשפיע על קשירתם למודלין פרה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי טיפול בחרוזים חיוניים וקשה לעקוב אחר תיאור החידוש והשמירה של החרוזים מבלי לראות אותו.

כדי להכין רקמה להומוגנית יש להזריק פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות עם נגיף המכיל פלסמיד המבטא את החלבון הרקומביננטי המעניין. בדוגמה זו, החלבון הרקומביננטי מתויג GFP Neuro Grandin. אפשר לרקמה לבטא את החלבון למשך הלילה כ-12 עד 18 שעות לאחר הזרקת הנגיף, הוסף מיליליטר אחד של מאגר דיסקציה לצלחת פטרי.

העבירו את הרקמה המתורבתת עם התוספת לצלחת הפטרי והוסיפו שני מיליליטר של חיץ דיסקציה לתוספת כדי להטביע את הרקמה באמצעות אזמל. אסוף חמש עד 10 פרוסות רקמת היפוקמפוס אורגנוטיפיות על ידי גירוד עדין של הרקמה החופשית מקרום ההכנסה בעזרת פיפטת מרעה הפוכה. העבירו את הרקמה התלויה לצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב-1500 RCF למשך דקה אחת. כדי להפריד את הרקמה ממאגר הדיסקציה, הסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע לגלולה.

עבור כל פרוסה בשימוש, הוסף את הרקמה ל-30 עד 60 מיקרוליטר של מאגר הומוגניזציה עם פיפטה של מיליליטר אחד עם קצה חתוך, ולאחר מכן הומוגניזציה ביסודיות באמצעות עלי לפני החזרת ההומוגנט לצינור המקורי שלו. על מנת להסיר פסולת תאית, צנטריפוגה את ההומוגנאט הנותר ב-1100 RCF למשך 10 דקות ואסוף בזהירות את ה-snat על ידי שאיפה תוך הימנעות מזיהום מהגלולה. ציטט 10% מהסופרנטנט כמדגם של הקלט.

אחסן את הסופרנטנט הנותר על קרח במהלך הכנת חרוזי הקל סרו לשימוש. מאוחר יותר, עבור כל פיפטה מושכת למטה 400 מיקרוליטר של קל מרחף Modlin Sero מהיר לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר עם תחתית שטוחה יחסית כדי למקסם את שטח הפנים ואת האינטראקציה של התמיסות עם החרוזים במהלך הדגירה, לסובב את צינור המיקרו צנטריפוגה על צדו כדי להרטיב את החרוזים, ולאחר מכן לצנטריפוגה את החרוזים ב-21, 000. RCF למשך 30 שניות.

והסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע לחרוזים כדי לשטוף את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של מאגר ההומוגניזציה המתאים המכיל שני מילי-מולרי סידן כלורי לחרוזים המשמשים למשיכת חלבונים קושרי סידן קלורית מודלין. או שני מילי-מולארי E-D-T-A-A הידוע בסידן כלאטור לחרוזים המשמשים למשיכת חלבונים קושרים מודלין אפו-קל.

הקש בעדינות על הצינור כדי לרסוס. השעו את החרוזים והצנטריפוגה ב 1500 RCF למשך דקה אחת. הסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי שאיפה, הקפד לא להפריע לחרוזים כדי לקשור חלבונים לספרוס קלמודולין למשיכה כלפי מטה.

התחל בפיצול ה- SNAT לשני נפחים שווים. בהתאם למצב לכל מצטער, הוסף את הכמות המתאימה של סידן כלורי או EDTA לסופרנט לריכוז סופי של שתי מילימולר. הוסף את הסופרנטנט לחרוזים השטופים במאגר ההומוגניזציה המתאים.

הקש בעדינות על הצינור כדי לערבב. דגרו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות על שייקר. אנו משהים את החרוזים כל 30 דקות בערך כדי להגביר את יעילות הכריכה.

לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב-1500 RC F למשך שלוש דקות. הסר 50 מיקרוליטר של סופרנטנט כדגימה של חלבון לא קשור והסר בזהירות את החטף שנותר על ידי שאיפה והשליך. שוטפים את החרוזים שלוש פעמים כמו קודם עם 100 מיקרוליטר ממאגר ההומוגניזציה המתאים.

השלב הקשה ביותר בהליך זה הוא האלוציאן של חלבוני המטרה בצורה יעילה. הדרך הטובה ביותר להבטיח הצלחה היא להשתמש בסוג הצינור הנכון כדי למזער את אובדן החרוזים ולהשעות מחדש כראוי את החרוזים בהתחממות חיץ הפליטה. מאגר הפליטה מראש יכול גם לעזור באופן משמעותי להוציא את החלבון ב-50 מיקרוליטר של חיץ אלוציאני לחרוזים.

דגימות שעברו הומוגניות ונקשרו במאגר המכיל סידן נרמזות במאגר המכיל EDTA ודגימות שהיו להן מאגר המכיל EDTA נרמזות עם סידן. דגרו את החרוזים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר. מערבבים את החרוזים על ידי הקשה עדינה על הצינור בערך כל חמש דקות.

צנטריפוגה את החרוזים ב-1500 RCF למשך שלוש דקות והסר בזהירות את 50 המיקרוליטרים של SNAT עבור דגימת החלבון הקשור על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע לחרוזים. בצע דף SDS וכתמים מערביים כדי לזהות את החלבון המעניין כבקרה חיובית במצב ההפוך.

חלבון Prop Pro ידוע כקושר Cal Modlin. איור זה מציג דוגמה לבדיקת Cal Modlin הבודקת קשירת Cal MODLIN של GFP TAG Neuro Grandin בהשוואה לנוירו-גרנדין אנדוגני. הקלט ההומוגני מראה כי GFP neuro Grandin התבטא בנוסף לנוירו-גרנדין אנדוגני וסידן קלמודולין תלוי קינאז שניים כצפוי בהתבסס על הקישור הידוע של נוירו-גרנדין אנדוגני.

GFP שתויג Neuro Grandin נרמז בהיעדר סידן ולא נקשר בנוכחות סידן. לעומת זאת, קינאז הביקורת התלוי בסידן קלמודולין 2 נרמז רק בנוכחות סידן ולא היה קשור בהיעדרו. זה מראה שחרוזי הקלמודולין תפקדו כראוי וה-EEU היו יעילים.

והכי חשוב, זה מראה שהחיוך העצבי של GFP נקשר ל-Apoch Cal Modlin באופן דומה לצורה האנדוגנית, מה שמרמז על כך שתג ה-GFP לא שינה את התפקוד של חלבון רקומביננטי. לאחר שליטה בטכניקה זו, לא כולל דף SDS וניתוח דם מערבי ניתן לסיים תוך שש שעות כאשר נעשה כראוי בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתייג את כל הדגימות והצינורות למצב המתאים מכיוון שכל שינוי בריכוז הסידן עלול לסכן את הניסוי כולו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע ביעילות את יכולתם של חלבונים מסוימים לקשור מודול CAL באופן תלוי בסידן.

על ידי איסוף החלבונים המעניינים, דגירה שלהם עם מהירויות ה-SRO המוכנות כראוי, התחמקות מהחלבונים הקשורים ובדיקתם באמצעות ניתוח דם מערבי.