Name: הנפתח של calmodulin מחייב חלבונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: חקור את אינטראקציות החלבון של קלמודולין בדרך תלוית סידן באמצעות שיטת pull-down. טכניקה זו מאפשרת זיהוי יעיל של חלבונים המקשרים לקלמודולין ומספקת תובנות לגבי מסלולי אותות תאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות טיפאני שרי עזרתה אופטימיזציה בפרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי להזדקנות (AG032320), כמו גם קידום ויסקונסין בריא.

עיין באיור 1 עבור סכמטית בסיסית של תחילת ההליך עם homogenate. זמן משוער של הכנת תמציות הסלולר elution של רמ"א הנכנס חלבונים הוא כ 6-7 שעות. 1. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פרוסות בהיפוקמפוס organotypic בווירוס המכיל פלסמיד ביטוי חלבון רקומביננטי של עניין (בדוגמה זו, ירוק ניאון (GFP), מתויג חלבון נג) ולאפשר רקמות לבטא חלבון לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 12 עד 18 שעות לאחר ההזרקה ויראלי (תלוי בזמן ביטוי ויראלי), להכין לאסוף את הרקמה. הוסף חוצץ לנתיחה 1mL (גלוקוז 10 מ"מ, 4 מ"מ KCl, NaHCO3 26mM, סוכרוז 233mM, MgCl 5mm 2, 1mm CaCl 2, ו - 0.1% פנול אדום, בגז עם 5% CO 2 95% O 2) על צלחת פטרי. העברת רקמה להכניס תרבותי / צלחת פטרי ולהוסיף למאגר לנתיחה 2ml להכניס את להטביע את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקולקטיביתלא רקמה בהיפוקמפוס organotypic (בין 5 ל 10 פרוסות) על ידי מגרד בעדינות ברקמה חופשית של הממברנה להכניס באמצעות אזמל. באופן ספציפי בהסרת אזור מסוים של עניין (למשל CA1) היא גם אופציה. העברת רקמה מושעה לצינור microcentrifuge 1.5mL באמצעות הפוכה פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות RCF 1500 דקות 1 להפריד רקמה למאגר לנתיחה. הסר בזהירות את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כל פרוסה בשימוש, להוסיף 30-60 μL של חיץ homogenization (NaCl 150mm, 20mm טריס pH 7.5, 1mm DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antipain, pepstatin 1μg/mL, ו -1% טריטון X -100) לרקמות ו homogenize ביסודיות עם העלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להסיר שאריות הסלולר, בצנטריפוגה homogenate הנותרים בבית RCF 1100 עבור 10 דקות ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה, תוך הימנעות מזיהום של גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו 10% supernatant כפי מדגם של הקלט (לדוגמה 1). חנות supernatant הנותרים על הקרח במהלך תקופת ההכנה של Cam-sepharose חרוזים לשימוש בשלב 3. </li></ol> הערה: רקמה משמש כאן פרוסות בהיפוקמפוס organotypic. עם זאת, אפשר להשתמש בנוירונים ניתק או כל מערכת אחרת culturing התא. במקרה כזה, להתחיל בשלב 1.4 לאחר איסוף רקמת שלך באופן הולם. 2. הכנת חרוזי עבור הנפתח בטיפול חרוזים, חשוב להציל את החרוזים למקסם את היעילות של התגובות ידי מניעת חרוזים מהתייבשות על דפנות הצינור. כדי לעשות זאת, עדיף לסובב הצינורות שלך בצד שלהם, מה שמאפשר פתרון להרטיב את החרוזים על קירות של הצינור, מיד לפני צנטריפוגה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל הנפתח, פיפטה 400 μL של calmodulin-Sepharose חרוזים מושעה לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל עם יחסית flat-התחתונה על מנת למקסם את שטח הפנים ואת האינטראקציה של פתרונות שלך עם חרוזים במהלך incubations שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוזים ב RCF 21,000 למשך 30 שניות ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשטוף את חרוזים, להוסיף 100 μL של למאגר homogenization בהתאמה המכיל גם 2 מ"מ CaCl 2 לאלה בשימוש הנפתח Ca 2 +-CAM חלבונים מחייב 2 mM EDTA (א chelator ידוע Ca 2 +) עבור חרוזים והורידה ApoCaM חלבונים מחייב. לטפוח בעדינות את הצינור מחדש להשעות חרוזים צנטריפוגות ב RCF 1500 דקות 1. הסר בזהירות את supernatant על ידי שאיפה, מוודא שלא להפריע את החרוזים. </li></ol> הערה: כל השלבים השאיפה, מומלץ להשתמש קצה פיפטה שיש לו פתיחה נאה (למשל טעינת טיפים ג'ל) כדי לאפשר הסרה של פתרון מבלי להסיר חרוזים. 3. Cam-sepharose מחייב של חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול supernatant שלך לתוך שני תנאים המכיל נפח שווה. בהתאם למצבך, להוסיף את הכמות המתאימה של CaCl 2 או EDTA עד כדי supernatant שלך ריכוז 2 מ"מ כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף supernatant משלב 1.7 כדי לרחוץ במאגר חרוזים homogenization המקביל. לטפוח בעדינות את הצינור לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות על שייקר. Re-להשעות חרוזים כל 30 דקות בערך כדי להגביר את היעילות של הכריכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור צנטריפוגה המכילה דגימות וחרוזים ב RCF 1500 דקות 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 50μL של supernatant כמדגם של חלבון מאוגד (מדגם 2) ו בזהירות להסיר את supernatant הנותרים על ידי שאיפה וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים שלוש פעמים כמתואר צעד 2.3 באמצעות 100μL של חיץ homogenization בהתאמה. </li></ol> 4. Elution <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μL של חיץ elution (50mm טריס-HCl pH 7.5, ו 150mm NaCl) המכיל את המצב ההפוך (10mm CACL 2 או 10mm EDTA) על חרוזים. לדוגמה, דגימות שהיו הומוגני וכרוך במאגר המכיל Ca 2 + הם eluted במאגר elution המכיל EDTA ולהיפך. </li></ol> אופציונלי: התחממות החיץ elution עד 37 ° C לפני הוספת חרוזים עשוי לשפר את התשואה. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פתרון עם חרוזים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר. מערבבים בעדינות את החרוזים על ידי הקשה על הצינור על כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוזים ב RCF 1500 דקות 3 ובזהירות להסיר את 50μL של supernatant לחלבון כבול (מדגם 3) על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ טעינת חלבון לכל דגימות (כלומר, homogenate מאוגד וכרוך חלבון, כמו גם אלה עדיין קשורות עם חרוזים). </li></ol> הערה: כדי למקסם את elution (במיוחד במקרה של elution לא יעיל), להוסיף 50μL של למאגר elution המתאים (למשל הוספת buf המכיל EDTAfer כדי חרוזים כבול CaCl 2) על חרוזים לפני החימום דגימות כדי לסייע elute כל חלבון חייב הנותרים וחזור על שלבים המתוארים 4.3 להסיר חלבונים מחויב הנותרים. 5. SDS-PAGE ומערב כתם התנהגות SDS-PAGE ולנתח באמצעות כתם המערבי על ידי חיטוט לחלבון שלך עניין בדיקה של חלבון ידוע להיקשר CAM במצב ההפוך כביקורת חיובית. 6. נציג תוצאות איור 2B מראה דוגמה של assay-CAM הנפתח בדיקה מחייב CAM של NG-GFP מתויג לעומת נג אנדוגני. כדי לעשות זאת, GFP-נג היה ביטוי יתר של פרוסות בהיפוקמפוס organotypic שלנו לילה ואת רקמת היה הומוגני. Homogenate הודגר עם קאם-sepharose חרוזים בנוכחות או Ca 2 + או EDTA. הקלט Homogenate מראה כי ה-GFP-נג התבטא בנוסף נג אנדוגני Ca 2 + / CAM תלויי קינאז II(CaMKII). כצפוי מבוסס על הכריכה הידועה של נג אנדוגני (מאויר איור 2A)., GFP-tagged נג היה eluted בהעדר Ca 2 + (חלבון EDTA כבול) ו מאוגד בנוכחות Ca 2 + (איור 2B) . לעומת זאת, השליטה, CaMKII, היה eluted רק בנוכחות Ca 2 + (חלבון קשור) היה מאוגד בהעדרה (EDTA). זה מראה את החרוזים CAM תיפקדו כראוי elutions היו יעילים. והכי חשוב, זה מראה כי ה-GFP-נג נקשר ApoCaM באופן דומה לטופס אנדוגני, טוען כי את תג ה-GFP לא לשנות את הפונקציה של חלבון רקומביננטי שלנו. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> 1. באיור המתאר של CAM הנפתח assay (א) homogenate רקמות הוא הסתובב כלפי מטה כדי להסיר הפסולת התאית. כ -10% supernatant הוא נלקח מדגם של הקלט (1). Supernatant הנותר מתחלק שווה בשווה עבור שונההתנאים ואת ריאגנטים המתאימים (CaCl 2 או EDTA) מתווספים מבחן מחייב בתנאים אלה. כל supernatant (המכיל גם CaCl 2 או EDTA) נטען על גבי Cam-sepharose חרוזים מוכן בהתאמה ו (ב) מודגרות לאפשר מחייב. חלבונים מאוגד מוסרים (2) ו - (ג) את החלבונים כבול (3) הם eluted off של חרוזים באמצעות חיץ elution (EB) המכיל את המצב ההפוך כאשר מחייב. הרכב החלבונים של שלושת דגימות חלבון ניתן לנתח באמצעות SDS-PAGE וניתוח המערבי כתם. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> 2. איור א ') סכמטי של Ca 2 + תלויות מחייב CAM ו elution ב הנפתח דוגמאות assay מקבלים שני סוגי חלבון אשר נקלטות קאם Ca 2 + תלויות בדרך. Neurogranin (נג) מייצג חלבונים הנקשרים apo-CAM ו CaMKII מייצג חלבונים אשר נקלטות על ידי Ca 2 + עשירCAM. CAM מוצג במצב שלה ניתק לפני הדגירה עם חלבונים homogenate. מודגרות לאחר בתנאי גבוה Ca 2 + ריכוזים (2 מ"מ) או בנוכחות Ca 2 + chelator, EDTA (2 מ"מ), חלבונים יהיה לאגד CAM בהתאם. נג נקשר CAM במצב EDTA כפי שיש לא מעט Ca 2 + בהווה, יהיה eluted את Cam-sepharose חרוזים בנוכחות Ca 2 +. CaMKII, לעומת זאת, היה לאגד CAM בנוכחות כמויות גבוהות של Ca 2 + והיה לנתק פעם + 2 Ca היה chelated. ב) תוצאות של CAM למשל הנפתח assay. נתון זה מדגים את התוצאה הסופית הצפויה של Cam-sepharose לנתץ עם דגימות נחקר במשך נג ו CaMKII. הן נג אנדוגני ו-GFP נג נמצאים בסמטאות של חלבונים חייב CAM בנוכחות EDTA. נג לא קשור כאשר דגימות מודגרת עם קאם בנוכחות Ca 2 +, הוכחת כי Nגרם בלבד נקשר apo-CAM. בקרה חיובית שלנו, CaMKII, מצד שני, נקשר CAM רק בנוכחות Ca 2 +.

<ol><li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+West+Pharmacol+Soc%22%5BJournal%5D)">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li>
<li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li>
<li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li>
<li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin%2C+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li>
<li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+%28RC3+protein%2C+neurogranin%29+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li>
<li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li>
<li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Neural.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li>
<li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li>
<li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li>
<li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li>
<li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+Ca2%2B-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li>
<li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li>
<li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Clin.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li>
<li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin%27s+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li>
<li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול בתנאי מנצל Cam-sepharose חרוזים לחקור את Ca 2 +-התלות של Cam-binding חלבונים. חלבונים רבים לאגד CAM באופן + תלויות Ca 2. אינטראקציות אלה הם בעלי חשיבות רבה בהתחשב במספר CAM מחייב חלבונים תפקיד קריטי שלהם מסלולי איתות רבים. בפרוטוקול זה, Cam-sepharose חרוזים משמשים נפרד CAM מחייב חלבונים מן homogenate רקמות נוכחות או היעדר של Ca 2 +. התוצאות של הגישה הזאת פשוט יהיה עוד יותר את ההבנה של איך חלבונים עשויה ליצור אינטראקציה עם קאם בצ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> מוצר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות </td></tr><tr><td> Calmodulin-Sepharose חרוזים </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CamKII אלפא </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> טוען ג&#39;ל Pipet טיפים </td><td> דיג </td><td> 02-707-138 </td><td> השתמש השאיפה של supernatants </td></tr><tr><td> Microcentrifuge צינורות (2.0 מ&quot;ל) </td><td> דיג </td><td> 05-408-146 </td><td> השתמש עבור כל השלבים הכרוכים calmodulin-sepharose חרוזים </td></tr></table>

הנפתח של calmodulin מחייב חלבונים

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

סידן (Ca 2 +) הוא יון חיוני בוויסות תפקוד הסלולר באמצעות מגוון של מנגנונים. הרבה Ca 2 + איתות מתווכת באמצעות חלבון וסידן מחייב המכונה 1,2 (רמ&quot;א) calmodulin. CAM הוא מעורב במספר רמות כמעט בכל תהליכים תאיים, כולל אפופטוזיס, חילוף החומרים, התכווצות שרירים חלקים, הפלסטיות הסינפטית, צמיחה עצב, דלקת את התגובה החיסונית. מספר חלבונים מסייעים לווסת מסלולים אלו באמצעות האינטראקציה שלהם עם קאם. רבים אינטראקציות אלה תלויים קונפורמציה של CAM, השונה במובהק כאשר חייב Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) בניגוד למצב Ca 2 +-free שלה (ApoCaM) 3. בעוד שרוב החלבונים היעד לאגד Ca 2 +-CAM, חלבונים מסוימים רק לאגד ApoCaM. חלק CAM לאגד דרך תחום IQ שלהם, כולל 4 neuromodulin, neurogranin (נג) 5, ו myosins מסוימים <sup&gt; 6. חלבונים אלה הוכחו תפקיד חשוב בתפקוד presynaptic 7, פונקציה postsynaptic 8, 9 ו - התכווצות שרירים, בהתאמה. יכולתם לקשור ולשחרר CAM בהעדר או נוכחות של Ca 2 + הוא מכריע את תפקידם. לעומת זאת, חלבונים רבים רק לאגד Ca 2 +-CAM ודורשים זה מחייב הפעלה שלהם. דוגמאות כוללות שרירן קינאז שרשרת אור 10, Ca 2 + / CAM תלויי קינאז (CaMKs) 11 ו phosphatases (למשל calcineurin) 12, 13 ו spectrin קינאז, אשר יש מגוון של השפעות ישירות או במורד 14. ההשפעות של חלבונים אלה על תפקוד הסלולר הם בדרך כלל תלויה ביכולתם להיקשר CAM באופן + תלויות Ca 2. לדוגמה, בדקנו את הרלוונטיות של הכריכה NG-CAM בתפקוד סינפטי וכיצד מוטציות שונות משפיעות זו מחייבת. אנחנו שנוצר קון GFP-tagged נגstruct עם מוטציות ספציפיות בתחום-IQ כי תשנה את יכולתו של נג להיקשר CAM באופן + תלויות Ca 2. המחקר של אלה מוטציות שונות נתנו לנו לרדת לעומקה של תהליכים חשובים מעורב בתפקוד סינפטי 8,15. עם זאת, מחקרים כאלה, חיוני להוכיח כי החלבונים מוטציה יש מחייב שינוי צפוי CAM. כאן, אנו מציגים שיטה לבדיקת יכולתה של חלבונים להיקשר קאם נוכחות או היעדר של Ca 2 +, באמצעות CaMKII ו נג כדוגמאות. שיטה זו היא סוג של זיקה כרומטוגרפיה המכונה assay CAM הנפתח. היא משתמשת Cam-Sepharose חרוזים לבדוק חלבונים הנקשרים CAM ואת ההשפעה של Ca 2 + על זה מחייב. זה הזמן הרבה יותר יעיל דורש פחות חלבון ביחס כרומטוגרפיה בעמודה מבחני אחרות. בסך הכל, זה מספק כלי רב ערך כדי לחקור Ca 2 + / CAM איתות וחלבונים כיteract עם קאם.

Calmodulin (רמ&quot;א) הנפתח assay היא דרך יעילה לחקור את האינטראקציה של CAM עם חלבונים שונים. שיטה זו משתמשת Cam-sepharose חרוזים לצורך ניתוח יעיל ספציפי של Cam-binding חלבונים. זה מספק כלי חשוב לחקור איתות קאם פונקציה הסלולר.

סידן (Ca2+) הוא יון חיוני לוויסות התפקוד התאי באמצעות מגוון מנגנונים. חלק ניכר מאיתות ה-Ca2+ מתוּוך על ידי ה...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון חלבונים הנקשרים ל-Cal Modlin באופן תלוי סידן. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף החלבונים הרלוונטיים. לאחר מכן, מוכנים חרוזי calmodulin עבור קישור החלבונים.לאחר מכן, מדגרירים את החלבונים עם חרוזי calmodulin. לבסוף, מבודלים את החלבונים הנקשרים באופן תלוי סידן. בסופו של דבר, ניתן להוציא תוצאות המראות חלבונים הנקשרים ל-calmodulin בנוכחות או בהיעדר סידן באמצעות ניתוח western blot.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון כרומטוגרפיה של CALM והסגפה חיסונית (immunoprecipitation), הוא שהיא דורשת פחות חלבון ופחות זמן. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום השליחה של cow modlin, כגון אילו חלבונים נקשרים ל-cow modlin באופן תלוי סידן, וכיצד שינויים לאחר תרגום (post-translational modifications) עשויים להשפיע על קישורם ל-cow modlin. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון ששלבי הטיפול בחרוזיים הם חיוניים, והתיאור של השהיית החרוזיים והשימור שלהם קשה למעקב ללא צפייה בפועל.כדי להכין רקמה להזרקה הומוגנית של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות עם נגיף המכיל פלסמיד המבטא את החלבון הרקומיבננטי המבוקש. בדוגמה זו, החלבון הרקומיבננטי הוא Neuro Grandin מתויג GFP. אפשרו לרקמה לבטא את החלבון למשך לילה, כ-12 עד 18 שעות לאחר ההזרקה הנגיפית, והוסיפו מיליליטר אחד של תמינת דיסקציה (dissection buffer) לפיתריהעבירו את הרקמה המגודלת עם התוסף (insert) לצלחת פטרי והוסיפו שתי מיליליטר של בופר דיסקציה לתוסף כדי להטביע את הרקמה באמצעות סכין מנתח. אספו חמישה עד 10 פרוסות רקמה היפוקמפליות אורגנוטיפיות על ידי גירוד עדין של הרקמה מהממברנה של התוסף באמצעות פיפטת פסטור הפוכה. העבירו את הרקמה התלויה לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.לאחר מכן, סבב את הדגימות בצנטריפוגה ב-1500 RCF למשך דקה אחת. כדי להפריד את הרקמה מבופר הדיסקציה, הסר בזהירות את העילוי באמצעות שאיבה. ודא שלא להפריע למשקע.עבור כל פרוסה המשמשת בניסוי, העבירו את הרקמה ל-30 עד 60 µL של חוצץ הומוגניזציה באמצעות פיפט של 1 mL בעל קצה קטום, ולאחר מכן בצעו הומוגניזציה יסודית באמצעות פסטל לפני החזרת ההומוגנאט לשפופרת המקורית. כדי להסיר פסדתיים תאיים, סבבו את ההומוגנאט שנותר בצנטריפוגה ב-1100 RCF למשך 10 דקות ואספו בזהירות את העלייה באמצעות שאיבה, תוך הימנעות מזיהום מהמשקע. חלקו 10% מהעלייה כמדגם של הקלט (input).שמרו את supernatant שנותר על קרח בזמן הכנת חרוזי ה-cal sero לשימוש. מאוחר יותר, עבור כל pull down, העבירו בפיפטה 400 µL של חרוזי cal Modlin Sero תלויים לתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 2 mL עם תחתית שטוחה יחסית, כדי למקסם את שטח הפנים ואת האינטראקציה של התמיסות עם החרוזים במהלך הדגירות, סובבו את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה על צדה כדי להרטיב את החרוזים, ולאחר מכן סובבו את החרוזים בצנטריפוגה במהירות של 21,000 RCF למשך 30 שניות.הסיר בזהירות את העל-נוזל (supernatant) באמצעות שאיבה. הקפד שלא להפריע לחרוזי השקיעה בזמן שטיפת החרוזים ב-100 µL של תמיסת ההומוגניזציה המתאימה, המכילה או 2 mM calcium chloride עבור חרוזים המשמשים להשקיע חלבונים נקשרי calcium calmodulin, או 2 mM EDTA, קלטור סידן מוכר, עבור חרוזים המשמשים להשקיע חלבונים נקשרי apo calmodulin.הקישו בעדינות על המבחנה כדי לשחרר את החריזים מהמשקע (Resuspend). סובבו במערך צנטריפוגה ב-1500 RCF למשך דקה אחת. הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות שאיבה, תוך הקפדה שלא להפריע לחריזים, על מנת לקשור חלבונים ל-calmodulin spheros לצורך ביצוע pull down.התחילו בפיצול ה-SNAT לשני נפחים שווים. בהתאם לתנאי כל מנת אליקוט, הוסיפו למשקע את הכמות המתאימה של calcium chloride או EDTA עד לריכוז סופי של 2 mM. הוסיפו את העלייה למסננים השטופים בבופר הומוגניזציה המתאים.הקישו בעדינות על המבחנה כדי לערבב. הדגירו את הדגימות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך שלוש שעות על שייקר. אנו מרחפים את החרוזים בערך כל 30 דקות כדי להגביר את יעילות הקישור.בשלב הבא, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-1500 RC F למשך שלוש דקות. הסירו 50 µL מהעליילי כדגימה של חלבון לא קשור, והסירו בזהירות את שאר העליילי באמצעות שאיבה והשליכו אותו. שטפו את החרוזיים שלוש פעמים כפי שנעשה קודם לכן, עם 100 µL של באפר הומוגניזציה המתאים.השלב הקשה ביותר בנוהל זה הוא סליציה (elution) יעילה של חלבוני המטרה. הדרך הטובה ביותר להבטיח הצלחה היא להשתמש בסוג השפרוור המתאים כדי למזער את אובדן החרוזים, ולסספנד (resuspend) את החרוזים כראוי בבופר סליציה שחומם מראש, דבר שיכול לסייע באופן משמעותי. יש להוסיף 50 µL של בופר סליציה אל החרוזים כדי לסלסל את החלבון.דגימות שעברו הומוגניזציה וקיובו בבופר המכיל סידן הועברו לבופר המכיל EDTA, ודגימות שהיו בבופר המכיל EDTA הועברו לסידן. דגרו את החרו지를 בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר. ערבבו את החרוזים על ידי תיפוף עדין של המבחנה בערך מדי חמש דקות.סבבו את החרוזיים בצנטריפוגה ב-1500 RCF למשך שלוש דקות והסירו בזהירות באמצעות שאיבה את 50 microliters של SNAT עבור דגימת החלבון הקשור. ודאו כי אינכם מסיטים את החרוזיים. בצעו SDS page ו-western blotting כדי לזהות את החלבון המבוקש כביקורת חיובית בתנאי הניגוד.חלבון Prop Pro הידוע כנקשר ל-Cal Modlin. דמות זו מציגה דוגמה לבדיקת pull down של Cal Modlin הבוחנת את הקישור של Cal MODLIN ל-GFP TAG Neuro Grandin בהשוואה ל-neuro Grandin אנדוגני. הקלט ההומוגני מראה כי GFP neuro Grandin בוטה בנוסף ל-neuro grandin אנדוגני ול-calcium calmodulin dependent kinase two, כפי שניתן היה לצפות על סמך הקישור הידוע של neuro Grandin אנדוגני.Neuro Grandin המסומן ב-GFP נקשר בהיעדר סידן ולא נקשר בנוכחות סידן. לעומת זאת, בקרה של calcium calmodulin dependent kinase two נקשרה רק בנוכחות סידן ולא נקשרה בהיעדרה. תוצאה זו מעידה על כך שחרוזי ה-calmodulin תפקדו כראוי ושה-EEU היו יעילים.חשוב מכל, הדבר מראה כי GFP neurogrinin נקשר ל-Apoch Cal Modlin באופן דומה לצורה האנדוגנית, מה שמרמז כי תג ה-GFP לא שינה את התפקוד של החלבון הרקומיננטי. לאחר שליטה בטכניקה זו, ניתן להשלים את התהליך בתוך שש שעות כאשר הוא מבוצע כראוי, וזאת ללא ה-SDS page ואנליזת Western blot. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לסמן את כל הדגימות והמבחנות לפי התנאי המתאים, שכן כל שינוי בריכוז הסידן עלול לפגוע בניסוי כולו. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לקבוע ביעילות את יכולתן של חלבונים ספציפיים להיקשר ל-CAL module באופן תלוי סידן.באמצעות איסוף החלבונים הרלוונטיים, דגירה שלהם עם SRO speeds של co modulant שהוכנו כראוי, אלוציה של החלבונים הקשורים ובדיקתם באמצעות אנליזת Western blot.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Reticulum endoplasmic ממלא תפקיד מרכזי ב biogenesis חלבון ו הומאוסטזיס הסידן. הקמנו מערכת ניסויית המאפשרת לנו כתובת תפקידו של ערוצי Ca2 + לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המתרברבים שלהם. מערכת זו כוללת בתיווך siRNA להשתקת הגן ואת תא חי Ca2 + הדמיה.

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג&#39;ין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR), ערוץ כלוריד אפיתל, דווחה אינטראקציה עם חלבונים שונים לווסת תהליכים תאיים חשובים, ביניהם את PDZ CFTR מוטיב בתיווך אינטראקציות תועדו היטב. פרוטוקול זה מתאר שיטות שפיתחנו כדי להרכיב macromolecular PDZ תלוי CFTR איתות...

בניתוח מבחנה של PDZ תלויי macromolecular תסביכים CFTR לשידור אותות

אנו מציגים פרוטוקולים ליישום של מחוון סידן מקודד גנטית ממוקד גנטית (GECI) Catcher + לניטור מהיר trans סידן ב reticulum endoplasmic / sarcoplasmic (ER / SR) של HEK293 ו שלד שריר תאים C2C12 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. פרוטוקול למדידה באתרו K d וכיול נדון גם.

ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד<sup&gt; 2+</sup&gt; חיישן Catcher<sup&gt; +</sup

וזמינותו הסלולר המתוארת נועד לצורך זיהוי הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4)-סוכנים שמעצבת לעכב או לגרות, תחרותי או allosterically, תאיים Ca2 + שחרור שיזם CXCR4 הפעלה.

קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

הפעולה הרדיאלית הרדיאלית של Ligand Assay (DRaCALA) יכולה לשמש לזיהוי חלבונים קטנים מחייבים ליגנד של אורגניזם באמצעות ספריית ORFeome.

זיהוי החלבונים המחייבים של ליגנדים קטנים עם הפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA)

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנת דגימה וניתוח נתונים לכימות זרחון חלבונים באמצעות מבחן משיכה משופר של מולקולה בודדת כלפי מטה (SiMPull).

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

כאן, אנו מתארים שיטה לביטוי משותף חיידקי של חלבונים מתויגים באופן דיפרנציאלי באמצעות קבוצה של וקטורים תואמים, ואחריה טכניקות משיכה קונבנציונליות לחקר קומפלקסים חלבוניים שאינם יכולים להרכיב במבחנה.

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

פותח פרוטוקול משופר לבדיקת ניוד סידן עם תאי אנדותל, המשמש לזיהוי ליגנדות של קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז (PARs). הפרוטוקול החדש מקצר את זמן הבדיקה הכולל ב-90-120 דקות ומניב עקומות ריכוז-תגובה הניתנות לשחזור.

אפיון אפנן קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז עם בדיקת ניוד סידן באמצעות קורא צלחות

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה electrophoretic הפרדה של חלבונים באמצעות מרובה acrylimide ג'ל אלקטרופורזה (עמוד).

ההפרדה Electrophoretic של חלבונים

בעקבות ההפרדה על ידי שיטות electrophoretic, חלבונים בג'ל ניתן להבחין באמצעות שיטות צביעה שונות. הכתמה של חלבונים עם Coomassie כחול, מכתים כסף, SYPRO אורנג', SYPRO רובי הם הפגינו וידאו.

מכתים חלבונים ג&#39;ל

חקור את אינטראקציות החלבון של קלמודולין בדרך תלוית סידן באמצעות שיטת pull-down. טכניקה זו מאפשרת זיהוי יעיל של חלבונים המקשרים לקלמודולין ומספקת תובנות לגבי מסלולי אותות תאיים.

הנפתח של calmodulin מחייב חלבונים

גלה סרטונים נוספים