הנפתח של calmodulin מחייב חלבונים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון חלבונים הנקשרים ל-Cal Modlin באופן תלוי סידן. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף החלבונים הרלוונטיים. לאחר מכן, מוכנים חרוזי calmodulin עבור קישור החלבונים.

לאחר מכן, מדגרירים את החלבונים עם חרוזי calmodulin. לבסוף, מבודלים את החלבונים הנקשרים באופן תלוי סידן. בסופו של דבר, ניתן להוציא תוצאות המראות חלבונים הנקשרים ל-calmodulin בנוכחות או בהיעדר סידן באמצעות ניתוח western blot.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון כרומטוגרפיה של CALM והסגפה חיסונית (immunoprecipitation), הוא שהיא דורשת פחות חלבון ופחות זמן. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום השליחה של cow modlin, כגון אילו חלבונים נקשרים ל-cow modlin באופן תלוי סידן, וכיצד שינויים לאחר תרגום (post-translational modifications) עשויים להשפיע על קישורם ל-cow modlin. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון ששלבי הטיפול בחרוזיים הם חיוניים, והתיאור של השהיית החרוזיים והשימור שלהם קשה למעקב ללא צפייה בפועל.

כדי להכין רקמה להזרקה הומוגנית של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות עם נגיף המכיל פלסמיד המבטא את החלבון הרקומיבננטי המבוקש. בדוגמה זו, החלבון הרקומיבננטי הוא Neuro Grandin מתויג GFP. אפשרו לרקמה לבטא את החלבון למשך לילה, כ-12 עד 18 שעות לאחר ההזרקה הנגיפית, והוסיפו מיליליטר אחד של תמינת דיסקציה (dissection buffer) לפיתרי

העבירו את הרקמה המגודלת עם התוסף (insert) לצלחת פטרי והוסיפו שתי מיליליטר של בופר דיסקציה לתוסף כדי להטביע את הרקמה באמצעות סכין מנתח. אספו חמישה עד 10 פרוסות רקמה היפוקמפליות אורגנוטיפיות על ידי גירוד עדין של הרקמה מהממברנה של התוסף באמצעות פיפטת פסטור הפוכה. העבירו את הרקמה התלויה לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, סבב את הדגימות בצנטריפוגה ב-1500 RCF למשך דקה אחת. כדי להפריד את הרקמה מבופר הדיסקציה, הסר בזהירות את העילוי באמצעות שאיבה. ודא שלא להפריע למשקע.

עבור כל פרוסה המשמשת בניסוי, העבירו את הרקמה ל-30 עד 60 µL של חוצץ הומוגניזציה באמצעות פיפט של 1 mL בעל קצה קטום, ולאחר מכן בצעו הומוגניזציה יסודית באמצעות פסטל לפני החזרת ההומוגנאט לשפופרת המקורית. כדי להסיר פסדתיים תאיים, סבבו את ההומוגנאט שנותר בצנטריפוגה ב-1100 RCF למשך 10 דקות ואספו בזהירות את העלייה באמצעות שאיבה, תוך הימנעות מזיהום מהמשקע. חלקו 10% מהעלייה כמדגם של הקלט (input).

שמרו את supernatant שנותר על קרח בזמן הכנת חרוזי ה-cal sero לשימוש. מאוחר יותר, עבור כל pull down, העבירו בפיפטה 400 µL של חרוזי cal Modlin Sero תלויים לתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 2 mL עם תחתית שטוחה יחסית, כדי למקסם את שטח הפנים ואת האינטראקציה של התמיסות עם החרוזים במהלך הדגירות, סובבו את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה על צדה כדי להרטיב את החרוזים, ולאחר מכן סובבו את החרוזים בצנטריפוגה במהירות של 21,000 RCF למשך 30 שניות.

הסיר בזהירות את העל-נוזל (supernatant) באמצעות שאיבה. הקפד שלא להפריע לחרוזי השקיעה בזמן שטיפת החרוזים ב-100 µL של תמיסת ההומוגניזציה המתאימה, המכילה או 2 mM calcium chloride עבור חרוזים המשמשים להשקיע חלבונים נקשרי calcium calmodulin, או 2 mM EDTA, קלטור סידן מוכר, עבור חרוזים המשמשים להשקיע חלבונים נקשרי apo calmodulin.

הקישו בעדינות על המבחנה כדי לשחרר את החריזים מהמשקע (Resuspend). סובבו במערך צנטריפוגה ב-1500 RCF למשך דקה אחת. הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות שאיבה, תוך הקפדה שלא להפריע לחריזים, על מנת לקשור חלבונים ל-calmodulin spheros לצורך ביצוע pull down.

התחילו בפיצול ה-SNAT לשני נפחים שווים. בהתאם לתנאי כל מנת אליקוט, הוסיפו למשקע את הכמות המתאימה של calcium chloride או EDTA עד לריכוז סופי של 2 mM. הוסיפו את העלייה למסננים השטופים בבופר הומוגניזציה המתאים.

הקישו בעדינות על המבחנה כדי לערבב. הדגירו את הדגימות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך שלוש שעות על שייקר. אנו מרחפים את החרוזים בערך כל 30 דקות כדי להגביר את יעילות הקישור.

בשלב הבא, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-1500 RC F למשך שלוש דקות. הסירו 50 µL מהעליילי כדגימה של חלבון לא קשור, והסירו בזהירות את שאר העליילי באמצעות שאיבה והשליכו אותו. שטפו את החרוזיים שלוש פעמים כפי שנעשה קודם לכן, עם 100 µL של באפר הומוגניזציה המתאים.

השלב הקשה ביותר בנוהל זה הוא סליציה (elution) יעילה של חלבוני המטרה. הדרך הטובה ביותר להבטיח הצלחה היא להשתמש בסוג השפרוור המתאים כדי למזער את אובדן החרוזים, ולסספנד (resuspend) את החרוזים כראוי בבופר סליציה שחומם מראש, דבר שיכול לסייע באופן משמעותי. יש להוסיף 50 µL של בופר סליציה אל החרוזים כדי לסלסל את החלבון.

דגימות שעברו הומוגניזציה וקיובו בבופר המכיל סידן הועברו לבופר המכיל EDTA, ודגימות שהיו בבופר המכיל EDTA הועברו לסידן. דגרו את החרו지를 בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר. ערבבו את החרוזים על ידי תיפוף עדין של המבחנה בערך מדי חמש דקות.

סבבו את החרוזיים בצנטריפוגה ב-1500 RCF למשך שלוש דקות והסירו בזהירות באמצעות שאיבה את 50 microliters של SNAT עבור דגימת החלבון הקשור. ודאו כי אינכם מסיטים את החרוזיים. בצעו SDS page ו-western blotting כדי לזהות את החלבון המבוקש כביקורת חיובית בתנאי הניגוד.

חלבון Prop Pro הידוע כנקשר ל-Cal Modlin. דמות זו מציגה דוגמה לבדיקת pull down של Cal Modlin הבוחנת את הקישור של Cal MODLIN ל-GFP TAG Neuro Grandin בהשוואה ל-neuro Grandin אנדוגני. הקלט ההומוגני מראה כי GFP neuro Grandin בוטה בנוסף ל-neuro grandin אנדוגני ול-calcium calmodulin dependent kinase two, כפי שניתן היה לצפות על סמך הקישור הידוע של neuro Grandin אנדוגני.

Neuro Grandin המסומן ב-GFP נקשר בהיעדר סידן ולא נקשר בנוכחות סידן. לעומת זאת, בקרה של calcium calmodulin dependent kinase two נקשרה רק בנוכחות סידן ולא נקשרה בהיעדרה. תוצאה זו מעידה על כך שחרוזי ה-calmodulin תפקדו כראוי ושה-EEU היו יעילים.

חשוב מכל, הדבר מראה כי GFP neurogrinin נקשר ל-Apoch Cal Modlin באופן דומה לצורה האנדוגנית, מה שמרמז כי תג ה-GFP לא שינה את התפקוד של החלבון הרקומיננטי. לאחר שליטה בטכניקה זו, ניתן להשלים את התהליך בתוך שש שעות כאשר הוא מבוצע כראוי, וזאת ללא ה-SDS page ואנליזת Western blot. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לסמן את כל הדגימות והמבחנות לפי התנאי המתאים, שכן כל שינוי בריכוז הסידן עלול לפגוע בניסוי כולו. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לקבוע ביעילות את יכולתן של חלבונים ספציפיים להיקשר ל-CAL module באופן תלוי סידן.

באמצעות איסוף החלבונים הרלוונטיים, דגירה שלהם עם SRO speeds של co modulant שהוכנו כראוי, אלוציה של החלבונים הקשורים ובדיקתם באמצעות אנליזת Western blot.