ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

המטרה הכוללת של נוהל זה היא להפיק נגיפי parvo רקומביננטיים, או rec PVS, בתיתורים גבוהים תוך שמירה על איכותם וצמצום זמני והעלויות של הייצור. הדבר מושג תחילה על ידי הפקת מלאי נגיפי rec PV ראשוני באמצעות טרנספקציה של תאי HEC 2 93 T עם פלסמידים של rec PV, יחד עם וקטור נגזר מ-adenovirus type five. זאת מכיוון שהחדרת אלמנטים גנומיים של ad לתאי HEC 2 9 3 T מגדילה את ייצור ה-rec PVS ביותר מפי עשרה.

בהשוואה לפרוטוקולים קיימים, נוצר AD VP helper חדש המכיל את האלמנטים הגנומיים של האדנווירוס הנחוצים להגברת ייצור פרוו-וירוס רקומביננטי, וכן את יחידת הגן VP של הפרוו-וירוס. השלב הבא הוא לייצר ולטהר את ה-ADD VP helper החדש זה בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים.

השלב האחרון בהליך זה הוא הגברת ה-rec PVS על ידי זיהום משותף של תאי NB three 20 4K עם נגיפי rec PV ו-AD ADP. יעילות ייצור ה-rec PV משתפרת ביותר מ-100 ממים באמצעות אסטרטגיה זו, שבה ניתן להשתמש באופן בלעדי ברגע שכמות קטנה של rec PVS הופקה באמצעות טרנספקציה. לבסוף, נעשה שימוש ב-quantitative real-time PCR או בבדיקת טרנסדוקציה לצורך טיטרציה של מלאי הנגיפים שהופקו.

בנוסף, מבוצע מבחן פלאקים (plaque assay) כדי לאשר כי לא נוצרו וירוסים לא רצויים בעלי יכולת שכפול במהלך תהליך הייצור. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ייצור קלאסי של פַּרבוֹוִירוּס רקומיננטי באמצעות פלסמיד בתוך תאים, הוא שברגע שהפקנו את המלאים הראשוניים של הפַּרבוֹוִירוּס הרקומיננטי באמצעות וירוס עזר אדנו-וירוס VP, הייצור שלנו יתבסס כולו על זיהום נגיפי. הדבר מאפשר שימוש בתאי NBK, שהם יצרנים טובים של פַּרבוֹוִירוּס, אך אינם ניתנים לטרנספקציה.

בדרך זו, ניתן להגביר את הנגיפים הרקומביננטיים ולהגדיל את תפוקת הנגיפים השכיחה ביותר פי 100, תוך הפחתת זמן ועלויות הייצור. את הפרוצדורה תדגים ברברה לואיק, ראש יחידת ייצור הנגיפים, שפיתחה יחד איתנו את הפרוטוקול החדשני הזה. אנו מקווים שתהנו מהסרטון ומאחלים לכם בהצלחה בניסוייכם.

ייצור של parvovirus רקומביננטי או rec PV באמצעות טרנספקציה נדרש כדי להפיק את הכמות המינימלית של rec PVS שתשמש כאינוקולום בייצור העוקב של rec PVS באמצעות הדבקה. מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) נדרשת לייצור של rec PVS. יום אחד לפני הטרנספקציה, זרע 2 מיליון תאי HEC 2 9 3 T בצלחת של 10 סנטימטר כדי להגיע ל-50% תאימות תאית (confluency).

ביום הטרנספקציה, גדלו את התאים ב-10 milliliters של DMEM מועשר ב-10%FBS, L-glutamine, פניצילין וסטRepartitionפטומייצין; דגרו למשך הלילה ב-37 degrees Celsius ב-5%carbon dioxide ו-92%humidity. ביום הטרנספקציה, הכינו תערובת לייצור נגיף במבחנה של 1.5 milliliter. הוסיפו את הרכיבים הבאים ביחס מולרי של אחת לשתיים לאחת: 3 micrograms של וקטור rec PV הנושא את הגן הזר הרצוי.

שישה מיקרוגרמים של וקטור P-C-M-V-V-P הנושא את יחידת הגן של קפסיד הפרבו-וירוס, ושמונה מיקרוגרמים של פלסמיד עזר המופק מאדנווירוס. דללו את תערובת הפלסמיד בתווך נטול סרום עד לנפח של 850 מיקרוליטר כדי להגיע לריכוז סופי של 20 ננוגרם למיקרוליטר. לאחר מכן, הוסיפו 42.5 מיקרוליטר של ריאגנט טרנספקציה FU gene HD ביחס של 2.5 ל-1 של ריאגנט FU gene ל-DNA.

הקפידו שסוכן גן ה-FU לא יבוא במגע עם דופן המבחנה; ערבבו בעדינות במערבל וורטקס למשך 5 עד 10 שניות, ולאחר מכן דגרו את תערובת הטרנספקציה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסיפו את תערובת הטרנספקציה לתאים בטפטוף. נערה את הפלטה בעדינות כדי להפיץ את התערובת באופן שווה.

דגרו את המצע למשך 72 שעות ב-37 °C עם 5% carbon dioxide ו-92% humidity. במהלך תקופה זו, נוצרים חלקיקי parvovirus צאצאים מתוך פלסמידי parvovirus לצורך קציר הנגיף. ראשית, גרדו את התאים יחד עם המצע שלהם, לאחר מכן שאבו והעבירו את התוהית מהצלחת לשפופרת פלסטיק של 15 milliliter.

סובב את המבחנה בצנטריפוגה ב-250 G למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, הסר 95% מהנוזל העליון (supernatant), והשאר כ-0.5 milliliters. ערבב את המבחנה בעזרת וורטקס בעדינות כדי להחזיר את המשקע (pellet) לסוסיפנסיה עם הנוזל העליון שנותר, והעבר למבחנת אפנדורף של 1.5 milliliter.

הקפיאו את התו suspension באמבט חנקן נוזלי ולאחר מכן הפשירו במים חמימים בטמפרטורה של 37 °C. ערבבו את המבחנה ב-Vortex בעוצמה למשך 15 שניות. חזרו על מחזור ההקפאה וההפשרה פעמיים נוספות.

סבב את המבחנה בצנטריפוגה ב-16,000 G למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, ואסוף את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה נקייה. הנוזל העליון בשלב זה מכיל את תמצית הנגיף הגולמית, שבה ניתן להשתמש כאינוקולום להפקת rec PVS באמצעות הדבקה. הגברת כמות הנגיף.

שכפולים תלויים בגורמים תאיים המבטאים עצמם בתאים בשלבי התרבות. לכן, חשוב שהתאים המשמשים לייצור הנגיף הרקומביננטי יהיו במצב אופטימלי ויונחו בצפיפות מתאימה, כפי שמוצג בפרוטוקול זה. יום אחד לפני ההדבקה, זרעו 10 מיליון תאי MB three 20 4K בבקבוק T 1 75 כדי להשיג 60% עד 80% קונפלואנס תאי ביום למחרת.

הכינו בקבוק שני המכיל את אותו מספר תאים כביקורת. בכל בקבוק T 1 75 צריכים להיות 20 milliliters של MEM כנפח סופי, בתוספת 5%FBS, L-glutamine, penicillin ו-streptomycin, בבוקר של יום ההדבקה. הכינו תערובת נגיף בתוך מבחנה פלסטית של שני milliliters.

הוסף את הריאגנטים הללו. הוסף VP helper. הוסף rec PVS בריבוי זיהום של 10 ב-MOI של 0.5 ו-MEM עד ל-1.5 milliliters.

העבר את כל תערובת הווירוס לאחד מבקבוקי ה-T 1 75. דגרא את הבקבוק למשך שעתיים ב-37 degrees Celsius, 92%humidity ו-5%carbon dioxide תוך써 ניעור עדין מדי 15 דקות. דגרא למשך 20 עד 24 שעות נוספות ב-37 degrees Celsius, 92%humidity ו-5%carbon dioxide.

לאחר 20 עד 24 שעות, החליפו את מצע התרבית במצע טרי, והדגירו את הבקבוק תחת אותם תנאים למשך 48 שעות כאינדיקציה לייצור ויראלי יעיל. יש לצפות בסימנים ברורים לציטוטוקסיות בבקבוק המכיל תאים שהודבקו בנגיף. החל מ-36 עד 48 שעות לאחר ההדבקה, לאחר 48 שעות, שאבו והעבירו את עליון המצע מהבקבוק לשפופרת צנטריפוגה של 50 מיליליטר.

שטפו את התאים פעמיים עם 1.5 milliliters PBS, השתמשו בטריפסין למשך שלוש עד חמש דקות, ולאחר מכן הוסיפו את תרחיף התאים למדיום שהוסר. סובבו את התאים ואת העלייה בצנטריפוגה ב-5,000 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, השליכו את העלייה והוסיפו one milliliter של TE buffer למשקע התאים. ערבבו בעדינות במכשיר vortex את המבחנה כדי לתלות מחדש את התאים. לאחר מכן, הקפיאו את תרחיף התאים באמבט חנקן נוזלי והפשירו במים חמים ב-37 degrees Celsius.

ערבבו את המבחנה במיקסר וורטקס בעוצמה למשך 15 שניות. חזרו על מחזור ההקפאה וההפשרה שלוש פעמים. לאחר מכן, טפלו בתליה התאית ב-Ben Nase nuclease למשך 30 דקות ב-37 degrees Celsius כדי לעכל DNA גנומי של תאים ו-DNA ויראלי שאינו ארוז.

לאחר 30 דקות, סובב את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 5,000 G למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לבסוף, אסוף את supernatant למבחנה חדשה. supernatant בשלב זה מכיל תמצית נגיף גולמית.

תנובות טיפוסיות של rec PV GFP המופקות לפי פרוטוקול זה צפויות להיות בטווח של פעם אחת עד 10 פעמים 10 to the eighth יחידות זיהום ויראליות. דוגמה לעירור של ייצור rec PV באמצעות פלסמיד מבוסס אדנווירוס מוצגת כאן. תמריתי וירוס גולמיים המכילים PHH one GFP erect PV הנושא את הגן GFP עם או ללא.

פלסמיד PXX המבוסס על אדנווירוס הוחל על תאי אינדיקטור NBK; כפי שנראה במיקרוגרפים אלה, קיימים יותר תאים חיוביים ל-GFP בנוכחות PXX six. כאשר בוצעו בדיקות טרנסדוקציה של GFP, התקבלה עלייה ברורה בייצור rec PV בנוכחות Pxx six. הייצור עלה מ-0.3 יחידות טרנסדוקציה של GFP או TU לתא, שהושגו באמצעות פרוטוקולים קונבנציונליים, לכ-5 TU לתא שהושגו באמצעות פרוטוקול זה.

התוצאות מבדיקת התעתוק של GFP מעידות על כך שגני האדנווירוס E2a, E4 ו-VA RNA הכלולים ב-PXX6 מסוגלים להגביר את ייצור הפרבוביירוס. איור זה מציג דוגמה מייצגת של ייצור rec PV באמצעות הדבקה. תאי NB3.20 4K הודבקו בנגיף עזר ADP מנוקה ולאחר מכן הודבקו שוב באחד משני הפרבוביירוסים הרקומיננטיים.

תמציות תאים גולמיות שימשו לקביעת טיטרים של נגיפים באמצעות בדיקת טרנסדוקציה, שהראתה כי ה-AD VP helper הגביר עוד יותר את ייצור ה-rec PV עד לרמה של יותר מ-70 T לתא. לבסוף, מנות נגיפיות שהופקו בנוכחות או בהיעדר ADP נותחו כדי לבחון את תכולתן בחלקיקים נגיפיים בעלי יכולת רפליקציה באמצעות בדיקת פלאקים על תאי אינדיקטור MB three 20 4K. התוצאות מעידות כי ה-ADP helper הגביר את ייצור ה-rec PV מבלי להגביר את השכיחות של חלקיקים נגיפיים לא רצויים בעלי יכולת רפליקציה לאחר פיתוחם.

טכניקה זו מאפשרת למדענים בתחומי הסרטן והטיפול הגנטי להגדיל עוד יותר את קנה המידה של ייצור וירוסים רקומביננטיים. באמצעות ביו-ריאקטורים ניתן לייצר וריאנטים בכמויות הגדולות הדרושות במסגרת קלינית.