Name: ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: למד ייצור יעיל של Parvovirus רקומביננטי בעזרת וקטור עוזר מבוסס adenovirus. שיטה זו מגבירה את התפוקה פי עשרה ומפחיתה עלויות וזמני ייצור בתחום הווירולוגיה והגנתרפיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לצוות ההפקה וירוס DKFZ היחידה לפיתוח, במיוחד מרקוס מילר, סילביה Münstermann, ברברה Liebetrau, ואת מנדי רושר. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקי משרד הפדרלי לחינוך ולמחקר (BMBF) והאגודה הלמהולץ במסגרת Krebsforschungszentrum Deutsches / Cancéropôle du Grand-Est תכנית משותפת יישומי Tumour וירולוגיה.

<ol><li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus.+Res%22%5BJournal%5D)">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183(2007).</li>
<li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185(2010).</li>
<li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1%2C+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li>
<li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCornelis%2C+JJ+%22J.+Virol%22">J. Virol</a>. 6, 193-193 (2004).</li>
<li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li>
<li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224(1998).</li>
<li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509(1998).</li>
<li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973(1999).</li>
<li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129(1997).</li>
<li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851(2003).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

הראינו כי הייצור recPV ניתן לשפר על ידי נוכחות של אלמנטים הגנומי adenoviral. הגדלנו את התשואות על ידי recPV פי יותר מ 10 (מתא 0.3-5 / TU) על ידי מתן מרכיב גנטי adenovirus דרך transfection ועל ידי יותר מ -100 לקפל שיתוף מדביק תאים עם AD-עוזר, סמנכ&quot;ל בשילוב עם recPV ב לעומת פרוטוקולים קונבנציונאלי. פרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מותאם יותר על ידי קביעת העיתוי המתאים ביותר עבור משלוח של האלמנטים גנומית adenovirus ואת ריכוז אופטימלי של עוזר Ad-סמנכ&quot;ל לשמש הזיהום. <p clas...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> סיגמא </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> סיגמא </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Foetal שור סרום </td><td> PAA </td><td> ת 15-101 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> רוש </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase nuclease </td><td> סיגמא </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X ראפיד titer Kit </td><td> Clontech </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

ייצור יעיל parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Parvoviruses מכרסמים (PV) כגון עכברים H-1PV ו MVM, הם קטנים, בודדים icosahedral תקועים, נגיפי DNA. הגנום שלהם כוללת שני היזמים P4 ו p38 המסדירות את הביטוי של חלבונים בלתי מבניים (ns1 ו NS2) ו capsid (VP1 ו VP2) בהתאמה 1. הם מושכים אליהם ריבית גבוהה כסוכנים נגד סרטן עבור יכולות oncolytic ו oncosuppressive שלהם בעת היותו פתוגניים לא עבור בני אדם 2. Ns1 הוא מפעיל מרכזי של 3 cytotoxicity ויראלי. על מנת לשפר עוד יותר את פעילות antineoplastic הטבעיים, נגזרים מתוך וקטורים אלו נוצרו על ידי החלפת קידוד הגן החלבונים AAV עם transgene טיפולית (למשל ציטוטוקסיות פוליפפטיד, ציטוקינים chemokine, גן מדכא גידולים וכו &#39;) 4. את parvoviruses רקומביננטי (recPVs) וקטור שומרת לעצמה את ns1 / 2 רצפי קידוד והטלומרים הגנום PV אשר הדרושים הגברה DNA אריזה ויראלי. הייצור שלrecPVs מתרחשת רק בתאי היצרן (בדרך כלל HEK293T), על ידי שיתוף transfecting את התאים עם וקטור 2 (pCMV-VP) להביע את הקידוד הגנטי של חלבונים סמנכ&quot;ל (איור 1) 4. הווקטורים recPV שנוצר באופן זה הם שכפול פגום. למרות recPVs הוכיח בעל פעילות oncotoxic משופרות ביחס וירוסים הורים שממנו הם נוצרו, הייצור שלהם עדיין מהווה אתגר מרכזי מאוד מעכבת את השימוש של סוכנים אלה נגד סרטן יישומים קליניים. מצאנו כי הכנסת וקטור Ad-5 המכיל נגזרת E2a, E4 (orf6) ואת רנ&quot;א גנים נכי מלחמה (למשל pXX6 פלסמיד) אל HEK293T שיפור הייצור של recPVs על פי יותר מ 10 לעומת פרוטוקולים אחרים בשימוש. בהתבסס על ממצא זה, בנינו רומן Ad-VP-עוזר המכיל את המרכיבים הדרושים adenoviral גנטי כדי לשפר את הייצור recPVs כמו גם parvovirלנו סמנכ&quot;ל הגן יחידה 5. השימוש Ad-VP-עוזר, מאפשרת ייצור של מלבן הכונן באמצעות פרוטוקול זה מסתמך אך ורק על מדרגות זיהום ויראלי (בניגוד transfection הפלסמיד), מה שהופך את השימוש האפשרי של שורות תאים שקשה transfect (למשל NB324K) ( איור. 2). אנו מציגים שיטה משפר באופן משמעותי את כמות וירוס רקומביננטי המיוצר, הן צמצום זמן הייצור בעלויות, מבלי להשפיע על איכות המוצר הסופי 5. בנוסף, ייצור בקנה מידה גדול של recPV (בתאים ההשעיה ו bioreactors) כיום להעלות על הדעת.

כאן אנו מתארים את פרוטוקול מבוסס רק על זיהום התא, אשר משפר את יעילות הייצור parvovirus רקומביננטי ידי קיפול יותר מ 100 לעומת פרוטוקולים אחרים בשימוש. פרוטוקול זה מתבסס על שימוש adenovirus רומן 5 מבוסס עוזר המכיל סמנכ&quot;ל parvovirus שעתוק יחידה (Ad-VP).

ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

פרבובירוסים של מכרסמים (PV), כגון H-1PV של חולדה ו-MVM, הם נגיפי DNA קטנים, בעלי מבנה איקוסהדרלי וגנום של גדיל בודד. הגנום שלהם כולל שני מקדמים, P4 ו-P38...

המטרה הכוללת של נוהל זה היא להפיק נגיפי parvo רקומביננטיים, או rec PVS, בתיתורים גבוהים תוך שמירה על איכותם וצמצום זמני והעלויות של הייצור. הדבר מושג תחילה על ידי הפקת מלאי נגיפי rec PV ראשוני באמצעות טרנספקציה של תאי HEC 2 93 T עם פלסמידים של rec PV, יחד עם וקטור נגזר מ-adenovirus type five. זאת מכיוון שהחדרת אלמנטים גנומיים של ad לתאי HEC 2 9 3 T מגדילה את ייצור ה-rec PVS ביותר מפי עשרה.בהשוואה לפרוטוקולים קיימים, נוצר AD VP helper חדש המכיל את האלמנטים הגנומיים של האדנווירוס הנחוצים להגברת ייצור פרוו-וירוס רקומביננטי, וכן את יחידת הגן VP של הפרוו-וירוס. השלב הבא הוא לייצר ולטהר את ה-ADD VP helper החדש זה בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים.השלב האחרון בהליך זה הוא הגברת ה-rec PVS על ידי זיהום משותף של תאי NB three 20 4K עם נגיפי rec PV ו-AD ADP. יעילות ייצור ה-rec PV משתפרת ביותר מ-100 ממים באמצעות אסטרטגיה זו, שבה ניתן להשתמש באופן בלעדי ברגע שכמות קטנה של rec PVS הופקה באמצעות טרנספקציה. לבסוף, נעשה שימוש ב-quantitative real-time PCR או בבדיקת טרנסדוקציה לצורך טיטרציה של מלאי הנגיפים שהופקו.בנוסף, מבוצע מבחן פלאקים (plaque assay) כדי לאשר כי לא נוצרו וירוסים לא רצויים בעלי יכולת שכפול במהלך תהליך הייצור. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ייצור קלאסי של פַּרבוֹוִירוּ

efficient-recombinant-parvovirus-production-with-help-adenovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הצלת Arenaviruses רקומביננטי מcDNAs המשובטים, גישה המכונה להפוך גנטיקה, מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקיד של מוצרים גנטיים נגיפיים ספציפיים, כמו גם את תרומתו של תחומים ושאריות הספציפיים השונים שלהם, להיבטים רבים ושונים של הביולוגיה של arenavirus . כמו כן, להפוך טכניקות גנטיקה בשורות תאי ה-FDA (Vero) לפיתוח חיסון מספק אפשרויות חדשות לייצור חיסונים יעילים ובטוחים כדי להילחם Arenaviruses פתוגניים אדם.

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), נחקר בהרחבה בשנים האחרונות על מנת לפתח וקטורים חדשים לחיסון וטיפול, בין יתר. מחקרים אלה היו אפשריים בשל טכניקות להצלת וירוס רקומביננטי מcDNA, כמו אלה שאנו מתארים כאן.

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

ב-15 השנים האחרונות, וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 (CAV2) הוכיחו את יעילותם בהתמרת תאים במבחנה וב-vivo ונמצאים בשימוש נרחב לחיסון וריפוי גנטי. כאן, אנו מתארים הליך לבנייה, ייצור וטיהור של וקטורי CAV2, מה שמוליד תרחיפים נגיפיים בעלי טיטר גבוה.

ייצור וטיהור של וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 שאינם משוכפלים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור וקטור הוכחה של עיקרון סוג אדנווירוס דו הערכי 5 (Ad5) Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי ניצול אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות. וקטור זה הודגם להפגין כושר איכותי, היכולת להימלט סרה Ad5 חיובית במבחנה, וantigenicity כמו גם חיסונית לאנטיגנים המשולבים.

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

מוצג פרוטוקול ליצירת וקטורים אדנו-ויראליים בעלי קיבולת גבוהה החסרים את כל רצפי הקידוד הוויראליים. שיבוט של טרנסגנים הכלולים בגנום הווקטור מבוסס על אנדונוקלאזות ביות. הגברת הנגיף בתאי יצרן הגדלים כתאים נצמדים ובתרחיף מסתמכת על וירוס עוזר המספק גנים נגיפיים בטרנס.

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

אנו מתארים שיטה ליצירת, הגברה גנטית שונה וירוסים syncytial הנשימה (RSVs) ואת וזמינותו של פלאק ממוטב עבור RSVs. אנו ממחישים לפרוטוקול זה על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לאפשר כימות של שכפול RSV ולחיות ניתוח של RSV הכללה וגופי בגרגרים הכללה גופים הקשורים דינמיקה.

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

הדור של רקומביננטי rotaviruses מ-DNA פלאמיד מספק כלי חיוני לחקר שכפול rotaviruses ו פתוגנזה, ופיתוח של וקטורים rotaviruses ביטוי וחיסונים. להלן, אנו מתארים גישה גנטית הפוכה פשוטה ליצירת רקומביננטי rotaviruses, כולל זנים המבטא חלבונים כתבת פלורסנט.

מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי

זוהי שיטה להפקת וירוסים "להוריד" רקומביננטי vaccinia באמצעות בחירה בטווח המארח וזיהוי חזותי של רקומביננטי וירוסים.

דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור אדנווירוס באמצעות מערכת pAdEasy. הטכנולוגיה כוללת שילוב מחדש של pAdTrack ו pAdEasy-1 פלסמידים, האריזה וההגברה אדנווירוס, טיהור של חלקיקים אדנו-ויראליים מן מדיום lysate ותרבות התא, titration ויראלי, ואת הבדיקה הפונקציונלית של אדנווירוס.

שיטה יעילה לייצור אדנווירוס

שיעור התחלופה של וירוסים במערכות ימיים מים מתוקים ניתן לאמוד על ידי ירידה וטכניקה הישנותם. הנתונים לאפשר לחוקרים להסיק ששיעורי התמותה וירוס בתיווך של חיידקים במערכות מים.

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

למד ייצור יעיל של Parvovirus רקומביננטי בעזרת וקטור עוזר מבוסס adenovirus. שיטה זו מגבירה את התפוקה פי עשרה ומפחיתה עלויות וזמני ייצור בתחום הווירולוגיה והגנתרפיה.

ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

גלה סרטונים נוספים