Name: אמיד מימן / דאוטריום Exchange and MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ניתוח של הפעלת Pak2 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: למדו כיצד לנטר החלפת מימן/דאוטריום בהפעלת קינאז חלבון Pak2 באמצעות ספקטרומטריית מס MALDI-TOF. השיטה מספקת תובנות לגבי דינמיקה מבנית ושינויים קונפורמציוניים בחלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת בחלק מן המכונים הלאומיים לבריאות גרנט GM-26738 (אל ג&#39;ת).

1. Pak2 Activation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הסכום המתאים מראש נבדק של caspase 3 עד 20 μl של Pak2 12 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במאגר (50 mM טריס-HCl, 150 mM NaCl, ו 2 DTT mM ב-pH 7.5) ו לדגור על 34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באופן מלא לדבוק ולהפעיל Pak2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את המוצרים המחשוף על ידי SDS-PAGE (10%) ו מכתים Coommassie כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את Pak2 ביקע למאגר הפעלת B (50 מ&quot;מ טריס-HCl, 150 mM NaCl, 15 מ&quot;מ MgCl 2, 10 mM ATP) ב-pH 7.5, ב 20 μl לריכוז סופי של Pak2 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל, ו - דגירה על 34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להפעיל באופן מלא על ידי Pak2 autophosphorylation ב -8 אתרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר מחשוף מלא Pak2 על ידי הגירה של p34 ו - p27 שברי כפי שנקבע על ידי SDS-PAGE 10. אימות נאות של תנאי autophosphorylation נעשית באמצעות autoradiography בניסוי נפרד באמצעות (32 P) ה-ATP או ספקטרומטריית מסה לזהות phosphopeptides. </li></ol> 2. הזדהותשל פפסין-מתעכל Pak2 שברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של חומצה Trifluroacetic 0.1% (TFA) ב-pH 2.5 לשטוף את חרוזי agarose פעמיים לפני השימוש. ואז, צנטריפוגה דגימות עבור 15 שניות ב XG 2000 כדי להסיר את החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף Pak2 (20 מיקרוגרם ב 2 μl של 150 mM NaCl, 50 מ&quot;מ טריס-HCl ו - 2 mM DTT ב-pH 7.5) עד 100 μl של TFA 0.1%, ו דגירה המדגם עבור 5 דקות עם 30 μl של פפסין, מצומדות חרוזים agarose . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן בשלב הפוכה HPLC טור C18 עם מערכת ממס העיקרי של TFA 0.1% ב-pH 2.5. לעכל עכלן (50 μl) הוא eluted באמצעות שיפוע ליניארי 100 דקות של 0-80% אצטוניטריל המכיל TFA 0.1% בקצב זרימה של 0.2 ml / min. שברים נאספים כל 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את השברים HPLC עם מהירות-VAC (3 שעות) ו resuspend דגימות בתמיסה של אצטוניטריל (5 μl) ו TFA 0.1% (5 μl) ב-pH 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתחילה, כל שבריר לגילוי פפטידים באמצעות MALDI-TOF PerSeptive Biosystems וויאג&#39;ר STR DE (PE Biosystems, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה&quot;ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16 שברים המכיל פפטידים כפופים ספקטרומטריית מסה טנדם באמצעות ספקטרומטר Q-TOF המוני XL QSTAR oMALDI MS / MS לזהות את שברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף של פפטיד זה מאומת על ידי יונים מוצר שנוצר על ידי ספקטרומטריית מסה בד בבד עם / m z יחסי התיאורטי מבוסס על הרצף הראשוני של Pak2 השימוש באתר חלבון מחפש הזהב ( <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. מדידה של Exchange אמיד H / D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את כל הפתרונות הדרושים ריאגנטים H / D החליפין של 25 מעלות בתוך אמבט מים. ה-ATP הוא מומס במים ואת ה-pH מותאם 7.0 לפני השימוש. נוסף 4mm ATP ב 2 D O חיץ היא למנוע ה-ATP ניתק מן Pak2 לאחר דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום H / D החליפין על ידי תוספת של 18 μl של בופר D 2 O (50 mM מגבים pH 6.98, 125 mM NaCl) כדי μl 2 (20 מיקרוגרם) של Pak2 במאגר המכיל 150 mM NaCl, 50 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.5) ו 2 DTT מ&quot;מ, וכתוצאה מכך רמת Pak2 של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - pH של 7.0 ב 0 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות בשלושה עותקים בחילופי H / D עבור 0, 0.5, 1, 3, 5, ו - 10 דקות, או 24 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את תהליך H / D החליפין על ידי הוספת 180 μl של TFA קר כקרח 0.1% ב-pH 2.2, אשר מביאה את ה-pH עד 2.5 בנפח סופי של 200 μl. עבור דגימות המכילות ATP, 180 μl של TFA קר כקרח 0.11% ב-pH 2.2 משמש כדי לשמור על pH ב 2.5 במצב הרווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף aliquot (100 μl) של המדגם כל הרווה ל μl 30 של הפעיל פפסין-מצומדות חרוזים agarose. העיכול פפסין מותר להמשיך על קרח דק חמש דוגמאות vortexed כל 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את מערכת העיכול על ידי צנטריפוגה של המדגם עבור 15 שניות XG ב 5000 ב 4 ° C כדי להסיר את פפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות ההקפאה דגימות נוזלי N 2 ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2לפני ניתוח MALDI-TOF ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטריצה ​​עבור MALDI הוא 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (CHCA) המומסים בתמיסה (1:01:01) של אתנול אצטוניטריל, TFA ו 0.1% ב-pH 2.5 והחזיק ב 0 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקית להפשיר כל מדגם במהירות לערבב 1 μl של כל דגימה עם μl 1 של מטריקס במקום על צלחת 4 ° C MALDI היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת ואקום בינוני עד הצלחת לייבש את נקודות ב 30 שניות לפני ניתוח MALDI-TOF. הזמן בין הפשרת המדגם ואחזור הספקטרום הוא כ 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת MALDI-TOF המוני ספקטרום עם STR PerSeptive Biosystems DE וויאג&#39;ר. רכישת נתונים בקצב של 2 GHz דגימה ב 100.000 ערוצי נתונים, עם מתח 20000-V מואצת, וכן מתח רשת 65% באמצעות מיצוי מתעכב עם עיכוב של 180 ns דופק. מאה סריקות הם בממוצע תוך 2 דקות. המכשיר MALDI-TOF אינו מוגבל כל מותג או כל תוכנה מיוחדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Data Explorer 4.0 תוכנית מחשב calculאכלו את deuteration של כל קטע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב החליפין בחזרה מבוסס על היחס בין מספר deuteron בפועל שולבו ב 24 שעות של H / D חילופי מחולק כל האתרים חליפי אפשרי, שהם עמוד השדרה למעט ואימידים אמיד N-הטרמינל (איור 1). </li></ol> 4. נציג תוצאות: מחשוף caspase ו autophosphorylation מאומתים על ידי מכתים Commassie SDS-PAGE. Pak2 פעילה היא להקה אחת של 58 kDa. המחשוף של caspase Pak2 תושלם, מייצרת שני שברים, p27 ו - p34 אשר נודדים בנפרד. ההגירה של p27 ו - p34 מראה autophosphorylated חפיפה על הג&#39;ל עקב הגירה של מפגר בקטע p27 phosphorylated במלואו (איור 2). H / D ניסויים החליפין מתבצעות מספר פעמים בין 0 ל 10 דק &#39;(איור 3). כדוגמה, את מהלך הזמן ההתאגדות דאוטריום לתוך m / ZPeak של 1,697.85 Pak2 פעיל מורכב פסגות איזוטופי מרובים כפי שמוצג על ידי שינוי של המעטפה המונית לאורך זמן. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> באיור 1. משוואה לחישוב deuteration. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> באיור 2. Autophosphorylation ו מחשוף caspase של Pak2. Caspase-ביקע Pak2 (הנתיב השמאלי), Pak2 פעיל שלם (באמצע הנתיב) ו caspase-ביקע Pak2 autophosphorylated (נתיב ימין) נותחו על ידי SDS-PAGE ו מכתים Coommassie כחול. מעובד מתוך הסו, י.ח. ואח&#39; 2. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> באיור 3. הספקטרום המוניים כמובן זמן ההתאגדות דאוטריום עבור Pak2 פעיל. Pak2 פעילה היה נתון H / D exchange דקות 0-10 ונותחו על ידי MALDI-TOF. דוגמה של חלוקת איזוטופי מורחבת של MALDI-TOF של שיא m / z 1,697.85 במהלך תקופה של H / D חילופי מוצג. קו מקווקו אדום מציין את הממוצע של המעטפה המונית במשמרת של המעטפה מציגה את ההמונים deuteration של פפטיד.

<ol><li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+H%2F2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R%28I%29alpha+subunit+of+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li>
<li>Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+conformational+changes+during+activation+of+protein+kinase+Pak2+by+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange.</a> J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).</li>
<li>Englander, S. W., Kallenbach, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+and+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids.</a> Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).</li>
<li>Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+the+membrane+binding+region+of+Group+VIA+Ca2%2B-independent+phospholipase+A2+using+peptide+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).</li>
<li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li>
<li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li>
<li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li>
<li>Roig, J., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+p21+G+protein-activated+protein+kinase+gamma-PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam.+Horm%22%5BJournal%5D)">Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK.</a> Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).</li>
<li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+%28caspase+3%29.+Effects+of+autophosphorylation+on+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li>
<li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+accurate+mass+measurement+%28%2B%2F-+10+ppm%29+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS%2FMS+and+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

זיהוי פפסין-מתעכל שברי הוא שלב קריטי של הניסוי חילופי H / D. זיהוי שגוי של הפפטיד יכול להוביל למסקנה שגויה. Pak2 פפסין, הוא מתעכל eluted דרך טור הפוך שלב HPLC C18 כדי לקבל רקע נקי. בניסויים שלנו, סך של 40 שברים נאספו נתונים MALDI-TOF. פפטידים מרובות ניתן לזהות בכל אחד החלקים. פפטידים היו נתונים טנדם ספקטרומטריית מסה (Q-TOF MS / MS ו oMALDI MS / MS) כדי לזהות רצפים שלהם. ספקטרום MS / MS של פפטיד צריך לפחות שלוש יונים מוצר כדי לאשר את הזיהוי של הפפטיד. סייר נתוני התוכנית 4.0 המחשב (Applied Biosystems) מבצעת את תיקון הבסיס הראשוני סינון רעש. כל הספקטרום צריך להיות מכויל מבוסס על שתי פסגות רצף. אנו לכייל ספקטרום שלנו על ידי המסה התיאורטית של מ undeuterated / z שהם 923.45 ו - 1697.84. Tהוא דיוק המוני אחרי כיול יכול להגיע 10 עמודים לדקה. עם deuteration, מונו איזוטופ עשוי לעבור מסה גבוהה יותר. מגביר צעד לפירוק היחסים הללו כדי m / z הניב את ההמונים משופרת הקשורים deuteration. עוצמות השיא של המעטפה המונית לא ישפיע על רמת deuteration. עם זאת, עוצמות השיא של פסגות איזוטופי במעטפה מסה מסוימת הם קריטיים לחישוב מסת הממוצע. הצעד הראשון של החישוב של deuteron שולבו היא הפחתת מסת פפטיד של המדגם הלא deuterated מן המדגם deuterated. שלושה גורמים אחרים, דילול D 2 O, deuterons שיורית רשתות לוואי החליפין לאחור, יהיה צורך לשקול נוספת בחישוב (איור 1). דילול 2 O D הוא גורם לדילול של D 2 O לאחר ערבוב המדגם ו-D 2 O חיץ ליזום את H / D החליפין. Deuteron שיורי (4.5%) ב שרשראות צד של עכלן לעיכולפפטידים עורך צריך להיות מופחתים. בחזרה לבורסה הוא אובדן בלתי נמנעת של deuteration בכל פפטידים deuterated ו-עכלן מתעכל בתהליך מדידה המונית. הפפטיד נגיש ממס ביותר (m / z = 1105.60) אחרי שעה של H-24 / D חילופי מייצג אזור deuteration מלא. מספר deuteron משולבים עבור כל אחד פפטידים ההבדל בין centroid של פפטידים deuterated ולא deuterated פפטי Pak2. הפפטיד ביותר deuterated ביותר מ / z 1105 נבחרה לייצג deuteration מלא כאשר Pak2 היה 24 שעות של H / D החליפין. יחס חליפין חזרה חושבה לפי מספר deuteron בפועל שולבו ב 24 שעות של H / D חילופי מחולק כל האתרים חליפי אפשרי פפטיד m / z 1105.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> אלדריץ&#39; </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> PE Biosystems </td><td> וויאג&#39;ר STR DE </td><td></td></tr><tr><td> Q-TOF המוני ספקטרומטר </td><td> Q-TOF Ultima-Global </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QSTAR XL oMALDI MS / MS </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Data Explorer 4.0 תוכנת מחשב </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr&gt; </tbody></table>

אמיד מימן / דאוטריום exchange &amp; maldi-tof המוני ספקטרומטריית ניתוח של הפעלת pak2

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

חילופי אמיד מימן / דאוטריום (H / D החליפין) יחד עם ספקטרומטריית מסה כבר בשימוש נרחב על מנת לנתח את הממשק של אינטראקציות בין חלבונים, שינויי קונפורמציה בחלבון, הדינמיקה חלבון וחלבון-אינטראקציות ליגנד. H / D החליפין על עמדות אמיד עמוד השדרה נוצל כדי למדוד את שיעורי deuteration של מיקרו אזורים בחלבון על ידי ספקטרומטריית מסה 1,2,3. הרזולוציה של שיטה זו תלויה העיכול פפסין של החלבון deuterated עניין לתוך פפטידים, כי בדרך כלל בטווח 3-20 שאריות. למרות ההחלטה של ​​H / D חילופי נמדד על ידי ספקטרומטריית מסה נמוכה יותר ברזולוציה שאריות אחד נמדד לפי שיטת Heteronuclear יחיד קוונטית (HSQC) קוהרנטיות של התמ&quot;ג, המדידה ספקטרומטריית מסה ב-H / D החליפין אינו מוגבל על ידי גודל של חלבון 4. H / D החליפין מתבצע בתמיסה מימית אשר שומרת קונפורמציה בחלבון. אנו מספקים שיטה utilizes MALDI-TOF לגילוי 2, במקום HPLC / ESI (יינון electrospray)-MS מערכת 5,6. MALDI-TOF מספק נתונים מדויקים עוצמת המסה של פפטידים של חלבון מתעכל, בכל מקרה זה חלבון קינאז Pak2 (המכונה גם γ-Pak). Proteolysis של 2 פאק מתבצע העיכול פפסין מקוון. זו שיטה חלופית, כאשר המשתמש אין גישה לעמודה HPLC ו עכלן המחובר ספקטרומטריית מסה, או כאשר העמודה עכלן על HPLC אינו תוצאה של המפה לעיכול אופטימלי, למשל, בכבדות דיסולפיד-מלוכדות מופרש phospholipase 2 (SPLA 2). ניצול שיטה זו, אנו מצליחים לעקוב שינויים ברמת deuteration במהלך ההפעלה של Pak2 ידי מחשוף 3 caspase ו autophosphorylation 7,8,9.

MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה נוצל בהצלחה כדי לפקח על חילופי אמיד מימן / דאוטריום בהפעלת חלבון kinase Pak2.

אמיד מימן / דאוטריום Exchange &amp; MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ניתוח של הפעלת Pak2

חילוף מימן/דאוטריום של עמيدات (H/D exchange) בשילוב עם ספקטרומטריית מסות שימש באופן נרחב לניתוח של ממשק בין חלבונים לחלבונים...

ניסוי זה מדגים כיצד להשתמש בספקטרומטריית מסות כדי לנטר חילופי מימן-דאוטריום הקשורים לחלבון. שינויים מבניים המובילים למצבי אקטיבציה מתבצעים תחילה על ידי ביקוע של Protein Kinase PAC2 באמצעות Caspase 3, ולאחר מכן הפעלה של PAC2 על ידי אוטופוספורילציה תוך שימוש ב-ATP כסובסטרט; כשלב שני, יש לבצע עיכול של PAC2 באמצעות Pepsin ולנתח את פרגמנטים של PAC2 באמצעות ספקטרומטריית מסות טנדם. לאחר מכן, יש לנתח את דפוסי חילופי המימן-דאוטריום של PAC2 באמצעות ניטור של רמות הדאוטריום בכל פרגמנט של PAC2. קביעת הרמה המדויקת של חילופי מימן-דאוטריום באמצעות ניתוח נתונים מספקת תובנות חשובות לגבי ביקוע על ידי Caspase 3 ואוטופוספורילציה של PAC2.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות הנוגעות לדינמיקה של חלבונים, כגון שינויים קונפורמציוניים בחלבון, אינטראקציות בין חלבון לליגנד ואינטראקציות בין חלבון לחלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ספקטרומטריית מסות LCQ עם חילופי HD, הוא מכשירתי. הליך זה אינו דורש ספקטרומטריית מסות המחוברת ל-HPLC לצורך ניתוח תוצאות חילופי HD, והוא פשוט לתפעול לצורך פיצול של 0.6 micrograms של PAC two.הוסיפו caspase three והדגירו את התגובה בטמפרטורה של 34 °C למשך 30 דקות. ודאו את נוכחות ה-PAC two ואת הפירוק המלא של PAC two על ידי ניתוח התוצרים ב-SDS page. עבור תגובת ההפעלה, הוסיפו את PAC two המפורק ל-20 µL של activation buffer B והדגירו בטמפרטורה של 34 °C למשך 30 דקות.השתמש ב-SDS page כדי לאשר אוטו-פוספורילציה על ידי נדידה של מקטעי P 34 ו-P 27. ראשית, שטוף את חרוזי ה-aro המצומדים לפורין פעמיים ב-1 mL של 0.1% Trifluoroacetic acid. דלל 2 µL של 10 mg/mL Pack two ב-100 µL של 0.1% TFA, הוסף 30 µL של חרוזי aro מצומדי פורין שטופים והדגר למשך חמש דקות.המשך לאיזון עמודת H-P-L-C-C 18 במצב פאזה הפוכה עם 0.1%TFA ב-pH 2.5. כעת טען את ה-Pepin Digest ודלל באמצעות גרדיאנט ליניארי של 100 דקות. אסוף פרקציות מדי שתי דקות לאחר ייבוש פרקציות ה-HPLC באמצעות speed VAC reus.השעה את הדגימות בחמישה µL של aceto nitrile ו-0.1% TFA ב-pH 2.5. כסריקה ראשונית, נתח כל פרקציה לאיתור פפטידים באמצעות moldy לכל הפרקציות המכילות פפטידים.זהו את הפרגמנטים באמצעות ספקטרומטריית מסה בטור (tandem mass spectrometry). השתמש בפונקציית MS product ב-protein prospector כדי להשוות בין יוני הבת לבין יחסי ה-MZ התאורטיים המבוססים על הרצף הראשוני של PAC two. ראשית, בצע הרגלה (equilibrate) לכל התמיסות והריאגנטים עבור החלפת מימן-דאוטריום.התחל את תהליך חילוף המימן-דאוטריום על ידי הוספת 18 µL של בופר D₂O ל-2 µL של 10 mg/mL. Pack 2, בצע את התגובות בשלוש חזרות לאורך סדרת זמנים. עצור את תגובת חילוף המימן-דאוטריום באמצעות 180 µL של 0.1% TFA קר מאוד ב-pH 2.2.כעת חלקו מנות (aliquots) של 100 µL של מימן דאוטריום. העבירו שתי מנות לכל 30 µL של חרוזי אגרגט מצומדים של pepin מופעל. דגרו עיכול pepin זה על קרח למשך חמש דקות.ערבוב ב-Vortex כל 30 שניות מסתיים ביעילות על ידי סבב צנטריפוגה להסרה מהירה של ה-Pepin מהתגובות של העיכול. הקפיאו את הדגימות בחנקן נוזלי עד לביצוע האנליזה. הכינו את המטריקס ואחסנו בטמפרטורה של 0 °C, והפשיתו חלקית כל דגימה במהירות.ערבבו מיקרוליטר אחד של דגימה עם מיקרוליטר אחד של מטריצה, ולאחר מכן טפטפו על לוחית מטרה בטמפרטורה של 4 °C כ-30 שניות לפני הניתוח. הפעילו ואקום בינוני על הלוחית לייבוש. הנקודות ימשיכו לצבור ספקטרומי מס בממוצע של 100 סריקות בשתי דקות.המשך בשימוש בתוכנת המחשב Data Explorer 4.0 כדי לחשב את משך הזמן של כל פרגמנט. לאחר מכן, חשב את החילוף ההפוך (back exchange) בהתבסס על היחס בין הכמות המוטמעת בפועל לאחר 24 שעות של חילוף מימן-דאוטריום לבין כל האתרים הניתנים לחילוף, שהם האמידים של השלד (backbone amides), למעט האמיד הקצבי. בדוגמה זו, הפירוק והפוספורילציה העצמית של CASP Bay מאומתים באמצעות צביעת Coomassie של SDS-PAGE.PAC2 הבלתי מזוחרפת והלא-פעילה מופיעה כפס בודד של 58 kilodaltons. פיצול של PAC2 הוא מלא ומניב שני מקטעים, P27, הדומיין הרגולטורי, ו-P34, הדומיין הקטליטי, לאחר אוטו-זרחון. נדירותם של P27 ו-P34 שעברו אוטו-זרחון מראה חפיפה בג'ל החלבונים בשל ההאטה בנדירות של מקטע P27 המזוחרף באופן מלא בהשוואה ל-PAC2 שאינו מזוחרף.ספקטרום מסה זה מציג מהלך זמן של שילוב דאוטריום עבור PAC שני שאינו פעיל. שיאו של m/z 1697.85 מורכב ממספר שיאי איזוטופים, כפי שניתן לראות מהסטה של מעטפת המסה. לאורך זמן, הקו המקווקו האדום מצביע על הממוצע של מעטפת המסה, וההסטה של מעטפת המסה מראה את משך הזמן של פפטיד לאחר שהושג שליטה בו.ניתן להשלים טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. זכרו כי עבודה עם חנקן נוזלי עלולה להיות מסוכנת ביותר, לכן יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון יצירת חור במכסה של מבחנת EOL בנפח 1.5 ml לפני הכנסתה לחנקן נוזלי.

amide-hydrogendeuterium-exchange-maldi-tof-mass-spectrometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

קינאז leucine חזור ריץ' 2 הוא קינאז multidomain גדול, מוטציות שהן הגורם הגנטי השכיח ביותר של מחלת פרקינסון. ניתוח של פעילות קינאז של החלבון הזה הוכיחה להיות כלי חיוני בהבנת הביולוגיה תפקוד של חלבון זה. במאמר...

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

קונפורמציה בחלבון ודינמיקה הן מפתח להבנת הקשר בין מבנה חלבון ותפקודו. חילופי מימן יחד עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה הוא שיטה תכליתית כדי ללמוד את הדינמיקה קונפורמציה של חלבונים כמו גם באפיון אינטראקציות החלבון ליגנד וחלבונים, כוללים ממשקי מגע ואפקטי allosteric.

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור והאפיון של קומפלקסי חלבוני צמח. אנו מראים כי על ידי immunoprecipitating חלבון יחיד בתוך מתחם, כדי שנוכל לזהות לאחר translational השינויים שלה והשותפים באינטראקציה שלה.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

סינתזות Lanthipeptide לזרז תגובות מרובות צעדים במהלך הביוסינתזה של מוצרים טבעיים פפטיד. כאן, אנו מתארים רציף, מלמטה למעלה, מימן-deuterium חילופי ספקטרומטריית מסה (HDX-MS) זרימת עבודה שניתן להפעיל כדי ללמוד את הדינמיקה הקונפורמטיבית של סינתטאז lanthipeptide, כמו גם אנזימים דומים אחרים המעורבים ביוסינתזה של מוצר טבעי פפטיד.

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

תיוג איזוטופי משולב ותיוג איזובארי (cPILOT) היא אסטרטגיית מולטיפלקס מדגימה משופרת המסוגלת להגדיל את מספר הדגימות שניתן לנתח בו-זמנית עם תגיות איזובריות זמינות. התאגדות של פלטפורמה רובוטית הגדילה מאוד את התפוקה הניסיונית, הרבייה והדיוק הכמותי.

מולטיפלקס לדוגמה אוטומטי באמצעות תיוג איזוטופי משולב מקדים ותיוג איסוברי (cPILOT)

היכולת להעריך מעורבות היעד על ידי מעכבי מועמד בתאים שלמים היא קריטית לגילוי סמים. פרוטוקול זה מתאר 384 גם פורמט התא סלולרי תרמי shift assay כי אמין מזהה מעורבות היעד הסלולרי של מעכבים מיקוד SHP2 מסוג פראי או גרסאות oncogenic שלה.

הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי SHP2 (PTPN11) מעכבי פוספטאז

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעשרת פוספטזות פוספופרוטאין אנדוגניות והחלבונים המתקשרים ביניהן מתאים ורקמות וזיהוי וכימות שלהם על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

למדו כיצד לנטר החלפת מימן/דאוטריום בהפעלת קינאז חלבון Pak2 באמצעות ספקטרומטריית מס MALDI-TOF. השיטה מספקת תובנות לגבי דינמיקה מבנית ושינויים קונפורמציוניים בחלבונים.

אמיד מימן / דאוטריום Exchange & MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ניתוח של הפעלת Pak2

גלה סרטונים נוספים