Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

סרטון זה מתאר שיטה לייצור ושימוש במיקרו-מערך פולימרי באמצעות טכניקת פילמור פוטו על השבב. שקופיות הזכוכית הראשונות מצופות בפולי הידרוקסיאתיל, מתאקרילט או FEMA כדי לייצר מצע חיבור נמוך. מונומרים מעורבבים ביחסים משתנים כדי לייצר ספרייה של פתרונות מונומר.

התמיסות מועברות לפורמט שקופיות זכוכית באמצעות מכשיר הדפסה רובוטי ונרפאות בקרינת UV. המונומר מתפלמר והממס מופק בוואקום. לאחר אפיון פני השטח בתפוקה גבוהה, ניתן להשתמש במיקרו-מערכים לסינון ביצועי חומרים כגון מבחני התקשרות חיידקים.

ניתוח נתוני ההתקשרות הוא צעד לקראת גילוי של חומרים ביולוגיים חדשים המדגישים את התועלת של פורמט המיקרו-מערך הפולימרי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות בהן נחקרת התגובה הביולוגית של חומרים שונים, חומר אחד בכל פעם הוא סינון מקביל של מאות חומרים, הניתנים למניפולציה בקלות בשקופית אחת. ניתן להתאים טכניקה זו בקלות למבחנים ביולוגיים שונים, כגון סינון חומרים העמידים בפני התקשרות חיידקים או תומכים בהתרחבות של תאי גזע.

טכניקה זו סייעה בגילוי חומרים עם יישומים פוטנציאליים לתמיכה בהרחבת תאי גזע חזקים לרפואה רגנרטיבית. אנו גם נרגשים מאוד מהגילוי האחרון של חומרים העמידים בפני היצמדות חיידקים עם פוטנציאל להפחית את התרחשותם של זיהומים הקשורים למכשירים רפואיים. בדרך כלל, משתמשים חדשים בשיטה יתקשו לייעל את התנאים הנדרשים להדפסת מיקרו-מערך מכיוון שקשה לחזות את התנאים האופטימליים.

טעות אפילו בפרטים קטנים עלולה להוביל למערכים שאינם שמישים. כמו כן, חיוני לשקול באיזה זן חיידקים והמצב התרבותי ישתמשו מכיוון שהתקשרות ומורפולוגיה של ביופילם הם ספציפיים למינים ולמדיה ולכן יכולים להשתנות במידה ניכרת. כאן אנו משתמשים באירוגן כאורגניזם מודל והמדיום המוגדר כימית לבדיקת התקשרות מבוקרת היטב.

משתפי הפעולה שלנו ב-MIT העלו לראשונה את הרעיון לשיטה זו באמצעות השוואה עם מיקרו-מערכי DNA וחלבונים. אלה מבוססים היטב לחקר המרחבים הקומבינטוריים הביולוגיים שלהם. דן ובוב הבינו שקיים מרחב קומבינטור כימי דומה שצריך לחקור מחומרים המדגימים הליך יהיו עמיתי הפוסט-דוקטורט של אנדרו הוק וצ'ן צ'אנג בפרויקט הממומן על ידי הנאמנות המבורכת שלנו התחל הליך זה על ידי הכנת רקע התקשרות נמוך.

זהו משטח שמתנגד להתקשרות של ביומולקולות, כמו חלבונים ותאים. שקלו שני גרם של פולי הידרוקסיאתיל מתאקרילט או FEMA לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. לאחר מכן הביאו את הנפח עד 50 מיליליטר עם 95% אתנול במים.

לאחר מכן הנח את הצינור בטור למשך כ-24 שעות או עד שה-FEMA מסיס לחלוטין, והחזק את אור הזכוכית בפינצטה. טובלים בזכוכית פונקציונלית אפוקסי. החלק לתוך תמיסת FEMA כדי לערבב את כל המוצרים מלבד חמישה מילימטרים.

קבוצות האפוקסי יוצרות קשרים קוולנטיים עם ציפוי FEMA. החלק הלא מצופה יכול לשמש כבקרה חיובית לאורך תקופה של שנייה אחת. משוך את השקופית מתמיסת FEMA, ולאחר מכן הפוך את השקופית והנח אותה במצב כמעט אופקי לייבוש.

לאחר שהמגלשה יבשה, הנח אותה במחזיק שקופיות. השאירו את המגלשות המצופות FEMA בתנאים אטמוספריים למשך שבוע כדי לאפשר אידוי מלא של הממס. לאחר מכן, כדי להפוך את תמיסות המונומר, פיפטה חמישה מיקרוליטר של תמיסת יוזם צילום ו -15 מיקרוליטר של מונומרים אקרילט מסיסים של דימתילפורממיד לתוך צלחת מקור של 384 בארות.

נפח כולל של 20 מיקרוליטר אידיאלי להיווצרות נקודתית. כעת, לאחר שנוצרו הפתרונות, נעשה שימוש ברובוט הדפסת מגע עם שלב X, Y, Z ליצירת המיקרו-מערך. הרובוט משתמש בפינים מחורצים בקוטר 220 מיקרומטר המכילים חריצים המתפקדים כמאגרים להעברת תמיסה.

התחל בהנחת הפינים ומחזיק הסיכה בטור המכיל די כלורו מתאן למשך 10 דקות. לאחר מכן, לאחר שאפשרת לסיכות להתייבש, חבר מחדש את המחזיק לראש ההדפסה. לאחר מכן, טען את הסיכות למחזיק.

לאחר מכן טען 10 שקופיות זכוכית לספיגה ושקופיות מצופות FEMA לתוך הרובוט. בדרך כלל, שלושה מערכי שכפול מודפסים על כל שקופית. לאחר מכן, באמצעות צינורות, חבר את תחנת הכביסה של הרובוט לבקבוק המכיל 2.5 ליטר דימתילפורממיד טרי.

טען את הצלחת המכילה את תמיסת המונומר לתוך הרובוט. מלאו את כל תא הרובוט בארגון כדי להפחית את רמת החמצן מתחת ל-2000 PPM. ברמה נמוכה זו אין להרוות רדיקלי פילמור על ידי חמצן.

באמצעות מכשיר לוויסות לחות, הגדר את הלחות שתישמר בין 30 ל-40% בתוך תא הרובוט, כולל לחות מאפשרת ל-FEMA להתנפח, מה שמאפשר לפולימר שנוצר לחדור לשכבת ה-FEMA ולהילכד פיזית על פני השטח. כדי להתחיל את ריצת ההדפסה, לחץ על עבור לתוכנה עם המחשב המשויך. לאחר מכן הפינים יורדו לתמיסות המונומר במהירות של 25 מילימטרים לשנייה.

לאחר מכן הם יוחזקו בתמיסה למשך 2.5 שניות וייסוגו במהירות של 25 מילימטרים לשנייה. לאחר מכן, קצה הסיכה בא במגע עם שקופיות FEMA המחלקות כ-2.4 ננוליטר של תמיסה מחלק השמיכה של הסיכה. זמן המגע הכולל עבור כל מגע הוא 10 מילישניות ומהירות הגישה והנסיגה היא 175 מילימטרים לשנייה.

לאחר מכן הפינים נמחקים על ידי מגע חוזר ונשנה עם שקופיות ספיגת הזכוכית כדי להסיר את תמיסת המונומר מהחלק החיצוני של הסיכה. רצף הספיגה המשמש מורכב מ-33 מגעים עם מגלשת זכוכית נקייה. ארבעת המיקומים הראשונים ייצרו 10, 5, 4 ושלושה מגעים בהתאמה.

ארבעת המיקומים הבאים ייצרו שני אנשי קשר, ושלושת המיקומים האחרונים ייצרו מגע אחד לאחר ההדפסה. הסיכות נשטפות באמבט זרימה של DMF בתסיסה למשך 30 שניות. במקביל, השקופיות המודפסות מוקרנות במקור UV 365 ננומטר קצר גל בצפיפות של 30 מילי-וולט לסנטימטר בריבוע.

לאחר השלמת הכביסה וההקרנה, השקופית הבאה מודפסת. אם ההדפסה נראית מוצלחת, הקרינו את המערכים ב-UV ב-365 ננומטר למשך 10 דקות נוספות. המערכים המודפסים הטריים מוכנסים לתנור ואקום המוגדר לפחות מ-50 מילי-סיורים למשך שבוע כדי להסיר ללא פולימר, מונומר וממס לאחר הדפסה ומיצוי ואקום.

ניתן להעריך את הצלחת הפילמור של כתמי פולימר על ידי מיקרוסקופ אור פשוט לזיהוי מורפולוגיות כתמים חריגות, בדרך כלל כתמים צריכים להיראות עגולים ואחידים כפי שמוצג באיור זה משמאל. הסיבה הסבירה לשינוי בגיאומטריה היא סיכה פגומה או לא נקייה או מזהם אבק בתמיסות המונומר. אם זה קורה, יהיה צורך לחזור על התהליך עבור מספר קטן של שילובי מונומר.

ניתן לראות כתמים מעוותים, למשל, נקודה מרכזית עם לוויין של כתמים קטנים המוצגים מימין או צורת ביצה מטוגנת שבה יש נקודה מרכזית על גבי נקודה גדולה ושטוחה יותר. זה עשוי להיגרם על ידי הפרדת פאזה לפני ההדפסה, המתייחסת להבדלים בצמיגות, תנודתיות הידרופיליות או מתח פנים של המונומרים, ומצביע על כך ששילוב המונומרים אינו תואם לפורמט זה. מיפוי כימי נוסף של כתמים פולימריים הוא גם שלב בקרת איכות חשוב ולעיתים הכרחי לקביעת התפלגות הכימיה של החומרים על פני הכתמים ואפיון פני השטח של המערך בתפוקה גבוהה או HTSC של המיקרו-מערכים שנוצרו.

שימוש בטכניקה זו מאפשר גם לתאם את הביצועים הביולוגיים עם תכונות פיזיוכימיות. זה מאפשר לחקור אינטראקציה ביולוגית של חומרים. HTSC עושה שימוש במדידות זווית מגע במים, זמן טיסה, ספקטרומטריית מסה של יונים משניים, מיקרוסקופ כוח אטומי וספקטרוסקופיה אלקטרונית צילום רנטגן.

בפרט, TOF sims מספק ניתוח עשיר מבחינה כימית של הדגימה שניתן להשתמש בו כדי לתאם את תגובת התא עם חלק מולקולרי. במקרים מסוימים ניתן לחזות את הביצועים הביולוגיים. ספקטרום ה-TOF SIM מדגים את התלות הכימית של אינטראקציה של חומר ביולוגי ומודיע על פיתוח חומרי HI.

לאחר אפיון משטח המיקרו-מערך הפולימרי, ניתן להשתמש בו לחקר אינטראקציות ביולוגיות. כאן אנו מדגימים את השימוש במיקרו-מערך בביצוע בדיקת התקשרות חיידקית. התחל בחיסון 10 מיליליטר LB עם מושבה אחת של GFP המסומנת pseudomonas.

אירוגן גדל ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות של 200 סל"ד למשך הלילה. מדוד את ה-OD 600 של תרבית חיידקים בן לילה ודלל את התרבית ל-OD 600 של 0.01 ב-15 מיליליטר של RPMI 1640. בינתיים, שטפו את מגלשות המערך ועיקרו מים מזוקקים למשך 10 דקות כדי להסיר את כל הרכיבים הניתנים להמסה מהמערכים, כגון לא מפולימר, מונומר, כל הרצועות והממס.

לאחר מכן יבש את השקופיות בארון זרימת אוויר. לאחר מכן, הניחו את שקופיות המערך השטוף בצלחת פטרי נקייה ועיקרו אותן UV למשך 10 דקות. כאשר תרבית החיידקים מוכנה, העבירו את השקופית עם המערך לצלחת פטרי והוסיפו 15 מיליליטר מאמצעי ה-RPMI 1640 המחוסן.

מניחים שקופית מערך נוספת בצלחת פטרי שנייה ומוסיפים 15 מיליליטר RPMI 1640 סטרילי כבקרה. דגרו את הכלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות עם ניעור ב-60 סל"ד לאחר הדגירה. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם 15 מיליליטר PBS סטרילי למשך חמש דקות ב-100 סל"ד.

לאחר מכן שטפו את השקופיות פעמיים עם 15 מיליליטר מים מזוקקים סטריליים כדי להסיר את מלח הפוספט. לאחר הכביסה. הניחו למגלשות להתייבש באוויר בארון זרימת אוויר.

לאחר שהמגלשות יבשות. יש לקרוא אותם על ידי סורק פלורסנט בהקדם האפשרי כדי למנוע דעיכה של GFP באמצעות טכנולוגיית ההדמיה והתוכנה המתאימות. הקרינה עקב התקשרות חיידקים מחושבת על ידי הפחתת הקרינה מבקרת המדיה בלבד מהדגימה המחוסנת כדי לזהות חומרים העמידים בפני הידבקות חיידקים.

נוצרו מיקרו-מערכים ובדיקות הידבקות חיידקים בוצעו על פי השיטות המתוארות בסרטון זה. כפי שניתן לראות כאן, המיקרו-מערך הפולימרי מכיל חומרים בעלי הידבקות חיידקית נמוכה, בעלי פלואורסצנטיות נמוכה והדבקה חיידקית גבוהה, בעלי פלואורסצנטיות גבוהה. שלושת המערכים המוצגים כאן הם שכפולים כאשר ערכי הקרינה משלושת השכפולים מחושבים בממוצע ומוצגים כייצוג תלת מימדי.

כפי שמוצג כאן, פרשנות חזותית כמותית מפושטת. סולם העוצמה מימין מייצג את הערכים של נתוני הקרינה. ברמה הבסיסית, זיהוי החומרים בעלי הקרינה הנמוכה מספק אמצעי לזיהוי מהיר של חומרים הממלאים יישום ביולוגי ספציפי, כגון עמידות בפני התקשרות חיידקים.

עם זאת, ניתן לשלב תוצאות אלה גם עם HTSC כדי לחקור מתאמים בין תכונות מסוימות של החומרים לבין הביצועים הביולוגיים שלהם. ניתוח זה יכול להבהיר את יחסי המבנה, התפקוד, ובכך לזהות את המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציה הביולוגית עם חומרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להתכונן ולהדפיס מיקרו-מערך פולימרי וגם לקבל תובנה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש במיקרו-מערכי הפולימר כדי לחקור את התגובה החיידקית לחומרים.

לאחר השליטה, ניתן להדפיס מערך מיקרו פולימרי תוך יומיים אם מבוצע כהלכה. הכנת המונומרים אורכת כיום אחד והדפסת המערך אורכת כשש שעות. בדיקת החיבור החיידקי אורכת חמישה ימים, מה שמגדיל את הזמן לגידול תרבית הכיסוי כאינוקולר בדגירת אור המיקרו-קרני בתרבית החיידקים למשך 72 שעות וזיהוי היער והאות באמצעות סורק מיקרו-קרניים, אוקיי, בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על הסיכה ומחזיקי הסיכות נקיים.

זה מאוד מתסכל אם באמצע הריצה הסיכה נתקעת במצב זקוף וכבר לא יכולה ליצור מגע עם המשטח מכיוון שהסיכה או מחזיק הסיכה לא נוקו מספיק. אל תשכח שעבודה עם DMF ומונומרים רעילים עלולה להיות מסוכנת ביותר ואמצעי זהירות כגון מיצוי תמיד צריכים להיכלל בהליך.