Name: Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: למד ליצור מערכי מיקרו פולימרים לסקרינג ביולוגי בקצב גבוה באמצעות פוטופולימריזציה על שבב. השיטה מאפשרת זיהוי חומרים העמידים בפני הידבקות חיידקים ותומכים בהתרחבות תאי גזע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון של קרן Wellcome הוא הודה בחביבות (המענק המספר 085245/Z/08/Z). נוטינגהאם ננוטכנולוגיה ואת המרכז הנו הוא הודה בחביבות למתן גישה למערכת ראמאן ולסוכנות לפיתוח מזרח המידלנדס למימון ציוד זה.

<ol><li>Hook, A. L., Anderson, D. G., Langer, R., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+methods+applied+in+biomaterial+development+and+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">High throughput methods applied in biomaterial development and discovery.</a> Biomaterials. 31, 187-198 (2010).</li>
<li>Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter-scale+synthesis+of+arrayed+biomaterials+and+application+to+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 22, 863-866 (2004).</li>
<li>Mei, Y., Saha, K., Bogatyrev, S. R., Yang, J., Hook, A. L., Kalcioglu, Z. I., Cho, S. W., Mitalipova, M., Pyzocha, N., Rojas, F., Van Vliet, K. J., Davies, M. C., Alexander, M. R., Langer, R., Jaenisch, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+development+of+biomaterials+for+clonal+growth+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 9, 768-778 (2010).</li>
<li>Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonising+new+frontiers-microarrays+reveal+biofilm+modulating+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers.</a> Journal of Materials Chemistry. 21, 96-101 (2011).</li>
<li>Yang, J., Mei, Y., Hook, A. L., Taylor, M., Urquhart, A. J., Bogatyrev, S. R., Langer, R., Anderson, D. G., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+surface+functionalities+that+control+human+embryoid+body+cell+adhesion+revealed+by+high+throughput+surface+characterization+of+combinatorial+material+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polymer surface functionalities that control human embryoid body cell adhesion revealed by high throughput surface characterization of combinatorial material microarrays.</a> Biomaterials. 31, 8827-8838 (2010).</li>
<li>Urquhart, A. J., Anderson, D. G., Taylor, M., Alexander, M. R., Langer, R., Davies, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+surface+characterisation+of+a+combinatorial+material+library%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">High throughput surface characterisation of a combinatorial material library.</a> Advanced Materials. 19, 2486-2491 (2007).</li>
<li>Taylor, M., Urquhart, A. J., Zelzer, M., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoliter+water+contact+angle+measurement+on+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Picoliter water contact angle measurement on polymers.</a> Langmuir. 23, 6875-6878 (2007).</li>
<li>Urquhart, A. J., Taylor, M., Anderson, D. G., Langer, R., Davies, M. C., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOF-SIMS+analysis+of+a+576+micropatterned+copolymer+array+to+reveal+surface+moieties+that+control+wettability%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TOF-SIMS analysis of a 576 micropatterned copolymer array to reveal surface moieties that control wettability.</a> Analytical Chemistry. 80, 135-142 (2008).</li>
<li>Hook, A. L., Yang, J., Chen, X., Roberts, C. J., Mei, Y., Anderson, D. G., Langer, R., Alexander, M. R., Davies, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylate+polymers+with+hydro-responsive+topography%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Acrylate polymers with hydro-responsive topography.</a> Soft Matter. 7, Forthcoming 7194-9197 (2011).</li>
<li>Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+cellular+morphology+and+biocompatibility+using+polymer+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays.</a> Biomedical Materials. 3, (2008).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

microarrays הפולימר שמש בהצלחה לגילוי חומרים חדשים על ידי מאה הקרנה של פולימר רומן בבדיקה ביולוגית וזיהוי חומרים &#39;מכה&#39; שלאחר מכן ניתן יהיה להגדיל אותו להתקנים שימושיים. במקרה זה, אפיון פני השטח המתואר יכול להיות מועסק לאחר הבדיקה הביולוגית ובאופן בלעדי על חומרים &#39;מכה&#39; כדי ללמוד את החומרים האלה בפירוט רב יותר. אסטרטגיה זו עשויה להיות עניין אם HTSC אינו זמין לexperimentalist העסקת גישה זו. עם זאת, כדי לנצל באופן מלא microarrays הפולימר ללמוד אינטראקציות ביולוגיות מהותיות כל המערך של מאה חומרים צריכים להיות מנותח לפני מבחנים ביולוגיים באמצעות מתודולוגיות HTSC, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לבחון מגמות כלליות פונקצית מבנה. הדפסת קשר מסתמכת על סיכת המתכת מחליקה למעלה ולמטה בחופשיות בתוך מחזיק הסיכה. ניקיון מחזיק סיכה וסיכה הוא בעל חשיבות עליונה הוא להבטיח עמrinting מתרחש בהצלחה וצריכה להתבצע בקפדנות. לפני תחילת הדפסה להפעיל את התנועה המתאימה של הסיכה בתוך מחזיק הסיכה ניתן לבדוק על ידי ביצוע תרגיל יבש, ללא מונומרים נוכחיים. צעד הניקוי צריך להמשיך עד שתנועת הפין מושגת reproducibly. מחשבה רבה צריכה להיכנס לעיצוב של תערובת מונומר. על מנת לייצר בקלות ספרייה קומבינטורית של פולימרים, מאת קופולימרים נוצרים על ידי ערבוב כמה מונומרים ביחסים שונים. בדרך כלל אנחנו מייצרים 576 ספריות חברות כמו זו יוצרת 24 24 מערך x, אשר מתאימה לגיאומטריה של שקופית זכוכית. על מנת לייצר ספריית קומבינטורית שבוחנת את חלל קומבינטורית ביותר בשיטה הקלה ביותר היא לערבב 24 מונומרים Pairwise ב2:1. לחלופין, ההכללה הדרגתית הלחנה בתוך המערך שימושית למאפשרות תצפיות של מגמות, אשר מאפשרת קומפוזיציות מונומר אופטימליות להיות דetermined. כדוגמה ל22 מונומרים זה יכול לשמש כמרכיב הראשון בתערובת השיתוף מונומר שמדולל ברצף עם 1 של 6 רכיבים 2. אם 5 דילולים משמשים, למשל ערבוב המרכיבים הראשונים ושניים ביחסים של 90:10, 75:25, 50:50, 25:75 ו10:90, זה יביא 488 פתרוני קופולימר ייחודיים. כדי להביא את הכל עד 576, משכפל את homopolymers של מונומרים משמשים יכול להיות הציג, אשר לעתים קרובות הוא מדגם התייחסות חשובה. 576 פתרוני מונומר צריכים להימכר לתוך 2 384 גם צלחות. לתכנות הרובוט זה יותר קל לנו שתי צלחות זהות מבחינת המיקום של מונומרים, ובכך, את פתרוני מונומר יש לפצל באופן שווה בין שתי צלחות. כמות משמעותית של זמן ניתן לשמור בהכנת צלחות המקור על ידי השימוש בpipettes הרב ערוציים, והעיצוב של צלחות מקור צריך להיות נחוש כדי לנצל את השימוש בpipettes הרב ערוציים. &lt;/ P&gt; כדי להשיג HTSC האוטומטי של מערכי עמדת הנקודה חייבת להיות מיושרת בהצלחה עם מנגנון האפיון. בדרך כלל גובה הצליל של מערך Acrylate הוא 500-1000 מיקרומטר וקוטר נקודת הפולימר הוא 300 מיקרומטר. רוב שלבי XY יש רזולוציה מתחת 10 מיקרומטר, ובכך יש סובלנות נאותה למנגנון אפיון המשטח מהימן לגשת לעמדות המערך פעם אחת את הממדים הנכונים היו כניסה לתוכנת מיצוב המדגם. ההגבלה למיצוב האוטומטי היא למעשה הדפסה המדויקת של המערך. כדי להבטיח הדפסה מדויקת חשוב כדי למנוע תנועה של המצע בשלב ההדפסה או באמצעות שאיבת ואקום או תפסים קפיציים יחד עם שקופיות ממדים מתאימים (שים לב שגם בארה&quot;ב ובאיחוד האירופי שקופית גודל סטנדרטי קיימות). TOF-SIMS הוא טכניקה רגישה מאוד משטח שיצפה בכל זיהום בדגימות. לכן, טיפול חייב להילקח עליוןכדי להימנע ממגע עם פני השטח. דוגמאות יש לטפל רק, אבל פני השטח של עניין לא יצרו קשר איתו, עם כפפות נקיות (רצוי פוליאתילן) ועם פינצטה שאך זה נוקה. אנחנו בדרך כלל לשטוף עם כלורופורם והקסאן. אחסון מדגם לפני המדידות נעשה הכי טוב בבעל מדגם שמחזיק את השקופיות לגזרים, למשל 5 החזיק שקופיות או החזיק שקופיות 20. המערכים נועדו במיוחד כדי להיות תואם עם פורמטים רבים ביולוגיים assay וקריאות, כלומר, המצע משמש הוא שקופית מיקרוסקופ האידיאלי לקרינת סורקים ומיקרוסקופי אור. משמעות הדבר הוא בפורמט מתאים גם לחקר אינטראקציות רבות חומר ביולוגיות. יתר על כן, בפורמט מאפשר מאה חומרים שיוקרו במקביל. זה מאפשר הרבה יותר חומרים שיוקרו מאשר בשיטות מקובלות לפיה כל כימית חומר חדשה שהוקרנו באופן אינדיבידואלי. ההיקף המוגבר לאינטראקציות ביולוגיות מהותיות לאפשרשל להבהרת מנגנונים של אינטראקציות ביולוגיות פני שטח, כמו גם מציאת החומר אופטימלי עבור יישום נתון.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב / הציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג / דגם מספר </td></tr><tr><td> שקופיות אפוקסי </td><td> Genetix </td><td> K2652 </td></tr><tr><td> צור מדפסת </td><td> Biodot </td><td> XYZ3060 פלטפורמה </td></tr><tr><td> סיכת מתכת </td><td> ArrayIt </td><td> 946MP6B </td></tr><tr><td> מכשיר TOF-SIMS </td><td> ION-TOF </td><td></td></tr><tr><td> מכשיר XPS </td><td> קרייטוס </td><td></td></tr><tr><td> האש&quot;ל מנגנון </td><td> Krüss </td><td> DSA 100 </td></tr><tr><td> AFM </td><td> ברוקר </td><td> אייקון ממד </td></tr><tr><td> RPMI-1640 תקשורת סלולרית התרבות </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> SYTO17 </td><td> Invitrogen </td><td> S-7579 </td></tr></tbody></table>

microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של biomaterials

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

ערבוב הוא פעולת יחידה שמשלבת שני רכיבים או יותר לתערובת הומוגנית. עבודה זו כרוכה בערבוב שני זרמי נוזל צמיגים באמצעות מיקסר סטטי באונליין. המיקסר הוא עיצוב מפוצל ולשלב מחדש-שמעסיק זרימת גזירה וextensional להגדיל את קשר interfacial בין הרכיבים. פיצול ולשלב מחדש מיקסר אבטיפוס (SAR) נבנה על ידי יישור סדרה של חיתוך ליזר הדקים פולי (methacrylate תיל) (PMMA) צלחות שנערכו במקום בצינור PVC. ערבוב במכשיר זה מודגם בתמונה באיור. 1. צבע אדום נוסף לחלק מנוזל הבדיקה ומשמש כמרכיב הקטין שהיה מעורב למרכיב העיקרי (לא צבוע). בכניסה למיקסר, השכבה של נוזל המוזרק נותב מחולקת לשתי שכבות כפי שהוא זורם דרך סעיף הערבוב. בכל מקטע ערבוב לאחר מכן, מספר השכבות אופקיות משוכפל. סופו של דבר, זרם אחד של צבע מתפזר באופן אחיד throughout החתך של המכשיר. שימוש בנוזל לא ניוטוני מבחן Carbopol 0.2% ונוזל נותב מסומם של הרכב דומה, ערבוב ביחידה דמיין באמצעות תהודה מגנטית (MRI). MRI היא בדיקה ניסיונית חזקה מאוד של כימיקל מולקולרי וסביבה פיזית, כמו גם מבנה מדגם על סולמות האורך ממיקרון לסנטימטרים. רגישות זו ביאה ליישום רחב של טכניקות אלה כדי לאפיין פיסיים, כימיים ו / או תכונות ביולוגיות של חומרים החלו בבני אדם למזונות עד 1 מדיה נקבובית, 2. הציוד ותנאי שימוש כאן מתאים לנוזלי הדמיה המכילים כמויות ניכרות של התמ&quot;ג הנייד H 1 כמו מים רגילים ונוזלים אורגניים, כוללים שמן. באופן מסורתי MRI נצל מגנטים סופר ניצוח אשר אינם מתאימים לסביבות תעשייתיות ולא ניידים במעבדה (איור 2). התקדמות שחלה באחרונה אניטכנולוגיית מגנט n התירה לבניית נפח גדול מגנטים תעשייתיים תואמים מתאימים לתזרימי תהליך הדמיה. הנה, MRI מספק ריכוזי מרכיבים נפתרו מרחבית במקומות ציריים שונים במהלך תהליך הערבוב. מסמכי עבודה זו בזמן אמת ערבוב של נוזלים צמיגים מאוד באמצעות ערבוב עם יישום למוצרי טיפוח אישיים חלוקתי.

תיאור של ההיווצרות של הפולימר microarray באמצעות טכניקת photopolymerization על שבב. אפיון משטח התפוקה הגבוהה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, מדידות זווית מגע מים, ספקטרוסקופיה Photoelectron רנטגן ושעה של ספקטרומטריית טיסה משנית יון המוני וassay מצורף תא גם תאר.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

גילוי של חומרי ביו-מס (biomaterials) חדשניים המותאמים באופן אופטימלי ליישום ביולוגי ספציפי מושג בקלות באמצעות מערכי מיקרו-פולימרים (polymer microarrays), המאפשרים...

סרטון זה מתאר שיטה ליצירה ולהשמוש במערך מיקרו-פולימרי (polymer microarray) באמצעות טכניקת פוטו-פולימריזציה על שבב. ראשית, שקופיות זכוכית מצופים בשיטת טבילה ב-poly hydroxyethyl methacrylate, או FEMA, כדי לייצר תשתית בעלת קישוריות נמוכה. מונומרים מעורבבים ביחסים משתנים כדי להפיק ספרייה של תמיסות מונומרים.התמיסות מועברות לפורמט של שקופית זכוכית באמצעות התקן הדפסה רובוטי ומקובעות באמצעות הקרנת UV. המונומר עובר פולימריזציה והממס מוסר באמצעות ואקום. לאחר אפיון פני שטח בתושבה גבוהה, ניתן להשתמש במערכי המיקרו-מערכים לסריקת ביצועי חומרים, כגון בדיקות היצמדות חיידקים.ניתוח של נתוני היצמדות הוא שלב לקראת גילוי חומרי ביו-מטריאליים חדשניים, המדגיש את התועלת של פורמט מיקרו-מערך הפולימרים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, שבהן נחקרת התגובה הביולוגית של חומרים שונים באופן רב-שלבי (חומר אחד בכל פעם), הוא הסריקה המקבילית של מאות חומרים, שניתן להפעיל אותם בקלות על גבי שקופית אחת. ניתן להתאים טכניקה זו בקלות למגוון בדיקות ביולוגיות, כגון סריקת חומרים העמידים להיצמדות חיידקים או כאלה התומכים בהתרחבות של תאי גזע.טכניקה זו סייעה בגילוי חומרים בעלי יישומים פוטנציאליים לתמיכה בהתרחבות של תאי גזע פלוריפוטנטיים עבור רפואה רגנרטיבית. כמו כן, אנו נרגשים מהגילוי האחרון של חומרים העומדים בפני היצמדות חיידקים, עם פוטנציאל להפחית את השכיחות של זיהומים הקשורים למכשירים רפואיים. באופן כללי, משתמשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו למטב את התנאים הנדרשים להדפסת מיקרו-מערך (microarray), מכיוון שקשה לנבא את התנאים האופטימליים.טעויות אפילו בפרטים קטנים עלולות להוביל למערכים שאינם שמישים. חיוני גם לשקול באיזה זן חיידקי ובאילו תנאי תרבית נשתמש, כיוון שההיצמדות ומורפולוגיית הביופיל תלויות במין ובמצע, ולכן עשויות להשתנות באופן משמעותי. כאן אנו משתמשים ב-aerogen כאורגניזם מודל ובמצע כימי מוגדר לצורך בדיקת היצמדות מבוקרת היטב.השותפים שלנו מה-MIT הגו תחילה את הרעיון לשיטה זו באמצעות השוואה למערכי מיקרו (microarrays) של DNA וחלבונים. אלו הן שיטות מבוססות לחקר המרחבים הקומבינטוריים הביולוגיים הרלוונטיים. דן ובוב הבינו כי קיים מרחב קומבינטורי כימי דומה שיש לחקור מחומרים המדגימים הליך זה; אנדרו הוק וצ'ן צ'אנג, עמיתים פוסט-דוקטורטורליים בפרויקט שלנו הממומן על ידי Welcome Trust, יבצעו את ההליך. התחילו את הפרוצדורה בהכנת רקע בעל היצמדות נמוכה (low attachment).זהו משטח העמיד להיצמדות של ביו-מולקולות, כגון חלבונים ותאים. שקלו שני גרמים של poly hydroxyethyl methacrylate או FEMA לתוך מבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 milliliter. לאחר מכן, השלימו את הנפח ל-50 milliliters עם 95%ethanol במים.לאחר מכן, הנח את המבחנה באג'יטטור למשך כ-24 שעות או עד שה-FEMA ימוס לחלוטין, תוך כדי החזקת הזכוכית בעזרת פינצטה. טבול זכוכית עם פונקציונליות אפוקסי. החלק אותה לתוך תמיסת ה-FEMA כדי לצפות את כולה למעט חמישה מילימטרים ממנה.קבוצות האפוקסי יוצרות קשרים קוולנטיים עם ציפוי ה-FEMA. החלק שאינו מצופה יכול לשמש כביקורת חיובית למשך פרק זמן של שנייה אחת. הוצא את השקופית מהתמיסת FEMA, לאחר מכן הפוך את השקופית והנח אותה במצב כמעט אופקי לייבוש.לאחר שהשקופית יבשה, הנח אותה במחזיק שקופיות. השאר את השקופיות המצופות ב-FEMA בתנאי atmosfera למשך שבוע כדי לאפשר התאיידות מלאה של הממס. לאחר מכן, כדי להכין את תמיסות המונומר, פפט 5 µL של תמיסת פוטו-איניצ'יטור ו-15 µL של מונומרים מסוג acrylate methacrylate ממיסים ב-dimethylformamide אל תוך פלטת מקור בעלת 384 בארות.נפח כולל של 20 µL הוא אידיאלי ליצירת נקודות. כעת, לאחר שהתמיסות הוכנו, נעשה שימוש ברובוט הדפסה במגע עם במת X, Y, Z ליצירת המיקרו-מערך. הרובוט משתמש בפינים מחורצים בקוטר של 220 µm, המכילים חריצים המשמשים כמאגרי תמיסה להעברה.התחילו בהנחת הפינים ומחזיק הפינים בתוך כלי המכיל di chloro methane למשך 10 דקות. לאחר מכן, לאחר ייבוש הפינים, חברו מחדש את המחזיק לראש ההדפסה. לאחר מכן, הכניסו את הפינים אל המחזיק.לאחר מכן, טען לרובוט 10 שקופיות זכוכית עבור blotting ושקופיות מצופות FEMA. בדרך כלל מודפסות שלוש מערכים חוזרים על כל שקופית. לאחר מכן, השתמש בצינוריות כדי לחבר את תחנת השטיפה של הרובוט לבקבוק המכיל 2.5 liters של dimethylformamide טרי.הטענו את הפלטה המכילה את תמיסת המונומר לתוך הרובוט. מלאו את כל תא הרובוט ב-Argonne כדי להפחית את רמת החמצן אל מתחת ל-2000 PPM. ברמה נמוכה זו, רדיקלי הפולימריזציה לא אמורים להיות מושמדים על ידי חמצן.באמצעות מכשיר לוויסות לחות, הגדירו את הלחות כך שתשמר בין 30% ל-40% בתוך תא הרובוט; לחות זו מאפשרת ל-FEMA להתנפח, ובכך מאפשרת לפולימר שנוצר לחדור לתוך שכבת ה-FEMA ולהילכד בה פיזית על פני השטח. כדי להתחיל את תהליך ההדפסה, לחצו על go בתוכנה במחשב המחובר. לאחר מכן, הפינים יירדו לתוך תמיסות המונומר במהירות של 25 millimeters per second.לאחר מכן הן יישמרו בתמיסה למשך 2.5 שניות ויוצאו במהירות של 25 millimeters per second. בשלב הבא, קצה הפין יובא למגע עם שקופיות ה-FEMA, תוך חלוקה של כ-2.4 nanoliters מהתמיסה מחלק השמיכה (quilt) של הפין. זמן המגע הכולל עבור כל מגע הוא 10 milliseconds, ומהירות ההגעה והנסיגה היא 175 millimeters per second.לאחר מכן, מייבשים את הפינים על ידי מגע חוזר ונשנה עם שיםתיות ספיגה מזכוכית כדי להסיר את תמיסת המונומר מהחלק החיצוני של הפין. רצף הספיגה המשמש כולל 33 מגעים עם שמשית זכוכית נקייה. ארבעת המיקומים הראשונים יבצעו 10, 5, 4 ושלושה מגעים בהתאמה.ארבעת המיקומים הבאים ייצרו שני מגעים, ושלושת המיקומים האחרונים ייצרו מגע אחד לאחר ההדפסה. הפינים נשטפים באמבט זרימה של DMF תוך ערבוב למשך 30 שניות. במקביל, השקופיות המודפסות מקבלות הקרה ממקור UV באורך גל של 365 ננומטר בשידור קצר, בצפיפות של 30 מיליוולט לסנטימטר רבוע.לאחר השלמת השטיפה וההקרנה, מודפסת השקופית הבאה. אם ההדפסה נראית מוצלחת, הקרן את המערכים ב-UV באורך גל של 365 nanometers למשך 10 דקות נוספות. המערכים שהודפסו זה עתה מוכנסים לתנור ואקום המכוון ללחץ של פחות מ-50 milli tours למשך שבוע, כדי להסיר מונומרים שלא פולימרו וממסים לאחר ההדפסה והחילוץ בוואקום.ניתן להעריך את הצלחת הפולימריזציה של נקודות הפולימר באמצעות מיקרוסקופיה של אור פשוט כדי לזהות מורפולוגיות חריגות של הנקודות; בדרך כלל, הנקודות צריכות להיראות עגולות ואחידות, כפי שמוצג בדמות זו משמאל. הסיבה הסבירה לשינוי בגיאומטריה היא סיכה פגומה או לא נקייה, או זיהום של אבק בתמיסות המונומר. במקרה זה, יהיה צורך לחזור על התהליך עבור מספר קטן של שילובי מונומרים.ניתן לראות כתמים בעלי צורה מעוותת; לדוגמה, כתם מרכזי עם לוויין של כתמים קטנים כפי שמוצג מימין, או צורה של ביצה מטגנונה שבה קיים כתם מרכזי מעל כתם גדול ושטוח יותר. דבר זה עלול להיגרם כתוצאה מהפרדה של פאזות לפני ההדפסה, הקשורה להבדלים בצמיגות, הידרופיליות, נדיפות או במתח הפנימי של המונומרים, ומצביע על כך ששילוב המונומרים אינו תואם לפורמט זה. מיפוי כימי נוסף של כתמי פולימר הוא שלב בקרת איכות חשוב ולעיתים הכרחי כדי לקבוע את התפלגות המבנים הכימיים של החומרים על פני הכתמים ואת האפיון השטחי בעל תפוקה גבוהה (HTSC) של המערכים המיקרוסקופיים שנוצרו.שימוש בטכניקה זו מאפשר גם להקריל את הביצועים הביולוגיים למאפיינים פיזיקו-כימיים. דבר זה מאפשר את חקר האינטראקציה של חומרים ביולוגיים. HTSC עושה שימוש במדידות זווית מגע של מים, זמן מעוף, ספקטרומטריית מסות של יונים משניים, מיקרוסקופיית כוח אטומי וספקטרוסקופיית פוטו-אלקטרונים בקרני X.בפרט, בדיקות TOF SIM מספקות ניתוח כימי עשיר של הדגימה, שניתן להשתמש בו כדי להקרין את תגובת התא עם מקבוץ מולקולרי. במקרים מסוימים, ניתן לחזות את הביצועים הביולוגיים. ספקטרום ה-TOF SIM מדגים את התלות הכימית של אינטראקציה עם חומר ביולוגי ומספק מידע לפיתוח חומרי HI.לאחר שאפיין את פני השטח של המערך הפולימרי, ניתן להשתמש בו למחקר של אינטראקציות ביולוגיות. כאן אנו מדגימים את השימוש במערך לביצוע בדיקת היצמדות חיידקים. התחל על ידיe接 inoculation של 10 milliliters של LB עם מושבה בודדת של pseudomonas המסומנת ב-GFP.גדלו את ה-Aerogen בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם ניעור ב-200 RPM למשך לילה. מדדו את ה-OD 600 של תרבית החיידקים מלילה ודללו את התרבית ל-OD 600 של 0.01 ב-15 milliliters של RPMI 1640. בינתיים, שטפו את שקופיות המערך ועקרו מים מזוקקים למשך 10 דקות כדי להסיר רכיבים מסיסים מהמערכים, כגון מונומרים שלא פולמרו, ליגנדים וממסים.לאחר מכן, ייבשו את השקופיות באוויר בתוך ארון זרימה. בשלב הבא, הניחו את שקופיות המערך שטופות בצלחת פטרי נקייה ועקרו אותן ב-UV למשך 10 דקות. כאשר תרבית החיידקים מוכנה, העבירו את השקופית עם המערך לתוך צלחת פטרי והוסיפו 15 milliliters של מצע RPMI 1640 מוחדר.הנח שקופית מערך נוספת בתוך כלי פטרי שני והוסף 15 milliliters של RPMI 1640 סטרילי כביקורת. דגרי את הכליים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 72 שעות עם ניעור ב-60 RPM לאחר הדגירה. שטוף את השקופיות שלוש פעמים עם 15 milliliters של PBS סטרילי למשך חמש דקות ב-100 RPM.לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם 15 milliliters של מים מזוקקים סטריליים כדי להסיר את מלח הפוספט. לאחר השטיפה, הניחו לשקופיות להתייבש באוויר בתוך קבלינה עם זרימת אוויר.לאחר שהשקופיות יבשו, יש לסרוק אותן באמצעות סורק פלואורסצנטי בהקדם האפשרי כדי למנוע דעיכה של GFP, תוך שימוש בתוכנה ובטכנולוגיית הדמיה מתאימות. הפלואורסצנציה הנובעת מהיצמדות חיידקים מחושבת על ידי חיסור הפלואורסצנציה של בקרת המצע בלבד מהדגימה המוחדרת, וזאת כדי לזהות חומרים העמידים להיצמדות חיידקים.מערכי מיקרו (Microarrays) הוכנו ובדיקות היצמדות חיידקים בוצעו בהתאם לשיטות המתוארות בסרטון זה. כפי שניתן לראות כאן, מערך המיקרו הפולימרי מכיל חומרים בעלי היצמדות חיידקית נמוכה, המהווים פלואורסצנציה נמוכה, וחומרים בעלי היצמדות חיידקית גבוהה, המהווים פלואורסצנציה גבוהה. שלושת המערכים המוצגים כאן הם חזרות, כאשר ערכי הפלואורסצנציה משלוש החזרות מחושבים כממוצע ומוצגים כייצוג תלת-ממדי.כפי שניתן לראות כאן, הפרשנות החזותית הכמותית מפושטת. סרגל העוצמה מימין מייצג את ערכי נתוני הפלואורסצנציה. ברמה בסיסית, זיהוי החומרים עם פלואורסצנציה נמוכה מספק דרך לזיהוי מהיר של חומרים המעמדים יישום ביולוגי ספציפי, כגון עמידות להיצמדות חיידקים.עם זאת, ניתן לשלב תוצאות אלו עם HTSC כדי לבחון מתאמים בין תכונות ספציפיות של החומרים לבין הביצועים הביולוגיים שלהם. ניתוח זה יכול להבהיר קשרי מבנה-תפקוד, ובכך לזהות את המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציה הביולוגית עם החומרים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן ההכנה וההדפסה של מיקרו-מערך פולימרי (polymer microarray), וכן תקבלו תובנה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש במיקרו-מערכים פולימריים כדי לבחון תגובה של חיידקים לחומרים.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להדפיס מיקרו-מערך פולימרי בתוך יומיים אם הפרוצדורה מבוצעת נכון. הכנת המonomers אורכת כיום אחד, והדפסת המערך אורכת כשש שעות. בדיקת היצמדות חיידקים אורכת חמישה ימים, זמן שכולל את גידול תרבית העל כאינוקולום, דגירה של המיקרו-מערך בתרבית החיידקים למשך 72 שעות, וזיהוי אות הפלואורסצנציה באמצעות סורק מיקרו-מערכים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על ניקיון הפינים ומחזיקי הפינים.זה מאוד מתסכל אם באמצע ריצה הפין נתקע במצב זקוף ולא יכול עוד ליצור מגע עם השטח בגלל שהפין או מחזיק הפינים לא ננקו מספיק. אל תשכחו שעבודה עם DMF ומונומרים רעילים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לכלול תמיד בפרוצדורה אמצעי זהירות כגון שימוש במכשיר שאיבה.

polymer-microarrays-for-high-throughput-discovery-of-biomaterials

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטה זו מתארת ​​את הסינתזה קומבינטורית של סרט polyanhydride מתכלה וספריות nanoparticle וזיהוי התפוקה גבוהה של שחרור חלבון מהספריות הללו.

סינתזה קומבינטורית של שחרור חלבון ותפוקה גבוהה מסרט הפולימר וספריות Nanoparticle

מקור: Venkateswaran, S., et al. זיהוי תפוקה גבוהה של פולימרים דוחי חיידקים עבור מכשירים רפואיים. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים שיטה בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי פולימרים דוחי חיידקים באמצעות שקופית מיקרו-מערך החשופה לתרביות חיידקים מעורבות. קשירת חיידקים מוערכת על ידי פלואורסצנטיות DAPI, כאשר אות מופחת מצביע על פולימרים עם חיבור מינימלי של פני השטח.

זיהוי תפוקה גבוהה של פולימרים דוחי חיידקים באמצעות סינון מיקרו-מערך

גישה חומרי הקרנה מודרכת לפתח microarrays מסוממת סול ג נגזר חלבון באמצעות שיטת סיכת הדפסה מתפתחת של ייצור מתוארת. מתודולוגיה זו באה לידי ביטוי באמצעות הפיתוח של acetylcholinesterase וmultikinase microarrays, המשמשים להקרנת מולקולה קטנה וחסכונית.

גישת הקרנת חומרים מודרכת לפיתוח Microarrays החלבון כמותי סול ג הנגזר

אנו מתארים הליך לאפיון חלבוני רוק באמצעות מערכי נוגדנים מבוססי microsphere מרובבים. נוגדנים חד שבטיים היו קשורים קוולנטית ל4.5 מיקרומטר זעירים מפולימר ניאון בקידוד צבע באמצעות הכימיה carbodiimide. Microspheres שונה הופקד בmicrowells סיבים אופטיים כדי למדוד את רמות חלבון ברוק באמצעות immunoassays כריך הקרינה.

הריבוב פלורסנט Microarray לניתוח חלבוני רוק אדם שימוש מיקרוסכמות פולימרים ואגדים של סיבים אופטיים

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של בקנה מידה גדול, מערך ה- DNA או נוגדן דו ממדים מרובב, עם יישומים פוטנציאליים במחקרי איתות תא וזיהוי סמנים ביולוגיים.

ייצור מודרך זרימת דפוס בצפיפות גבוהה ברקוד נוגדן Microarray

מתוארת שיטת מיקרו-מערך בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי פולימרים המפחיתים את קשירת פני השטח של חיידקים במכשירים רפואיים.

זיהוי תפוקה גבוהה של חיידקים פולימרים דוחה עבור אביזרים ומכשור רפואי

התמיינות תאים מוסדרת על ידי שורה של גורמי microenvironmental, כוללים שני תכונות חומר רכב מצע מטריקס. אנו מתארים כאן טכניקת ניצול microarrays תא בשיתוף עם מיקרוסקופ כוח המתיחה להעריך הן התמיינות תאי אינטראקציות תא-מצע ביומכנית כפונקציה של הקשר microenvironmental.

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

נדגים טכנולוגיה שבב snap לביצוע כריך מרובבת cross-reactivity ללא immunoassays על ידי הצמדת פשוט שתי שקופיות. מנגנון הצמדה משמש באופן אמין מבנק ריאגנטים microarray-כדי-microarray. השבב הצמד יכול לשמש עבור כל התגובות הביוכימי הדורש colocalization של ריאגנטים שונים ללא זיהום צולב.

הצמד הצ'יפ בשביל כריך מרובבת Cross-reactivity חופשי ונטול שהמשגיח Immunoassays

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) היא טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לניתוח הרכב גליקנים בדגימות ביולוגיות.

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה

למד ליצור מערכי מיקרו פולימרים לסקרינג ביולוגי בקצב גבוה באמצעות פוטופולימריזציה על שבב. השיטה מאפשרת זיהוי חומרים העמידים בפני הידבקות חיידקים ותומכים בהתרחבות תאי גזע.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

גלה סרטונים נוספים