הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ'יימברס הדמיה חיים
27 בפברואר 2012
תסיסנית ביצה קאמרית הוא מודל מצוין לחקר המנגנונים של לוקליזציה mRNA. על מנת ללכוד את האירועים דינמיים ביסודה של תהליכי לוקליזציה, ברזולוציה גבוהה הדמיה מהירה של רקמה חיה נדרש. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה והדמיה של דגימות חי עם הפרעה מזערית.
מטרת הניסוי הבא היא להקליט תהליכים דינמיים באתרים U בדרזופילה חיה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד שוואריים שלמים מזבובים נקביים בני יומיים שהוזנו היטב. כשלב שני, מופקים אריאלים בודדים מהשוואריים כדי לדגיין את תאי הביצה.
לאחר מכן, אם הן מבטאות חלבון פלואורסצנטי מתאים, ניתן לצלם את תאי השחלה (egg chambers) הבודדים באופן ישיר, או להעביrem מניפולציות נוספות, כגון מיקרו-הזרקה של סממנים פלואורסצנטיים לפני הצילום. בסופו של דבר, באמצעות ניתוח רצפי הסרטונים, ניתן לחשוף את האינטראקציה הדינמית של רכיבים תוך-תאיים. שיטה זו סייעה לנו לענות על מספר שאלות מפתח בתחום הטרנספורט של RNA והתרגום המקומי.
לדוגמה, כיצד מוסדרת בזמן ובמרחב באורגניזם החי ביטויים של חלבונים הקובעים את תוכנית הגוף? באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה, כיוון שהיא דורשת מהירות ומיומנות ניכרות. תרגול של שני ההיבטים הללו יוביל לתוצאות טובות יותר.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שהמניפולציות בתאי הביצים קשות להעברה בטקסט ומכיוון שנדרשים מומחיות טכנית וידיים יציבות. התחילו את הפרוצדורה על ידי הנחת טיפה קטנה של שמן halo carbon על זכוכית כיסוי והניחו אותה בצד. לאחר מכן, הרדימו את הזבובים שהוכנו באמצעות פחמן דו-חמצני.
השתמשו בפינצטה בעלת חוד דק וחד כדי לתפוס זבוב נקבה שמן בחלקו הקדמי של הבטן. אין לתפוס במרכז הבטן. החזיקו את הנקבה בגובה של כשני עד שלושה סנטימטרים מעל לזכוכית הכיסוי שהוכנה.
באמצעות זוג פינצטות שני, הסירו את הרקמה בקצה האחורי ביותר של הנקבה. פעולה זו תכלול בדרך כלל רקמות מעי; השתמשו בפינצטות נקיות. עסו בעדינות את הבטן מהקצה הקדמי לקצה האחורי, בדומה לסחיטה של משחת שיניים משפופרה.
השחלות נראות כמבנים עמומים וגדולים ויידבקו לקצה הפינצטה. אספו את השחלות על ידי נגיעה בהן בשמן פחמן (halo carbon oil) על גבי הזריקה. חזרו על התהליך עד לאיסוף של ארבע עד שש שחלות.
לפני בידוד האיברים האוויריים, יש לכוון את מקור האור במיקרוסקופ כך שההארה תפגע בפסחית בזווית רדודה ותצור צללים מנוגדים על הרקמות. בעת דיסקציה של הזבובים, חשוב מאוד להשתמש בכלים המתאימים.
הצבען שבו אנו משתמשים אינו חד מדי כדי שלא יפגע ברקמה, אך הוא קהה מספיק כדי שנוכל לתפוס את הפינצטה שבה אנו משתמשים. שוב, לא חד מדי כדי שלא יפגעו ברקמות, אך מספיק מדויק כדי שנוכל לתמרן את הדברים מבלי לכופף את הכלי. חשוב מאוד שהכלים יהיו נקיים, ולכן אנו מנקים אותם באופן קבוע לאורך הפרוצדורה באמצעות פינצטה סגורה.
הפרידו בין שתי השחלות על ידי הסרת רקמת החיבור בקצה האחורי. בקצה האחורי נמצאים תאי הביצים הבשלים ביותר. מקמו שחלה אחת באופן אופקי, כאשר תאי הביצים הצעירים ביותר פונים לכיוון היד הדומיננטית שלכם.
לאחר מכן, אחזו בעדינות את הקצה האחורי באמצעות רקמת החיבור שנותרה, והשתמשו במ probes לדיסקציה או במחט טונגסטן כדי להוציא בזהירות egg chambers בודדות; אלו השבויות משלב Jamar ועד שלב 10 ייפרדו זו מזו, אך egg chambers מבוגרות יותר יישארו מחוברות לשחלה. בעזרת ה-probe, גררו בזהירות 15 עד 25 egg chambers שהופרדו למרכז טיפת השמן. אם יש צורך לבצע דיסקציה ליותר משחלה אחת, בחרו שחלה מזבוב אחר.
יש להשליך כל רקמת שחלה עודפת ולעבוד במהירות, שכן התאים יתחילו להפגין שינויים פנוטיפיים עקב עקה. לאחר 40 דקות מההפרדה מהשחלה, הסר את רקמת השחלה העודפת מהשמן. להזרקה של תאים בשלב ביניים, בעזרת מכשירים נקיים, כוון את ה-aerials בניצב לציר האורכי של הזכוכית מכסה. כדי לבודד תאי ביצה בשלב מאוחר.
נדרשת שיטה שונה כאשר תופסים את החלק האחורי של השחלה כפי שמתואר קודם לכן. הכניסו את קרס הניתוח לקצה האחורי של השחלה בסמוך לפינצטה. כדי למנוע פקיעה של תאי הביצים, הכניסו את הקרס בין תאי ביצים בשלב מאוחר.
משכו את מחט הניתוח דרך השחלה עד ליציאתה בחדרי הביצים בשלב מוקדם. כאשר הפעולה מבוצעת נכון, הגשוש יסיר את הרקמה המחברת המקבעת את ה-aerials ואת חדרי הביצים בשלב מאוחר במקומם. חזרו על שלב זה עד שה-aerials יפרוסים על עליית הזכוכית.
כאשר תאי הביצים אינם נערמים עוד זה על גבי זה, שלב זה הושלם. בעזרת מחט דיסקציה, הפרידו את תאי הביצים בשלבים המאוחרים כדי להקל על ההדמיה ולמצב את שלב 14. השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את הנספחים הגביים של תאי הצוואר.
הכינו את התמיסות להזרקה על ידי סנטריפוגה קצרה במהירות גבוהה. פעולה זו תשקיע משקעים מוצקים שעלולים לחסום את מחט ההזרקה. לאחר מכן, טענו את מחט ההזרקה באמצעות קצה טעינה, וחברו בזהירות את מחט ההזרקה הטעונה למזרק.
כעת הניחו פיסת זכוכית קטנה בסמוך לדגימות והניחו את העגלה על במה של המיקרוסקופ. הזכוכית תשמש כדופן כדי לשבור או לפתוח. נתקו את המחט.
הכינו את המיקרוסקופ ואת מכשיר ההזרקה עבור הניסוי. יש להקפיד שלא לשבור את קצה המחט. במידת האפשר, השתמשו בבמה אוטומטית בעלת יכולת הגעה לנקודות (point visiting capability) כדי לסמן את כל התאים בשלב שמונה ובשלב תשעה להזרקה.
כעת, הנמיכו את מחט ההזרקה עד שתגע בשמן. בחרו את הנקודה הראשונה מרשימת הנקודות המסומנות ומקדמו את המיקוד על התא. הנמיכו את המחט ידנית עד שתהיה באותו מישור מיקוד של התא.
בעזרת בקרים של המניפולטור, העבירו את חוד מחט ההזרקה עד שיהיה בתוך אתר ה-U. תנועת דקירה מהירה היא לרוב מוצלחת יותר מתנועה איטית. לאחר הכניסה, התיזו נפח קטן מהמחט והעריכו ויזואלית את התוצאות.
יש לחזור על הפעולה. אם ההזרקה הצליחה, הציטופלזמה בתוך התא תנדח. קשה לכמת את כמות הנוזל המדויקת שהוזרקה.
כדי להגדיל את הנפח המוזרק, יש לכוון את הלחץ או את משך פעימת ההזרקה. ניתן לשבור את קצה המחט כדי להגדיל מעט את פתח המחט, או פשוט להשתמש במספר פעימות הזרקה לפני בחירת ה-mark.Cyte הבא. הרם את מחט ההזרקה גבוה מספיק בשמן כך שלא תתנגש ב-cytes אחרים.
דקירות מרובות או השארת המחט בתוך התא גורמות לנזק חמור לתא הביצה. לכן, יש לפעול במהירות. ההזרקה צריכה להימשך פחות מ-10 שניות.
במידה ובוצעה טעות, עברו לסימון הבא באתר. אין לבזבז זמן על אתר פגום. כאשר המחט נסתמת, העבירו את המחט לחתיכת הזכוכית השבורה.
כאשר הזכוכית והמחט נמצאות באותו מישור מוקד, דחפו בעדינות את המחט לתוך הזכוכית. בדקו שהמחט אינה סתומה על ידי לחיצה על כפתור ההזרקה ובדיקה אם נוזל יוצא מקצה המחט. לאחר שהוזרקו כל אתרי ה-US, הוציאו ידנית את המחט מהשמן והסיטו אותה מנתיב קרן האור של המיקרוסקופ.
וודאו כי המכשיר נמצא במנח בטוח כדי למנוע נזק לעיניים, וכי האורות כבויים. כדי להקל על הדמיה פלואורסצנטית, מהירות היא הכרחית. אם חלפה שעה או יותר בין בידוד תאי הביצה לבין ההזרקה לתאים, יהיה קשה להזריק לתאים והם יציגו שינויים פנוטיפיים הקשורים למעמדות (stress).
בעיות דומות עלולות להיווצר כתוצאה מטיפול גס בציטה (cyte) או מהזרקת נפחים עודפים. ניתן לצלם תאי ביצה המבטאים חלבוני פלואורסצנציה טרנצ'גניים (trenchgenic) ללא צורך בהזרקה. ניתן לצלם סימון MS two של RNA אנדוגני עם תוצאות טובות תוך שימוש בנהלי בידוד רקמות, תוך שימוש בפרוצדורה המלאה המסונת up in vitro.
RNA של Alexa, 5 46 kin הוזרק לתוך תא ביצה של ME 31 BGFP, וה-RNA התמקם בחלק הקדמי-גבי של הציט ויצר כיסוי סביב הגרעין לאחר שהתהליך הושלם. טכניקה זו יכולה להתבצע בכ-10 דקות מרגע הניתוח ועד לתחילת הדמיון. בעת ביצוע הליך זה, יש לשמור על הרקמה על ידי עבודה מהירה אך זהירה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להקליט תהליכים דינמיים בציטים חיים של Drosophila.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לניתוח והדמיה של תאי ביצים חיים של Drosophila לצורך חקר לוקליזציה של mRNA. השיטה שמה דגש על הדמיה מהירה ברזולוציה גבוהה כדי ללכוד תהליכים דינמיים ברקמה חיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- חדרי ביצים של דרוזופילה (Drosophila) משמשים כמודל למחקרים על מיקום mRNA.
- הבנת הובלת RNA ותרגום מקומי היא קריטית לביולוגיה של ההתפתחות.
- טכניקות דימוי ברזולוציה גבוהה הן חיוניות לצפייה בתהליכים תאיים דינמיים.
- נדרשת מומחיות טכנית לצורך ביצוע מוצלח של הניתוח והדימוי.
מטרת המחקר
- להקלטה של תהליכים דינמיים בתאי ביצים חיים של Drosophila.
- לבדיקת הבקרה על ביטוי חלבונים בזמן ובמרחב.
- להעמקת ההבנה של אינטראקציות בין רכיבים תוך-תאיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד שחלות מנקבות Drosophila.
- דיסקציה של תאי ביצה בודדים לצורך דימוי.
- הזרקה מיקרוסקופית של סמנים פלואורסצנטיים לתאי ביצה.
- דימוי ברזולוציה גבוהה לניתוח תהליכים דינמיים.
תוצאות עיקריות
- דימות מוצלח של תאי ביצית (egg chambers) חושף אינטראקציות של רכיבים תוך-תאיים.
- הודגמה חשיבותן של המהירות והמיומנות בתהליך הדיסקציה.
- סופקו תובנות לגבי הבקרה של חלבוני תכנית הגוף (body plan proteins).
- הודגשו האתגרים העומדים בפני המתנסים הראשונים בטכניקה.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר מחקר יעיל של לוקליזציית mRNA ברקמות חיות.
- הדגמות חזותיות הן קריטיות להעברת מניפולציות מורכבות.
- שיפור מתמיד של הטכניקות ישפר את תוצאות הניסוי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות חי של תאי ביצים בודדים של Drosophila מאפשר תצפית ישירה על תהליכים תוך-תאיים דינמיים, התומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. פרוטוקול ההכנה זה מבטיח רלוונטיות פיזיולוגית וחיוניות של הרקמה, שהם קריטיים ליצירת נתונים כמותיים וניבויים במסלולי עבודה של ביולוגיה של התפתחות וביולוגיה של התא. השיטה תומכת ברציפות תרגומית על ידי אספקת פלטפורמה חסונה לחקר לוקליזציה של mRNA ודינמיקה של ביטוי חלבונים במערכת הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה בזמן אמת של מנגנוני הובלת RNA ותרגום מקומי.
- תומך בתיקוף תפקודי של מבנים גנטיים ומרכיבי מסלולים במערכת חיה.
- מסייע בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי ויזואליזציה של דינמיקת חלבונים ו-mRNA in situ.
- מספק פלטפורמה למחקרים מונחי-השערה על קביעת צירים ואורגנוגנזה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין דגימות רלוונטיות פיזיולוגית עבור בדיקות דימות בעלות תוכן גבוה (high-content imaging assays).
- מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה בזרימות עבודה של דימוי תאים חיים.
- תומך בניתוח כמותי של מולקולות ומבנים תאיים המסומנים פלואורסצנטית.
- מאפשר הערכה מהימנה של הפרעות גנטיות או כימיות בסביבה מבוקרת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- עולה בקנה אחד עם מודלים רלוונטיים למחלה לצורך חקר תהליכים התפתחותיים ודיפרנציאציה תאית.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות מולקולריות.
- מאפשר קידום מותאם סיכונים באמצעות חשיפת ההשלכות הפנוטיפיות של מניפולציה גנטית.
- תומך בזיהוי של סמנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות פלטי דימות חיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול זה משתלב בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לפיתוח בדיקות (assays), ובכך מאפשר סריקות המשך ומחקר תרגומי. הוא מיועד לתמוך בזרימות עבודה החל מבדיקת השערות ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיית גילוי: מאפשר בדיקת היפותזות לגבי לוקליזציה של RNA וביטוי חלבונים ברקמה חיה.
- סריקה: מספקת דגימות חיוניות וסטנדרטיות עבור בדיקות דימות כמותיות.
- אנליטיקה: מספקת מדדים כמותיים ודינמיים להשוואה בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי גילוי למודלים פרה-קליניים על ידי שמירה על רלוונטיות פיזיולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: מקים פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מחקרים גנטיים ומולקולריים מגוונים ב- Drosophila.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה בתהליכי עבודה של דימיון חי.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ויעילות הון באמצעות מתן אפשרות להפקה של נתונים כמותיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום נכסים בשלב הגילוי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות טכנית בניתוח רקמה חיה ובהזרקה מיקרוסקופית.
- דורש גישה למערכות דימות ברזולוציה גבוהה ולכלי מיקרו-מניפולציה מדויקים.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים כדי להבטיח הדירות.
- עשוי לדרוש התאמה לשלבי התפתחות שונים או לרקעים גנטיים שונים.
- רגישות לזמן וחיוניות הרקמה הן מגבלות קריטיות להצלחה ניסיונית.
