Name: הכנת הפרט תסיסנית ביצה ציימברס הדמיה חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: למדו את פרוטוקול הכנת תסיסניות ביצה חיות של Drosophila לצילום תהליכים דינמיים ברזולוציה גבוהה. השיטה מאפשרת חקר לokalizatzia של mRNA ותרגום מקומי בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי אחוות Wellcome Trust מחקר בכיר א דייויס.

<ol><li>Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+and+the+development+of+biology+in+the+20th+century%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century.</a> Methods Mol. Biol. 420, 1-25 (2008).</li>
<li>Parton, R. M., Valles, A. -M., Dobbie, I. D., Davis, I. Pushing the Limits of Live Cell Imaging in Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParton%2C+RM+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory%22">Live Cell Imaging: A Laboratory</a>. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 387-418 (2010).</li>
<li>Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+messages%3A+the+intracellular+localization+of+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Moving messages: the intracellular localization of mRNAs.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (5), 363-375 (2005).</li>
<li>Jansen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Message+on+the+Move%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Message on the Move.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 247-256 (2001).</li>
<li>Van De Bor, V., Hartswood, E., Jones, C., Finnegan, D., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gurken+and+the+I+factor+retrotransposon+RNAs+share+common+localization+signals+and+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">gurken and the I factor retrotransposon RNAs share common localization signals and machinery.</a> Dev. Cell. 9 (1), 51-62 (2005).</li>
<li>Delanoue, R., Herpers, B., Soetaert, J., Davis, I., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Squid%2FhnRNP+helps+Dynein+switch+from+a+gurken+mRNA+transport+motor+to+an+ultrastructural+static+anchor+in+sponge+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Squid/hnRNP helps Dynein switch from a gurken mRNA transport motor to an ultrastructural static anchor in sponge bodies.</a> Dev. Cell. 13 (4), 523-538 (2007).</li>
<li>Jaramillo, A. M., Weil, T. T., Goodhouse, J., Gavis, E. R., Schupbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+fluorescently+labeled+endogenous+gurken+mRNA+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The dynamics of fluorescently labeled endogenous gurken mRNA in Drosophila.</a> J. Cell. Sci. 121 (Pt. 6), 887-894 (2008).</li>
<li>Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+endogenous+mRNA+reveals+a+diffusion+and+entrapment+mechanism+for+nanos+mRNA+localization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of endogenous mRNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila.</a> Curr. Biol. 13, 1159-1168 (2003).</li>
<li>Bertrand, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol. Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).</li>
<li>MacDougall, N., Clark, A., MacDougall, E., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+gurken+%28TGFalpha%29+mRNA+localizes+as+particles+that+move+within+the+oocyte+in+two+dynein-dependent+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila gurken (TGFalpha) mRNA localizes as particles that move within the oocyte in two dynein-dependent steps.</a> Dev. Cell. 4 (3), 307-319 (2003).</li>
<li>Tekotte, H., Tollervey, D., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+migrating+border+cell+cluster+in+living+Drosophila+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging the migrating border cell cluster in living Drosophila egg chambers.</a> Dev. Dyn. 236 (10), 2818-2824 (2007).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R., Davis, I., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+bicoid+mRNA+anchoring+highlight+conserved+mechanisms+during+the+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in bicoid mRNA anchoring highlight conserved mechanisms during the oocyte-to-embryo transition.</a> Curr. Biol. 18, 1055-1061 (2008).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

<html> הדמיה תא חי הוא assay עוצמה לבחינת תהליכים תאיים בזמן אמת. בנוסף תצפית פשוטה בתחום בהיר, הוספת תוויות ניאון כדי חלבונים RNAs של עניין יש להוביל לפריצות דרך רבות. כאן אנו התוויתי פרוטוקול ביציות הדמיה חיים בודדים שניתן לנצלם בשילוב עם מבחני גנטיים ביוכימיים. בפרוטוקול זה, אנחנו גם מסבירים כיצד לתפעל באופן ניסיוני ביציות החיים בזריקה. קיימות אפשרויות רבות עבור חומר להזריק, כולל חוץ גופית ב-RNA מסונתז שכותרתו ניאון assay את היכולת של המבנה משני לוקליזציה RNA ישירה (כדור ו דייוויס, לא פורסם) וכן נוגדנים המעכבים את הפונקציה של חלבונים 6. העבודה העתידית צפויה לראות את המבוא של רכיבים אחרים תיוג ומכונות הסלולר ביציות חיים המאפשרים המנגנונים המולקולריים להיבדק. t &quot;&gt; שמירה על יכולת הקיום והבריאות של רקמה חיונית בעבודה עם תאים חיים. בפרוטוקול זה, אנו מציינים מספר צעדים שיכולים להוביל ללחץ של תא הביצה. לדוגמה, על אף היותו שמן מעולה עבור הדמיה, תרבות המורחבת בשמן יכול להוביל ללחץ על תא הביצה. זה ניתן לפקח בקלות על ידי בחינת המורפולוגיה עמדה גרעינית, קרום הביצית אשר לעוות ו בועה תחת לחץ (איור להשוות 7E (מוטעמות) כדי Figure7F תחת חשיפה לשדות בהיר ( הדגיש)). שלב 9 בתאי ביצה להראות לוקליזציה RNA של התא הגבול ההגירה מעל 12 שעות מרובות. עם זאת, בשלב 7/8 תא הביצה תתחיל להציג תופעות לוואי בשמן פחמן הילה לאחר כ 40 דקות של השחלה סולקו מן נשים. מאוחרת ביצה הבמה חדרי, בשלב 11-14, יכול להתפתח בדרך כלל בשמן או בתקשורת מימית בגלל הפרשת מעטפת הביצית מתאי זקיק בכל השלבים האלה 13. זה כבר reported כי תוספת של אינסולין עד בינוני חרק מימית יכול לשמור 9 ביציות הבמה עד 6 שעות 14 ו germaria עד 14 שעות 15. בכל המקרים, תמרון אגרסיבי של תא הביצה יש להימנע, כפי שהוא מדגיש את ביציות ומפחית את יכולת הקיום שלה. הדמיה פחות בתאי ביצה ולדאוג לטיפול בכל בעדינות היא הדרך הטובה ביותר להבטיח את יכולת הקיום האופטימלי.

כלים המשמשים לנתיחה צריך להיות נקי אבל לא צריך להיות autoclaved. נגב כלים עם ETOH ולאפשר להם להתייבש לפני ההתחלה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> בסדר צבע היטה מברשת (אמנים סייבל, עגול, בגודל 00 או 0) </td><td> זמין מ רוב חנויות ציוד אמנות </td><td></td><td> מברשת איכותית היא חשובה </td></tr><tr><td> Halocarbon מוצרי החברה, סדרה 95 </td><td> Halocarbon מוצרים Corporation, 887 Kinderkamack כביש, נהר Edge NJ 07661 </td><td></td><td> אירופה המפיץ: Solvadis (GmbH) הקפד על ידי חמצן מבעבע אוויר דרך השמן. </td></tr><tr><td> מכסים, לא להחליק. 1.5, 22 x 50 מ&quot;מ </td><td> הבינלאומי-No1-VWR cat = 631-0137-22-50mm </td><td> מנצל-גלזר-22-40mm MNJ-400-070T </td><td></td></tr><tr><td> דומון מס &#39;5 - Dumostar </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11253-20 </td><td> &quot;Biologie&quot; עצה טובה גם אבל שברירי יותר </td></tr><tr><td> לנתח בדיקה </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 10140-01 </td><td></td></tr><tr><td> לנתח מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> SZ61 </td><td></td></tr><tr><td> CO2 כרית </td><td> זמין דרך <a href="http://www.flystuff.com">http://www.flystuff.com</a> / (חלוקת Genesee מדעי) </td><td> 59-114 (789,060 Dutscher) </td><td> אירופה המפיץ: www. dutscherscientific. com</a> / זה גם קל יחסית מותאם אישית לבנות רפידות משלך זבוב </td></tr><tr><td> KimCare </td><td> Kimbery קלארק, KimCare רפואיות מגבונים </td><td> KLEW3020 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ-DeltaVision </td><td> יישומי Precision </td><td> DC-CORE </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Burleigh Micromanipulators מ Lumen הדינמיקה הקבוצתית Inc. 2260 Argentia כביש, Mississauga, אונטריו, קנדה L5N 6H7 </td><td> Burleigh PCS-5000 הסדרה, TS-5000-300 </td><td> <a href="http://www.ldgi-burleigh.com">http://www.ldgi-burleigh.com</a> / (לשעבר Exfo) </td></tr><tr><td> זריקת המכשיר </td><td> Tritech Research, Inc 2961 ותיק Ave לוס אנג&#39;לס, קליפורניה 90064 </td><td> MINJ-1 </td><td> שונה עם בעל לקחת Eppendorf Femptotips </td></tr><tr><td> הזרקת מחט </td><td> Eppendorf סטרילי Femtotips I ו-II </td><td> 930000043 </td><td> טיפים שונים טובים יותר עבור יישומים שונים </td></tr><tr><td> טוען טיפים 20μl </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956.003 </td><td></td></tr><tr><td> שמרים יבשים פעילים </td><td> פליישמן של שמרים </td><td> # 2192 </td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

הדמיה תא חי הוא טכניקה חשוב ליישם מספר של רקמות תסיסנית המשמשים מודלים לחקור נושאים כגון מפרט ציר, התמיינות תאים ו organogenesis 1. הכנה נכונה של דגימות הניסוי הוא מכריע, לעיתים קרובות מוזנחים, צעד. מטרת ההכנה היא להבטיח התאמה פיזיולוגית ולקבוע תנאים אופטימליים הדמיה. כדי לשמור על הכדאיות רקמות, חיוני כדי למנוע התייבשות, הידרדרות היפוקסיה, התחממות יתר או בינוני 2. תא הביצה תסיסנית היא מערכת מבוססת היטב לבחינת שאלות הנוגעות, אך לא רק, על דפוסים הגוף, לוקליזציה mRNA וארגון cytoskeletal 3,4. עבור בתאי ביצה המוקדמות ו באמצע הבמה, גובר בשמן halocarbon טוב להישרדות כי היא מאפשרת דיפוזיה ללא חמצן, מונע התייבשות היפוקסיה ויש לו תכונות אופטיות מעולה במיקרוסקופ. Imההזדקנות של חלבונים ניאון ניתן באמצעות הכנסת transgenes לתוך תא ביצית או הזרקת הפיזי של רנ&quot;א, חלבונים שכותרתו או נוגדנים 5-7. לדוגמה, תוספת של MS2 בונה על הגנום של בעלי חיים המאפשרת תצפית בזמן אמת של mRNAs ב הביצית 8. מבנים אלו מאפשרים על תווית vivo של ה-mRNA באמצעות ניצול האינטראקציה bacteriophage MS2 RNA גזע לולאה עם חלבון המעיל שלה 9. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להוצאת השחלות, כמו גם בידוד ovarioles בודדים ותאי ביצה מ תסיסנית הנשי. לתיאור מפורט של תסיסנית oogenesis הכס אלן ג Spradling (1993, נדפס 2009) 10.

<em&gt; תסיסנית</em&gt; ביצה קאמרית הוא מודל מצוין לחקר המנגנונים של לוקליזציה mRNA. על מנת ללכוד את האירועים דינמיים ביסודה של תהליכי לוקליזציה, ברזולוציה גבוהה הדמיה מהירה של רקמה חיה נדרש. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה והדמיה של דגימות חי עם הפרעה מזערית.

דימיון תאי חיים הוא טכניקה חשובה המיושמת על מספר רקמות של *Drosophila* המשמשות כמודלים לחקר נושאים כגון קביעת ציר, ...

מטרת הניסוי הבא היא לתעד תהליכים דינמיים באתרי U של זבוב הדרוסופילה החי. זאת מושג תחילה על ידי בידוד שחלאות שלמות מזבובים נקבות בני יומיים שהוזנו היטב. כשלב שני, מוצאים אריולות בודדות מהשחלאות כדי לדגם את תאי הביצה.לאחר מכן, אם הן מבטאות חלבון פלואורסצנטי מתאים, ניתן לצלם את תאי הביצה הבודדים באופן ישיר או להעביREM אותם מניפולציות נוספות, כגון מיקרו-הזרקה של סממנים פלואורסצנטיים לפני הצילום. בסופו של דבר, באמצעות ניתוח רצפי הסרטונים, ניתן לחשוף את האינטראקציה הדינמית של רכיבים תוך-תאיים. שיטה זו סייעה לנו להשיב על מספר שאלות מרכזיות בתחום של הובלת RNA ותרגום מקומי.לדוגמה, כיצד מוסדרים בזמן ובמרחב ביצורים חיים ביטויים של חלבונים הקובעים את תוכנית הגוף? באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה, שכן היא דורשת מהירות ומיומנות ניכרות. באמצעות תרגול של שניהם יושגו תוצאות טובות יותר.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן קשה להעביר את המניפולציות של תאי הביצית בטקסט ובשל הצורך במומחיות טכנית ובדיוק בידיים. התחל את ההליך על ידי הנחת טיפה קטנה של שמן halo carbon על זכוכית כיסוי והנח אותה בצד. לאחר מכן, הרדם את הזבובים שהוכנו באמצעות פחמן דו-חמצני.השתמשו בפינצטה עדינה וחדה כדי לתפוס זבוב נקבה שמן בחלק הקדמי של הבטן. אין לתפוס במרכז הבטן. החזיקו את הנקבה בגובה של כשני עד שלושה סנטימטרים מעל זכוכית הכיסוי שהוכנה.באמצעות זוג פינצטות שני, הסר את הרקמה בקצה האחורי ביותר של הנקבה. פעולה זו תכלול בדרך כלל רקמות מעי; השתמש בפינצטות נקיות. עסה בעדינות את הבטן מהקצה הקדמי לקצה האחורי, בדומה לסחיטה של משחת שיניים משפופרת.השחלה נראית כמבנים עמומים וגדולים ותידבק לקצה הפינצטה. אספו את השחלות על ידי נגיעה בהן בשמן פחמן הלו (halo carbon oil) שעל השקף. חזרו על התהליך עד לאיסוף של ארבע עד שש שחלות.לפני בידוד האיברים התלויים (aerials), כוון את מקור האור במיקרוסקופ כך שהתאורה תפגע בلامדה בזווית רדודה ותיצור צלים מנוגדים על הרקמות. בעת דיסקציה של הזבובים, חשוב מאוד להשתמש בכלים המתאימים.הצבעון שבו אנו משתמשים אינו חד מדי כדי שלא יפגע ברקמה, אלא קהה למדי כדי שנוכל לתפוס את הפינצטה שבה אנו משתמשים. שוב, לא חדה מדי כדי שלא תפגע ברקמות, אך מספיק עדינה כדי שנוכל לבצע מניפולציות מבלי לכופף את הכלי. חשוב מאוד להשתמש בכלים נקיים, ולכן אנו מנקים אותם באופן קבוע לאורך הפרוצדורה באמצעות פינצטה סגורה.הפרידו את שתי השחלות על ידי הסרת רקמת החיבור בקצה האחורי. בקצה האחורי נמצאים תאי הביצים הבשליים ביותר. הניחו שחלה אחת במצב אופקי, כאשר תאי הביצים הצעירים ביותר פונים לכיוון ידכם הדומיננטית.לאחר מכן, אחזו בעדינות את הקצה האחורי באמצעות רקמת החיבור שנותרה, והשתמשו במוט ניתוח (dissecting probe) או במחט טונגסטן כדי להפריד את תאי הביצים הבודדים; תאי ביצים משלב Jamar ועד שלב 10 יופרדו זה מזה, אך תאי ביצים ישנים יותר יישארו מחוברים לשחלה. בעזרת המוט, גררו בזהירות 15 עד 25 תאי ביצים שהופרדו אל מרכז טיפת השמן. אם יש צורך להפריד יותר משחלה אחת, בחרו שחלה מזבב אחר.השליכו כל רקמה שסחיתית משרי השחלה ועבדו במהירות, שכן התאים יתחילו להראות שינויים פנוטיפיים עקב סטרס. לאחר 40 דקות מההפרדה מהשחלה, הסירו את עודפי רקמת השחלה מהשמן. להזרקת תאים בשלב ביניים, בעזרת מכשירים נקיים, הכו את האריאלים במצב ניצב לציר האורכי של זכוכית הכיסוי. כדי לבודד תאי ביצה בשלב מאוחר.נדרשת שיטה שונה כאשר תופסים את החלק האחורי של השחלה כפי שתואר קודם לכן. הכניסו את probes הדיסקציה אל הקצה האחורי של השחלה בקרבת הפינצטה. כדי למנוע פקיעה של תאי הביצים, הכניסו את ה-probe בין תאי ביצים בשלבים מאוחרים של התפתחות.משכו את מחט הניתוח דרך השחלה עד שהיא יוצאת דרך תאי הביצים בשלב מוקדם. כאשר הפעולה מבוצעת נכון, הפרובה תסיר את רקמת החיבור המחזיקה את ה-aerials ואת תאי הביצים בשלב מאוחר במקומם. חזרו על שלב זה עד שה-aerials יפרוסו על גבי זכוכית המכסה.השלב מסתיים כאשר תאי הביצים אינם נערמים עוד זה על גבי זה. בעזרת מחט דיסקציה, הפרדו את תאי הביצים בשלבים המאוחרים כדי להקל על הדמיית שלב 14. השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את התגים הגביים של תאי הצוואר.הכינו את התמיסות להזרקה על ידי צנטריפוגה קצרה במהירות גבוהה. פעולה זו תשקיע משקעים מוצקים שעלולים לחסום את מחט ההזרקה. לאחר מכן, טענו את מחט ההזרקה באמצעות טיפ טעינה וחברו בזהירות את מחט ההזרקה הטעונה למזרק ההזרקה.כעת הניחו פיסת זכוכית קטנה בסמיכות לדגימות והניחו את השקופית על במה של המיקרוסקופ. הזכוכית תשמש כקיר למניעת זליגה או כדי לעצור את התהליך. נתקו את המחט.הכינו את המיקרוסקופ ואת מכשיר ההזרקה עבור הניסוי. יש להישמר כדי לא לשבור את קצה המחט. במידת האפשר, השתמשו בבמה אוטומטית בעלת יכולת ביקור בנקודות (point visiting capability) כדי לסמן את כל התאים בשלב שמונה ובשלב תשע להזרקה.כעת, הורד את מחט ההזרקה עד שתיגע בשמן. בחר את הנקודה הראשונה מרשימת הנקודות המסומנות ומקד את המבט על התא. הורד את המחט ידנית עד שתהיה באותו מישור מיקוד של התא.בעזרת בקרי המניפולטור, הזז את קצה מחט ההזרקה עד שתהיה בתוך אתר ה-U. תנועת דקירה מהירה היא לרוב מוצלחת יותר מתנועה איטית. לאחר החדירה, הזרק נפח קטן מהמחט והערך חזותית את ההשפעות.נדרשת חזרה על הפעולה. אם ההזרקה הצליחה, הציטופלזמה בתוך התא תודחק. קשה לכמת את הכמות המדויקת של הנוזל שהוזרקה.כדי להגדיל את הנפח המוזרק, יש להתאים את הלחץ או את משך פעימת ההזרקה. ניתן לשבור את קצה המחט כדי להרחיב מעט את פתח המחט, או פשוט להשתמש במספר פעימות הזרקה לפני בחירת ה-mark.Cyte הבא. הרם את מחט ההזרקה מספיק גבוה בשמן כך שלא תתנגש ב-cytes אחרים.דקירות מרובות או השהייה ממושכת של המחט בתוך התא גורמות לנזק חמור לתא הביצה. לכן, יש לפעול במהירות. ההזרקה צריכה להימשך פחות מ-10 שניות.במידה ונעשתה טעות, עברו לסימון הבא באתר. אין לבזבז זמן על אתר פגום. כאשר המחט נסתמת, העבירו את המחט לחתיכת זכוכית שבורה.כאשר הזכוכית והמחט נמצאות באותו מישור מוקד, הכניסו בעדינות את המחט אל תוך הזכוכית. בדקו שהמחט אינה סתומה על ידי לחיצה על כפתור ההזרקה ובדיקה אם נוזל יוצא מקצה המחט. לאחר שהוזרקו כל אתרי ה-US, הוציאו ידנית את המחט מהשמן והסיטו אותה אל מחוץ לנתיב הקרן של המיקרוסקופ.יש לוודא שהמכשיר נמצא בכיוון בטוח כדי למנוע נזק לעיניים, ושהאורות כבוים. כדי להקל על הדמיה פלואורסצנטית, המהירות היא גורם מכריע. אם חלפה שעה או יותר בין בידוד תאי השחלה (egg chamber) להזרקה לתאים, יהיה קשה להזריק לתאים והם יציגו שינויים פנוטיפיים הקשורים למצבי דחק.בעיות דומות עלולות להיווצר כתוצאה מטיפול גס בתא או מהזרקה של נפחים עודפים. ניתן לדגם תאי ביצים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים טרנזגניים ללא צורך בהזרקה. ניתן לדגם סימוני MS two של RNA אנדוגני בתוצאות טובות תוך שימוש בנהלי בידוד רקמה באמצעות הפרוטוקול המלא המסונתז in vitro.RNA מסומן ב-Alexa 546 הוזרק לתוך לשכת ביצית של זבוב מסוג ME 31 BGFP; ה-RNA התמקם בחלק הקדמי-גבי של הציטופלזמה ויצר כיסה מסביב לגרעין ברגע שהתהליך הושלם. טכניקה זו ניתנת לביצוע תוך כ-10 דקות מרגע הניתוח ועד לתחילת הדמיה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, יש לשמור על הרקמה על ידי עבודה מהירה אך זהירה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להקליט תהליכים דינמיים בתאי Drosophila חיים.

preparing-individual-drosophila-egg-chambers-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה פשוטה, זולה, יעילה של הכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה מוצג. פרוטוקול שלנו מספק לחות חילוף הגזים ולא לדחוס את העובר תסיסנית. שיטה זו מתאימה עבור הדמיה GFP מבוססי לחיות עוברים תסיסנית באמצעות מיקרוסקופ stereomicroscope או תרכובת זקוף.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

פרוטוקול עבור הדמית חיה של חלבוני GFP-tagged או מבני autofluorescent...

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

שיטת ההדמיה הזקופה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת הדמיה מפורטת של הקטבים של ביצית דרוזופילה מלנוגסטר מתפתחת.  מבט מקצה לקצה זה מספק פרספקטיבה חדשה על הסידורים והמורפולוגיה של סוגי תאים מרובים באפיתל הזקיקים.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.

הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בהדמיה חיה כדי לדמיין את ההשפעות של נזק חמצוני על לוקליזציה ודינמיקה של מבנים תת תאיים בשחלות Drosophila.

הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה Drosophila באמצעות הדמיה חיה

בדרוסופילה, גרעין הביצית עובר הגירה תלוית מיקרוטובולה במהלך oogenesis. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפותח כדי לעקוב אחר הנדידה על ידי ביצוע הדמיה חיה על תאי ביצה ex-vivo. ההליך שלנו שומר על תאי ביצים בחיים במשך 12 שעות כדי לרכוש סרטים תלת-ממדיים רב-תכליתיים לשגות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

הגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

למדו את פרוטוקול הכנת תסיסניות ביצה חיות של Drosophila לצילום תהליכים דינמיים ברזולוציה גבוהה. השיטה מאפשרת חקר לokalizatzia של mRNA ותרגום מקומי בתאים חיים.

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ'יימברס הדמיה חיים

גלה סרטונים נוספים