Name: הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: למדו שיטת ChIP לניתוח מצב כרומטין ב-Drosophila באמצעות רקמה מבודדת. טכניקה זו מאפשרת חקר אינטראקציות חלבון-דנ"א בתנאים פיזיולוגיים אמיתיים ומספקת תובנות לגבי ויסות גנים בביולוגיה של הכרומטין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות מעבדה ד&quot;ר Keji של ג&#39;או (NIH / NHLBI) על עזרתם במתן תוצאות רצף. אנו רוצים גם להודות פרויקט הגנום UCSC לשימוש של דפדפן הגנום לדמיין רצף ממופה קורא. עבודה זו נתמכה על ידי מסלול R00HD055052 NIH להעניק העצמאות R01HD065816 מ NICHD, Parkard לוסיל קרן, ואת ג &#39;ון הופקינס סטארט אפ מימון XC

<ol><li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li>
<li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li>
<li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li>
<li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bag-of-marbles%3A+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li>
<li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li>
<li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

צדדיות של ניתוחים שבב שנדונו פרוטוקול זה יכול לשמש על רקמות שונות, אשר מספק הזדמנות לבחון את מצב הכרומטין במערכת רלוונטיות מבחינה ביולוגית. ניסויים שבב באמצעות תאים בתרבית ממערכות נוח לבצע בגלל כמות גדולה של תאים ניתן להשיג בקלות. עם זאת, תאים בתרבית אינן משקפות בהכרח את התאים בסביבה מרובת הסלולר. על ידי פיתוח טכניקה זו באמצעות רקמות גזור מבעלי חיים, אנחנו יכולים לענות על שאלות רבות תאים בתרבית לא יכול. למרות התו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם מיני קוקטייל </td><td> רוש </td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td> פורמלדהיד (37%) </td><td> Supelco </td><td> 47083-U </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> סיגמא </td><td> 78830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes גלולה העלי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> PCR ערכת טיהור </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> יישור קווי polyacrylamide </td><td> סיגמא </td><td> 56575-1ML </td><td></td></tr><tr><td> גליקוגן </td><td> Qiagen </td><td> 158930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR ירוק / רוקס QPCR מיקס מאסטר </td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td> מיני הצלחת טווה </td><td> Labnet </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td> בזמן אמת, מערכת ה-PCR </td><td> יישומי Biosystem </td><td> 4351101 </td><td></td></tr><tr><td> נפח מעבד קטן Ultrasonic </td><td> Misonix </td><td> HS-XL2000 </td><td> דגם הופסק </td></tr><tr><td> Dynabeads, חלבון </td><td> Invitrogen </td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td> Dynamag מגנט </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> פנול: Chlorofrom: רשות העתיקות </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> Epicentre DNA קצה ערכת תיקון </td><td> Epicentre ביוטכנולוגיות </td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute Reaction ערכת ניקוי </td><td> Qiagen </td><td> 28204 </td><td></td></tr><tr><td> Klenow שבר (3 &#39;→ 5&#39; exo-) </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA ligase </td><td> Promega Corporation </td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td> מתאם oligonucleotides </td><td> Illumina </td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td> יחד סוף פריימר 1.0 ו 2.0 </td><td> Illumina </td><td> 1001783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-Gel Electorphoresis מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X Phusion HF Mastermix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

אפיגנטיקה נשאר בתחום המתפתח במהירות כי מחקרים איך המדינה הכרומטין תורם ביטוי ההפרש גנים סוגי תאים שונים בשלבים התפתחותיים שונים. תקנה epigenetic תורם ספקטרום רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל התמיינות במהלך ההתפתחות העוברית הומאוסטזיס בבגרות. אסטרטגיה קריטית במחקרים אפיגנטים המשנים היא לבחון כיצד שינויים היסטון שונים וגורמים הכרומטין לווסת את ביטוי הגנים. לכתובת זו, הכרומטין immunoprecipitation (שבב) נעשה שימוש נרחב כדי לקבל תמונת מצב של הקשר של גורמים מסוימים עם ה-DNA בתאים של עניין. הטכניקה שבב כלל משתמשת בתאי תרבית חומר המוצא, אשר ניתן להשיג בשפע והומוגניות להפיק נתונים לשחזור. עם זאת, ישנם מספר תנאים: ראשית, הסביבה לגדול תאים בצלחת פטרי שונה מזה in vivo, ולכן עשוייםלא משקפים את מצב הכרומטין אנדוגני של התאים בכל יצור חי. שנית, לא כל סוגי התאים יכולים להיות vivo לשעבר תרבותי. יש רק מספר מוגבל של שורות תאים, אשר אדם יכול להשיג מספיק חומר assay שבב. כאן אנו מתארים שיטה לעשות ניסוי שבב באמצעות רקמות תסיסנית. חומר המוצא היא גזור רקמה מן החי, ובכך יכול לשקף במדויק את מצב הכרומטין אנדוגני. ההסתגלות של שיטה זו עם סוגים שונים של רקמות יאפשר לחוקרים להתייחס הרבה יותר מבחינה ביולוגית שאלות רלוונטיות לגבי רגולציה epigenetic ב 1 vivo, 2. שילוב שיטה זו עם רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יהיה עוד יותר לאפשר לחוקרים לקבל הנוף epigenomic.

לאחרונה תפוקה גבוהה טכנולוגיית ריצוף גדלה מאוד הרגישות של הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הניסוי מתבקש יישומו באמצעות תאים או רקמות גזור מטוהרים. כאן אנו קובעים שיטה להשתמש בטכניקה שבב עם<em&gt; תסיסנית</emרקמת&gt;, אשר יכול להתמודד עם מצב הכרומטין אנדוגני במערכת הביולוגית היטב מאופיין.

האפיגנטיקה נותרת תחום המתפתח במהירות, החוקר כיצד מצב הכרומטין תורם לביטוי גנים דיפרנציאלי בסוגי תאים שונים ב...

נוהל זה מייצר נתונים של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) מרקמת זבוב שחוטתה, כדי לשקף במדויק את מצב הכרומטין בתוך רקמת drosophila בחיים (in vivo). במקרה זה, מאות אשכים נאספים על ידי דיסקציה ידנית. בדיקות שיקוע חיסוני של כרומטין מבוצעות באמצעות נוגדן נגד החלבון המדובר.ביצוע ניתוח כמותי באמצעות R-T-P-C-R כמעקב לבדיקת העשרה של האזור הגנומי הספציפי ב-DNA המנוקב (chipped) והמטוהר. לחלופין, ריצוף בייצור גבוה (high throughput sequencing) של דגימת השבב מייצר פרופיל של כל הגנום. בסופו של דבר, ניתוח שבב של רקמה מופרדת מספק ייצוג של מצב הכרומטין בתאים מתחת לתנאיהם הפיזיולוגיים.פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה עבור אנליזה של רקמות שבודדו ישירות מהאורגניזם. על מנת לקבל מצבי כרומטין ומידע אפיגנטי תחת תנאים פיזיולוגיים ממשיים, נדגים את השימוש ב-ChIP ב-Drosophila כדי לבחון את מצב הכרומטין. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על אורגניזמים אחרים, כגון עכבר או דג זברה.הדגמה חזותית של פרוטוקול זה היא קריטית כדי להשיג DNA באיכות ובכמויות מספקות לשימוש עבור שבב או ליצירת ספריות רצף עבור רצף בתפוקה גבוהה. ראשית, יש לבצע דיסקציה של הרקמה הרלוונטית, במקרה זה כ-200 זוגות של אשכים של drosophila, ב-PBS קר המכיל מעכב פרוטאז ו-100 micrograms per milliliter PMSF. לאחר שטיפה כפולה של הרקמה, יש להחזי

chromatin-immunoprecipitation-chip-using-drosophila-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ההבחנה בין ESC עולה בקנה אחד עם תא מסוג שינויים ספציפיים במבנה ובהרכב של הכרומטין. זיהוי של שינויים אלה מספק תובנות רבות ערך את המנגנונים שמגדירים stemcellness והתמיינות תאים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מייצגת שיטת ערך לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס תא גזע בידול.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

זה פרוטוקול וידאו ממחיש את הטכניקה סקווש המשמשים את המעבדה יוהנסן...

הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

אנו מדגימים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) שיטה לזהות אינטראקציות גורם ספציפי על רקמות גנים במהלך או לאחר הופעת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות ברקמות עובריים בעכבר. פרוטוקול זה צריך להיות רלוונטי נרחב לחקר ההפעלה רקמות ספציפיות גן כפי שהיא מתרחשת במהלך ההתפתחות העוברית נורמלי.

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

ציוץ הוא טכניקה חדשנית ומהירה למפות אתרי הקישור הגנומי של RNAs noncoding ארוכות (lncRNAs). השיטה מנצלת את הייחודיות של תחושת אנטי oligonucleotides ריצוף כדי לאפשר ספירה של lncRNA הנכנס אתרים הגנומי.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

רקמות דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית של סוגי תאים. כדי לבחון ביטוי גנים בסוגי תאים מסוימים מרקמה מסוימת, גרעינים יכולים להיות מתויגים גנטי ולאחר מכן מבודד באמצעות גישה המבוססת על זיקה. גרעינים בודדים יכולים לשמש עבור יישומים במורד כגון ניתוח ביטוי גנים וimmunoprecipitation הכרומטין.

בידוד מבוסס זיקה של תייג גרעינים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות לניתוח ביטוי גנים

השאלה כיצד הכרומטין רגולטורים ומדינות הכרומטין משפיעה על הגנום in vivo הוא מפתח להבנה של איך מוקדם החלטות גורל התא נעשות בעובר המתפתח שלנו. שבב Seq-הגישה הפופולרית ביותר לחקור תכונות הכרומטין ברמה-הוא גלובלית המפורטים כאן לעוברי צפרדעים.

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב Seq

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

עבודה זו מתאר פרוטוקול עבור הדור של רזולוציה גבוהה בחיי עיר ויטמינצ'יק ספריות מ מבוים בחוזקה gastrulation קדם דרוזופילה melanogaster עוברי.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

שיטה זו נועדה לעקוב אחר היווצרות תחומים PRC2-בתיווך כרומטין בקווי התא, ואת השיטה ניתן להתאים מערכות רבות אחרות.

שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

פרוטוקול זה נועד לדמיין אגרגטים הטרוקרומטין בתאי טוריטנה Drosophila.

כתמים אימונופלואורסצנטיים להדמיה של חלבונים הקשורים הטרוכרומטין בבלוטות הרוק של דרוסופילה

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

למדו שיטת ChIP לניתוח מצב כרומטין ב-Drosophila באמצעות רקמה מבודדת. טכניקה זו מאפשרת חקר אינטראקציות חלבון-דנ"א בתנאים פיזיולוגיים אמיתיים ומספקת תובנות לגבי ויסות גנים בביולוגיה של הכרומטין.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

גלה סרטונים נוספים