Name: הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: למדו שיטת ChIP לניתוח מצב כרומטין ב-Drosophila באמצעות רקמה מבודדת. טכניקה זו מאפשרת חקר אינטראקציות חלבון-דנ"א בתנאים פיזיולוגיים אמיתיים ומספקת תובנות לגבי ויסות גנים בביולוגיה של הכרומטין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות מעבדה ד&quot;ר Keji של ג&#39;או (NIH / NHLBI) על עזרתם במתן תוצאות רצף. אנו רוצים גם להודות פרויקט הגנום UCSC לשימוש של דפדפן הגנום לדמיין רצף ממופה קורא. עבודה זו נתמכה על ידי מסלול R00HD055052 NIH להעניק העצמאות R01HD065816 מ NICHD, Parkard לוסיל קרן, ואת ג &#39;ון הופקינס סטארט אפ מימון XC

<ol><li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li>
<li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li>
<li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li>
<li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bag-of-marbles%3A+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li>
<li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li>
<li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

צדדיות של ניתוחים שבב שנדונו פרוטוקול זה יכול לשמש על רקמות שונות, אשר מספק הזדמנות לבחון את מצב הכרומטין במערכת רלוונטיות מבחינה ביולוגית. ניסויים שבב באמצעות תאים בתרבית ממערכות נוח לבצע בגלל כמות גדולה של תאים ניתן להשיג בקלות. עם זאת, תאים בתרבית אינן משקפות בהכרח את התאים בסביבה מרובת הסלולר. על ידי פיתוח טכניקה זו באמצעות רקמות גזור מבעלי חיים, אנחנו יכולים לענות על שאלות רבות תאים בתרבית לא יכול. למרות התו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם מיני קוקטייל </td><td> רוש </td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td> פורמלדהיד (37%) </td><td> Supelco </td><td> 47083-U </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> סיגמא </td><td> 78830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes גלולה העלי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> PCR ערכת טיהור </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> יישור קווי polyacrylamide </td><td> סיגמא </td><td> 56575-1ML </td><td></td></tr><tr><td> גליקוגן </td><td> Qiagen </td><td> 158930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR ירוק / רוקס QPCR מיקס מאסטר </td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td> מיני הצלחת טווה </td><td> Labnet </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td> בזמן אמת, מערכת ה-PCR </td><td> יישומי Biosystem </td><td> 4351101 </td><td></td></tr><tr><td> נפח מעבד קטן Ultrasonic </td><td> Misonix </td><td> HS-XL2000 </td><td> דגם הופסק </td></tr><tr><td> Dynabeads, חלבון </td><td> Invitrogen </td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td> Dynamag מגנט </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> פנול: Chlorofrom: רשות העתיקות </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> Epicentre DNA קצה ערכת תיקון </td><td> Epicentre ביוטכנולוגיות </td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute Reaction ערכת ניקוי </td><td> Qiagen </td><td> 28204 </td><td></td></tr><tr><td> Klenow שבר (3 &#39;→ 5&#39; exo-) </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA ligase </td><td> Promega Corporation </td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td> מתאם oligonucleotides </td><td> Illumina </td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td> יחד סוף פריימר 1.0 ו 2.0 </td><td> Illumina </td><td> 1001783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-Gel Electorphoresis מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X Phusion HF Mastermix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

אפיגנטיקה נשאר בתחום המתפתח במהירות כי מחקרים איך המדינה הכרומטין תורם ביטוי ההפרש גנים סוגי תאים שונים בשלבים התפתחותיים שונים. תקנה epigenetic תורם ספקטרום רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל התמיינות במהלך ההתפתחות העוברית הומאוסטזיס בבגרות. אסטרטגיה קריטית במחקרים אפיגנטים המשנים היא לבחון כיצד שינויים היסטון שונים וגורמים הכרומטין לווסת את ביטוי הגנים. לכתובת זו, הכרומטין immunoprecipitation (שבב) נעשה שימוש נרחב כדי לקבל תמונת מצב של הקשר של גורמים מסוימים עם ה-DNA בתאים של עניין. הטכניקה שבב כלל משתמשת בתאי תרבית חומר המוצא, אשר ניתן להשיג בשפע והומוגניות להפיק נתונים לשחזור. עם זאת, ישנם מספר תנאים: ראשית, הסביבה לגדול תאים בצלחת פטרי שונה מזה in vivo, ולכן עשוייםלא משקפים את מצב הכרומטין אנדוגני של התאים בכל יצור חי. שנית, לא כל סוגי התאים יכולים להיות vivo לשעבר תרבותי. יש רק מספר מוגבל של שורות תאים, אשר אדם יכול להשיג מספיק חומר assay שבב. כאן אנו מתארים שיטה לעשות ניסוי שבב באמצעות רקמות תסיסנית. חומר המוצא היא גזור רקמה מן החי, ובכך יכול לשקף במדויק את מצב הכרומטין אנדוגני. ההסתגלות של שיטה זו עם סוגים שונים של רקמות יאפשר לחוקרים להתייחס הרבה יותר מבחינה ביולוגית שאלות רלוונטיות לגבי רגולציה epigenetic ב 1 vivo, 2. שילוב שיטה זו עם רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יהיה עוד יותר לאפשר לחוקרים לקבל הנוף epigenomic.

לאחרונה תפוקה גבוהה טכנולוגיית ריצוף גדלה מאוד הרגישות של הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הניסוי מתבקש יישומו באמצעות תאים או רקמות גזור מטוהרים. כאן אנו קובעים שיטה להשתמש בטכניקה שבב עם<em&gt; תסיסנית</emרקמת&gt;, אשר יכול להתמודד עם מצב הכרומטין אנדוגני במערכת הביולוגית היטב מאופיין.

האפיגנטיקה נותרת תחום המתפתח במהירות, החוקר כיצד מצב הכרומטין תורם לביטוי גנים דיפרנציאלי בסוגי תאים שונים ב...

נוהל זה מייצר נתונים של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) מרקמת זבוב שחוטתה, כדי לשקף במדויק את מצב הכרומטין בתוך רקמת drosophila בחיים (in vivo). במקרה זה, מאות אשכים נאספים על ידי דיסקציה ידנית. בדיקות שיקוע חיסוני של כרומטין מבוצעות באמצעות נוגדן נגד החלבון המדובר.ביצוע ניתוח כמותי באמצעות R-T-P-C-R כמעקב לבדיקת העשרה של האזור הגנומי הספציפי ב-DNA המנוקב (chipped) והמטוהר. לחלופין, ריצוף בייצור גבוה (high throughput sequencing) של דגימת השבב מייצר פרופיל של כל הגנום. בסופו של דבר, ניתוח שבב של רקמה מופרדת מספק ייצוג של מצב הכרומטין בתאים מתחת לתנאיהם הפיזיולוגיים.פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה עבור אנליזה של רקמות שבודדו ישירות מהאורגניזם. על מנת לקבל מצבי כרומטין ומידע אפיגנטי תחת תנאים פיזיולוגיים ממשיים, נדגים את השימוש ב-ChIP ב-Drosophila כדי לבחון את מצב הכרומטין. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על אורגניזמים אחרים, כגון עכבר או דג זברה.הדגמה חזותית של פרוטוקול זה היא קריטית כדי להשיג DNA באיכות ובכמויות מספקות לשימוש עבור שבב או ליצירת ספריות רצף עבור רצף בתפוקה גבוהה. ראשית, יש לבצע דיסקציה של הרקמה הרלוונטית, במקרה זה כ-200 זוגות של אשכים של drosophila, ב-PBS קר המכיל מעכב פרוטאז ו-100 micrograms per milliliter PMSF. לאחר שטיפה כפולה של הרקמה, יש להחזיר אותה לתמיסול ב-200 microliters מאותו תמיס PBS עם המעכבים.לאחר מכן, קבעו את הדגימה באמצעות 5.5 µL של פורמלהיד 37% מחומם. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. ערבבו במערבל Vortex כל חמש דקות, ואז אפשרו לרקמה להתרגוע על קרח.שטפו פעמיים עם 450 µL של PBS המכיל מעכבים. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 20°C- . העבירו את 200 דגימות האשכים של ה-oph לפרוביטת אפנדורף בנפח 1.75 mL.שאבו את הבאפר והשעיקו מחדש את הדגימות ב-200 microliters של באפר ליזיס. פרקו את הרקמה לחלוטין באמצעות הומוגניзатор כחול, תוך הבטחה שלא נשארו אגרגטים, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.לאחר מכן, פרקקו את הדגימה באמצעות microchip soat, והמתינו על קרח למשך 50 שניות. חזרו על הפעולה ארבע עד חמש פעמים כדי להשיג את גודל הפסיגות האופטימלי עבור מטרה ה-chip. לאחר מכן, דללו עם 1.8 milliliters של ripper buffer להכנת תמיסת מלאי של תמצית כרומטין. לצורך ביצוע מוצלח של בדיקת chip, קריטי לקבוע באופן אמפירי את גודל מקטעי ה-DNA.כעת עלינו לבצע אלקטרופורזה של ג'ל כדי להמשיך לניסוי השבב. עבור דגימת בקרת הקלט, הסר 50 µL. הוסף 2 µL של sodium chloride בריכוז 5 M והדגר בטמפרטורה של 65 °C למשך לילה.כדי לבטל את הקישור הצלב, המשיכו בצמיד של הנוגדן לחלבון. חרוזי Protein A באנבונה של 1.5 מיליליטר. הוסיפו 40 µL של חרוזי Protein A ו-600 µL של PBS וערבבו בסיבוב (rock) בטמפרטורה של 4 °C למשך שתי דקות.לאחר מכן, העבירו את החרוזיים למגנט והשליכו את הנוזל העליון. כעת הוסיפו 100 µL של PBS וכן את הנוגדן הרלוונטי. דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.לאחר איסוף החרוזים באמצעות מגנט, הוסיפו 1 mL של תמצית כרומטין מרקמה. סובבו במערבל בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה. לאחר מכן, הניחו את דגימת ה-ChIP על מגנט והסירו את הנוזל העליון (supinate).בצע שטיפות של מיליליטר אחד עבור החרוזיים שנאספו בטמפרה של 4 °C למשך 10 דקות לכל שטיפה, ולאחר מכן השהה את החרוזיים ב-100 µL של tea buffer. כדי לבטל את הקשירה הצולבת (reverse cross-link) של קומפלקסי חלבון-DNA, הוסף 3 µL של 10% SDS ו-5 µL של Proteinase K בריכוז של 20 mg/mL. הדגרה בטמפרה של 65 °C למשך הלילה.שקעו את החרוזים באמצעות מגנט. העבירו את הנוזל העליון המכיל DNA לשפופרת חדשה. שטפו את החרוזים פעם אחת ואחדו את הנוזלים העליונים המכילים DNA.בשלב הבא, טהרו את ה-DNA באמצעות מיצוי פנול-כלורופורם והעבירו את השכבה המימית העליונה למבחנה חדשה. השקיעו את ה-DNA באמצעות 20 µg/mL של אקרילמידה ליניארית או גליקוגן, 20 µL של נתרן אצטט בריכוז 3 M ו-500 µL של 100% Ethanol.ערבבו היטב והדגירו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שקעו את ה-DNA באמצעות צנטריפוגה. השליכו את הנוזל העליון ושטפו את המשקע פעם אחת עם 300 µL של 70% ethanol לאחר ייבוש באוויר.יש להמיס את כדוריות ה-DNA ב-50 µL של תמיפת TE. יש לשמור את דגימות ה-DNA המוקצצות בטמפרטורה של 20- °C. הכין דילולים סדרתיים של DNA גנומי עבור עקום התקן.בפלטה בעלת 96 בארות, תוך שימוש בתבניות של בקרה פנימית של DNA גנומי מדולל או DNA חתוך (chipped DNA), הכין תגובות qPCR בנפח של 20 µL בשכפול. סבב את הפלטה בעלת 96 הבארות במסבב פלטות מיניאטורי. הרץ את פלטת הדגימות במערכת real-time PCR כדי לתקף את הנתונים. ראשית, ודא קיומו של שיא בודד בעקומת הדיסוציאציה התרמית, המעיד על אמפליקון בודד מה-PCR.בשלב הבא, שרטט את עקומת הסטנדרט. באמצעות הנתונים מסדרת ה-DNA הגנומי המדולל, חשב את הנוסחה המגדירה את כמות ה-DNA בהתאם לסף המחזור, Ct. כמו כן, קבע את השלב הליניארי של ההגברה האקספוננציאלית של ה-PCR עבור כל סט פריימרים.אם ערכי ה-CT של דגימות ה-DNA מהשבב ושל דגימות בקרת הקלט נמצאים בטווח הליניארי של ערכי ה-CT, יש לחשב את ההעשרה של ה-DNA מהשבב לעומת הקלט שנלקח בחשבון. דללו ותקנו קצוות של 0.1 עד 5 µg של DNA מהשבב בתגובות של 50 µL המכילות T4 DNA polymerase ו-T4 polynucleotide kinase. בהתאם להוראות היצרן, דגרו למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, טהרו את ה-DNA באמצעות ערכה לניקוי תגובה מסוג MinLu. המשיכו בהוספת בליטות (overhangs) לקצה ה-3' באמצעות DNA polymerase, fragment גדול של CLA NOW ו-DATP, והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C. שוב, העבירו את התגובה דרך עמודת ספינ (spin column) כדי לטהר ולרכז את ה-DNA.המשיכו לביצוע ליגציה עם אוליגו-מתאם. ערבבו את התערובת מ-Illumina תוך שימוש ב-T four DNA Ligase והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את הדגימה דרך ערכת ניקוי לתגובת MinLu.אלוטציה של ה-DNA ב-20 µL. לאחר מכן, יש להפריד את דגימת ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה במכשיר ג'ל. בודדים את פס הפס (band) בגודל 200 עד 400 זוגות בסיסים מהג'ל ומטהרים אותו באמצעות ערכת KYOGEN gel extraction.כעת הגבירו ספריית DNA באמצעות פריימרים לקצוות מדשקים (paired end primers), אנזימי fusion HF ו-pH מתוכנית של Illumina ב-20 מחזורי PCR. לאחר מכן, בדוכס ג'ל אגרוז (AOSE) סטנדרטי בריכוז 2%, בודדו מקטעי DNA באורך 200 עד 400 זוגות בסיסים עבור ריצוף בספיקו גבוה (high throughput sequencing) בתוכנה של Ellen. יישרו את כל הקריאות אל הגנום של drosophila, תוך התרה של עד שתי אי-התאמות (mismatches) ביחס לרצף הייחוס.שמר קריאות שמופו באופן ייחודי עבור ניתוחים המשכיים במקרה של מספר קריאות זהות. שמר עד שלושה עותקים כדי להפחית את האפשרות להטיות הנובעות מהגברה ב-PCR. לאחר מכן, השתמש בסקריפט Python כדי להמיר את הפלט של צינור העבודה של GA לקובצי נתונים הניתנים להרחבה בדפדפן.הגדירו גודל חלון של ארבעה זוגות בסיסים וגודל מקטע DNA של 160 זוגות בסיסים. סווגו את הגנים של ה-drosophila לגנים שקטים וגנים מובעים על פי RPKM. באמצעות מספר דיגיטלי, סמנו גנים שערך ה-RPKM שלהם שווה לאפס.סווגו את הגנים עם RPKM הגבוה מ-1 כקבוצה שקטה, ואת השאר כקבוצה מובעת הכוללת שלוש תתי-קבוצות של רמות ביטוי נמוכות, בינוניות וגבוהות. לבסוף, השוו בין רמות המודיפיקציה של ההיסטונים לבין רמות ביטוי הגנים באמצעות סקריפט Python שתואר בעבר ב-basal 2007, the bag of marbles. באשכים של המוטנטים קיימת כשל במעבר מספירמטוגוניה proliferatively לספרוציטים מתמיינים.ניסוי chip QPCR זה משתמש באשכים של BAM כמקור לתאי נבט לא מבדלים, כדי לבחון את מצב הכרומטין של גנים מרכזיים הדרושים להבחנה של תאי זרע, והעשרה של מודיפיקציות היסטון, H3K27me3 או H3K4me3. רמת הביטוי של גני ההבחנה נקבעת באמצעות נורמליזציה לגן cyclin A המובע באופן קבוע. גני ההבחנה male specific transcription factor 87 (Don Juan) ו-fuzzy onion, שאינם מובעים באשכי BAM, עשירים מאוד במודיפיקציית ההיסטון המדכאת H3K27me3.יתרה מכך, הם נטולי ההיסטון הפעיל. שלושה, מודיפיקציית היסטון H3K4me3. חתימת כרומטין שאנו מכנים מונו-ולנטית, בניגוד לוולנטיות הכוללת גם את H3K4me3 וגם את היסטון 3.העשרה של lysine 27 methyl three בגנים של דיפרנציאציה בתאי גזע עובריים. נתוני רצף Chip תוך שימוש באותה קבוצה של נוגדנים. אישור תוצאות ה-chip QPCR המוצגות באיור 1A: אזורים גנומיים של כל שלושת הגנים לבדיקת דיפרנציאציה סופית מועשרים מאוד ב-three lysine, 27 methyl three, אך לא ב-histone three, lysine four methyl three.בניגוד לכך, ל-cyclin aging המבטא באופן קבוע יש רמות גבוהות של histone three lysine, four methyl three, אך רמות נמוכות של histone three lysine 27 methyl three בקרבת אתר תחילת השעתוק שלו. דמות זו מציגה נתוני ChIP-seq של שני שינויים היסטוניים בקרבת אתרי תחילת השעתוק של ארבע מחלקות של גנים המבטאים באופן דיפרנציאלי. Histone three, lysine 27 methyl three מועשר במורד אתרי תחילת השעתוק, דבר המתואם באופן הפוך עם רמת ביטוי הגן.הגנים השקטים מראים את הרמה הגבוהה ביותר של histone three lysine 27 methyl three, בעוד שגנים המבטאים רמה גבוהה אינם מראים קישור של histone three lysine 27 methyl three, דבר התואם את תפקידו המדכא של histone three, lysine 27 methyl three על ביטוי גנים. לעומת זאת, העשרה של המודיפיקציה histone three, lysine four methyl three סביב אתרי תחילת השעתוק הראתה מתאם הפוך עם רמת ביטוי הגנים, באופן התואם את תפקידו הפעיל של histone three, lysine four, methyl three בביטוי גנים.לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו כראוי בתוך יומיים עד שלושה. אין לשכוח להקפיד על אמצעי בטיחות בעת שימוש ב-phyl, כלורופורם ופורמלהיד. אנו מקווים שפרוטוקול זה העניק לכם הבנה מספיקה בשימוש בשיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) כדי לבחון את נוף הכרומטין ברקמה in vivo.

chromatin-immunoprecipitation-chip-using-drosophila-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ההבחנה בין ESC עולה בקנה אחד עם תא מסוג שינויים ספציפיים במבנה ובהרכב של הכרומטין. זיהוי של שינויים אלה מספק תובנות רבות ערך את המנגנונים שמגדירים stemcellness והתמיינות תאים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מייצגת שיטת ערך לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס תא גזע בידול.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

זה פרוטוקול וידאו ממחיש את הטכניקה סקווש המשמשים את המעבדה יוהנסן...

הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

אנו מדגימים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) שיטה לזהות אינטראקציות גורם ספציפי על רקמות גנים במהלך או לאחר הופעת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות ברקמות עובריים בעכבר. פרוטוקול זה צריך להיות רלוונטי נרחב לחקר ההפעלה רקמות ספציפיות גן כפי שהיא מתרחשת במהלך ההתפתחות העוברית נורמלי.

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

ציוץ הוא טכניקה חדשנית ומהירה למפות אתרי הקישור הגנומי של RNAs noncoding ארוכות (lncRNAs). השיטה מנצלת את הייחודיות של תחושת אנטי oligonucleotides ריצוף כדי לאפשר ספירה של lncRNA הנכנס אתרים הגנומי.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

רקמות דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית של סוגי תאים. כדי לבחון ביטוי גנים בסוגי תאים מסוימים מרקמה מסוימת, גרעינים יכולים להיות מתויגים גנטי ולאחר מכן מבודד באמצעות גישה המבוססת על זיקה. גרעינים בודדים יכולים לשמש עבור יישומים במורד כגון ניתוח ביטוי גנים וimmunoprecipitation הכרומטין.

בידוד מבוסס זיקה של תייג גרעינים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות לניתוח ביטוי גנים

השאלה כיצד הכרומטין רגולטורים ומדינות הכרומטין משפיעה על הגנום in vivo הוא מפתח להבנה של איך מוקדם החלטות גורל התא נעשות בעובר המתפתח שלנו. שבב Seq-הגישה הפופולרית ביותר לחקור תכונות הכרומטין ברמה-הוא גלובלית המפורטים כאן לעוברי צפרדעים.

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב Seq

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

עבודה זו מתאר פרוטוקול עבור הדור של רזולוציה גבוהה בחיי עיר ויטמינצ'יק ספריות מ מבוים בחוזקה gastrulation קדם דרוזופילה melanogaster עוברי.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

שיטה זו נועדה לעקוב אחר היווצרות תחומים PRC2-בתיווך כרומטין בקווי התא, ואת השיטה ניתן להתאים מערכות רבות אחרות.

שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

פרוטוקול זה נועד לדמיין אגרגטים הטרוקרומטין בתאי טוריטנה Drosophila.

כתמים אימונופלואורסצנטיים להדמיה של חלבונים הקשורים הטרוכרומטין בבלוטות הרוק של דרוסופילה

למדו שיטת ChIP לניתוח מצב כרומטין ב-Drosophila באמצעות רקמה מבודדת. טכניקה זו מאפשרת חקר אינטראקציות חלבון-דנ"א בתנאים פיזיולוגיים אמיתיים ומספקת תובנות לגבי ויסות גנים בביולוגיה של הכרומטין.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

גלה סרטונים נוספים