הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

נוהל זה מייצר נתונים של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) מרקמת זבוב שחוטתה, כדי לשקף במדויק את מצב הכרומטין בתוך רקמת drosophila בחיים (in vivo). במקרה זה, מאות אשכים נאספים על ידי דיסקציה ידנית. בדיקות שיקוע חיסוני של כרומטין מבוצעות באמצעות נוגדן נגד החלבון המדובר.

ביצוע ניתוח כמותי באמצעות R-T-P-C-R כמעקב לבדיקת העשרה של האזור הגנומי הספציפי ב-DNA המנוקב (chipped) והמטוהר. לחלופין, ריצוף בייצור גבוה (high throughput sequencing) של דגימת השבב מייצר פרופיל של כל הגנום. בסופו של דבר, ניתוח שבב של רקמה מופרדת מספק ייצוג של מצב הכרומטין בתאים מתחת לתנאיהם הפיזיולוגיים.

פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה עבור אנליזה של רקמות שבודדו ישירות מהאורגניזם. על מנת לקבל מצבי כרומטין ומידע אפיגנטי תחת תנאים פיזיולוגיים ממשיים, נדגים את השימוש ב-ChIP ב-Drosophila כדי לבחון את מצב הכרומטין. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על אורגניזמים אחרים, כגון עכבר או דג זברה.

הדגמה חזותית של פרוטוקול זה היא קריטית כדי להשיג DNA באיכות ובכמויות מספקות לשימוש עבור שבב או ליצירת ספריות רצף עבור רצף בתפוקה גבוהה. ראשית, יש לבצע דיסקציה של הרקמה הרלוונטית, במקרה זה כ-200 זוגות של אשכים של drosophila, ב-PBS קר המכיל מעכב פרוטאז ו-100 micrograms per milliliter PMSF. לאחר שטיפה כפולה של הרקמה, יש להחזיר אותה לתמיסול ב-200 microliters מאותו תמיס PBS עם המעכבים.

לאחר מכן, קבעו את הדגימה באמצעות 5.5 µL של פורמלהיד 37% מחומם. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. ערבבו במערבל Vortex כל חמש דקות, ואז אפשרו לרקמה להתרגוע על קרח.

שטפו פעמיים עם 450 µL של PBS המכיל מעכבים. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 20°C- . העבירו את 200 דגימות האשכים של ה-oph לפרוביטת אפנדורף בנפח 1.75 mL.

שאבו את הבאפר והשעיקו מחדש את הדגימות ב-200 microliters של באפר ליזיס. פרקו את הרקמה לחלוטין באמצעות הומוגניзатор כחול, תוך הבטחה שלא נשארו אגרגטים, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר מכן, פרקקו את הדגימה באמצעות microchip soat, והמתינו על קרח למשך 50 שניות. חזרו על הפעולה ארבע עד חמש פעמים כדי להשיג את גודל הפסיגות האופטימלי עבור מטרה ה-chip. לאחר מכן, דללו עם 1.8 milliliters של ripper buffer להכנת תמיסת מלאי של תמצית כרומטין. לצורך ביצוע מוצלח של בדיקת chip, קריטי לקבוע באופן אמפירי את גודל מקטעי ה-DNA.

כעת עלינו לבצע אלקטרופורזה של ג'ל כדי להמשיך לניסוי השבב. עבור דגימת בקרת הקלט, הסר 50 µL. הוסף 2 µL של sodium chloride בריכוז 5 M והדגר בטמפרטורה של 65 °C למשך לילה.

כדי לבטל את הקישור הצלב, המשיכו בצמיד של הנוגדן לחלבון. חרוזי Protein A באנבונה של 1.5 מיליליטר. הוסיפו 40 µL של חרוזי Protein A ו-600 µL של PBS וערבבו בסיבוב (rock) בטמפרטורה של 4 °C למשך שתי דקות.

לאחר מכן, העבירו את החרוזיים למגנט והשליכו את הנוזל העליון. כעת הוסיפו 100 µL של PBS וכן את הנוגדן הרלוונטי. דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

לאחר איסוף החרוזים באמצעות מגנט, הוסיפו 1 mL של תמצית כרומטין מרקמה. סובבו במערבל בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה. לאחר מכן, הניחו את דגימת ה-ChIP על מגנט והסירו את הנוזל העליון (supinate).

בצע שטיפות של מיליליטר אחד עבור החרוזיים שנאספו בטמפרה של 4 °C למשך 10 דקות לכל שטיפה, ולאחר מכן השהה את החרוזיים ב-100 µL של tea buffer. כדי לבטל את הקשירה הצולבת (reverse cross-link) של קומפלקסי חלבון-DNA, הוסף 3 µL של 10% SDS ו-5 µL של Proteinase K בריכוז של 20 mg/mL. הדגרה בטמפרה של 65 °C למשך הלילה.

שקעו את החרוזים באמצעות מגנט. העבירו את הנוזל העליון המכיל DNA לשפופרת חדשה. שטפו את החרוזים פעם אחת ואחדו את הנוזלים העליונים המכילים DNA.

בשלב הבא, טהרו את ה-DNA באמצעות מיצוי פנול-כלורופורם והעבירו את השכבה המימית העליונה למבחנה חדשה. השקיעו את ה-DNA באמצעות 20 µg/mL של אקרילמידה ליניארית או גליקוגן, 20 µL של נתרן אצטט בריכוז 3 M ו-500 µL של 100% Ethanol.

ערבבו היטב והדגירו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שקעו את ה-DNA באמצעות צנטריפוגה. השליכו את הנוזל העליון ושטפו את המשקע פעם אחת עם 300 µL של 70% ethanol לאחר ייבוש באוויר.

יש להמיס את כדוריות ה-DNA ב-50 µL של תמיפת TE. יש לשמור את דגימות ה-DNA המוקצצות בטמפרטורה של 20- °C. הכין דילולים סדרתיים של DNA גנומי עבור עקום התקן.

בפלטה בעלת 96 בארות, תוך שימוש בתבניות של בקרה פנימית של DNA גנומי מדולל או DNA חתוך (chipped DNA), הכין תגובות qPCR בנפח של 20 µL בשכפול. סבב את הפלטה בעלת 96 הבארות במסבב פלטות מיניאטורי. הרץ את פלטת הדגימות במערכת real-time PCR כדי לתקף את הנתונים. ראשית, ודא קיומו של שיא בודד בעקומת הדיסוציאציה התרמית, המעיד על אמפליקון בודד מה-PCR.

בשלב הבא, שרטט את עקומת הסטנדרט. באמצעות הנתונים מסדרת ה-DNA הגנומי המדולל, חשב את הנוסחה המגדירה את כמות ה-DNA בהתאם לסף המחזור, Ct. כמו כן, קבע את השלב הליניארי של ההגברה האקספוננציאלית של ה-PCR עבור כל סט פריימרים.

אם ערכי ה-CT של דגימות ה-DNA מהשבב ושל דגימות בקרת הקלט נמצאים בטווח הליניארי של ערכי ה-CT, יש לחשב את ההעשרה של ה-DNA מהשבב לעומת הקלט שנלקח בחשבון. דללו ותקנו קצוות של 0.1 עד 5 µg של DNA מהשבב בתגובות של 50 µL המכילות T4 DNA polymerase ו-T4 polynucleotide kinase. בהתאם להוראות היצרן, דגרו למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, טהרו את ה-DNA באמצעות ערכה לניקוי תגובה מסוג MinLu. המשיכו בהוספת בליטות (overhangs) לקצה ה-3' באמצעות DNA polymerase, fragment גדול של CLA NOW ו-DATP, והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C. שוב, העבירו את התגובה דרך עמודת ספינ (spin column) כדי לטהר ולרכז את ה-DNA.

המשיכו לביצוע ליגציה עם אוליגו-מתאם. ערבבו את התערובת מ-Illumina תוך שימוש ב-T four DNA Ligase והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את הדגימה דרך ערכת ניקוי לתגובת MinLu.

אלוטציה של ה-DNA ב-20 µL. לאחר מכן, יש להפריד את דגימת ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה במכשיר ג'ל. בודדים את פס הפס (band) בגודל 200 עד 400 זוגות בסיסים מהג'ל ומטהרים אותו באמצעות ערכת KYOGEN gel extraction.

כעת הגבירו ספריית DNA באמצעות פריימרים לקצוות מדשקים (paired end primers), אנזימי fusion HF ו-pH מתוכנית של Illumina ב-20 מחזורי PCR. לאחר מכן, בדוכס ג'ל אגרוז (AOSE) סטנדרטי בריכוז 2%, בודדו מקטעי DNA באורך 200 עד 400 זוגות בסיסים עבור ריצוף בספיקו גבוה (high throughput sequencing) בתוכנה של Ellen. יישרו את כל הקריאות אל הגנום של drosophila, תוך התרה של עד שתי אי-התאמות (mismatches) ביחס לרצף הייחוס.

שמר קריאות שמופו באופן ייחודי עבור ניתוחים המשכיים במקרה של מספר קריאות זהות. שמר עד שלושה עותקים כדי להפחית את האפשרות להטיות הנובעות מהגברה ב-PCR. לאחר מכן, השתמש בסקריפט Python כדי להמיר את הפלט של צינור העבודה של GA לקובצי נתונים הניתנים להרחבה בדפדפן.

הגדירו גודל חלון של ארבעה זוגות בסיסים וגודל מקטע DNA של 160 זוגות בסיסים. סווגו את הגנים של ה-drosophila לגנים שקטים וגנים מובעים על פי RPKM. באמצעות מספר דיגיטלי, סמנו גנים שערך ה-RPKM שלהם שווה לאפס.

סווגו את הגנים עם RPKM הגבוה מ-1 כקבוצה שקטה, ואת השאר כקבוצה מובעת הכוללת שלוש תתי-קבוצות של רמות ביטוי נמוכות, בינוניות וגבוהות. לבסוף, השוו בין רמות המודיפיקציה של ההיסטונים לבין רמות ביטוי הגנים באמצעות סקריפט Python שתואר בעבר ב-basal 2007, the bag of marbles. באשכים של המוטנטים קיימת כשל במעבר מספירמטוגוניה proliferatively לספרוציטים מתמיינים.

ניסוי chip QPCR זה משתמש באשכים של BAM כמקור לתאי נבט לא מבדלים, כדי לבחון את מצב הכרומטין של גנים מרכזיים הדרושים להבחנה של תאי זרע, והעשרה של מודיפיקציות היסטון, H3K27me3 או H3K4me3. רמת הביטוי של גני ההבחנה נקבעת באמצעות נורמליזציה לגן cyclin A המובע באופן קבוע. גני ההבחנה male specific transcription factor 87 (Don Juan) ו-fuzzy onion, שאינם מובעים באשכי BAM, עשירים מאוד במודיפיקציית ההיסטון המדכאת H3K27me3.

יתרה מכך, הם נטולי ההיסטון הפעיל. שלושה, מודיפיקציית היסטון H3K4me3. חתימת כרומטין שאנו מכנים מונו-ולנטית, בניגוד לוולנטיות הכוללת גם את H3K4me3 וגם את היסטון 3.

העשרה של lysine 27 methyl three בגנים של דיפרנציאציה בתאי גזע עובריים. נתוני רצף Chip תוך שימוש באותה קבוצה של נוגדנים. אישור תוצאות ה-chip QPCR המוצגות באיור 1A: אזורים גנומיים של כל שלושת הגנים לבדיקת דיפרנציאציה סופית מועשרים מאוד ב-three lysine, 27 methyl three, אך לא ב-histone three, lysine four methyl three.

בניגוד לכך, ל-cyclin aging המבטא באופן קבוע יש רמות גבוהות של histone three lysine, four methyl three, אך רמות נמוכות של histone three lysine 27 methyl three בקרבת אתר תחילת השעתוק שלו. דמות זו מציגה נתוני ChIP-seq של שני שינויים היסטוניים בקרבת אתרי תחילת השעתוק של ארבע מחלקות של גנים המבטאים באופן דיפרנציאלי. Histone three, lysine 27 methyl three מועשר במורד אתרי תחילת השעתוק, דבר המתואם באופן הפוך עם רמת ביטוי הגן.

הגנים השקטים מראים את הרמה הגבוהה ביותר של histone three lysine 27 methyl three, בעוד שגנים המבטאים רמה גבוהה אינם מראים קישור של histone three lysine 27 methyl three, דבר התואם את תפקידו המדכא של histone three, lysine 27 methyl three על ביטוי גנים. לעומת זאת, העשרה של המודיפיקציה histone three, lysine four methyl three סביב אתרי תחילת השעתוק הראתה מתאם הפוך עם רמת ביטוי הגנים, באופן התואם את תפקידו הפעיל של histone three, lysine four, methyl three בביטוי גנים.

לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו כראוי בתוך יומיים עד שלושה. אין לשכוח להקפיד על אמצעי בטיחות בעת שימוש ב-phyl, כלורופורם ופורמלהיד. אנו מקווים שפרוטוקול זה העניק לכם הבנה מספיקה בשימוש בשיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) כדי לבחון את נוף הכרומטין ברקמה in vivo.