רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות אזורים של ביטוי גנתי ספציפי ולאפיין את העיתוי והרמות של ביטוי הגנים כדי לתרום להבנת תפקוד הגנים. דבר זה מושג על ידי קצירה והכנה מהירות של הרקמה שתשמש בהליך כדי לשמור על שלמות הרקמה. כשלב שני, הרקמה מטופלת כדי להפחית את קישור הרקע של ה-ribo probes.

בשלב הבא, מתבצע היברידיזציה של הגששים (probes) של ה-ribo לרקמה, ואת קישוריות גשש ה-RIBA ויזואליזציה. באמצעות סרט רנטגן או אמולסיה רגישה לאור, מתקבלות תוצאות המראות את המיקום ואת רמת ביטוי הגנים על בסיס תמונות רנטגן או מיקרוסקופיה בשדה בהיר ובשדה כהה וניתוח שלהן. בשימוש בתוכנת Image J, ישנם מספר שלבים קריטיים שחובה לבצע היטב, שבהם אנשים רבים טועים, ואחד מהם הוא מניעת רקע.

ישנם מספר שלבים שעלולים לגרום לרקע, כגון סטורציה לקויה או היברידיזציה בטמפרטורה לא נכונה. גורם נוסף הוא זיהום ב-RNA שיגרום לפירוק של הגשש (probe) ה-RNA שלך. לכן, עליך להקפיד לשמור על כל הציוד נקי מ-RNases.

והדבר השלישי הוא שכאשר טובלים את הפלחיות באמולסיה, עליכם לוודא שאין דליפות אור בחדר החשכה או חשיפה של האמולסיה במהלך כל שלבי התהליך, שיכול להימשך שלושה שבועות. את הטכניקה הזו תדגים Hun Chen, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. לאחר קציר של מוח טרי ושטיפה ב-1× PBS, הטמיעו את המוח במדיום OCT tissue tech על ידי טבילת המוח בתבנית המכילה את המדיום בטמפרטורת החדר.

יש לוודא שהמוח מכוון כנדרש לצורך החיתוך. לאחר מכן, לאחר ריסוס קרח יבש באתנול, הקפיאו את הרקמה על ידי הנחת הבלוק בתוך תערובת האתנול והקרח היבש. תוך הקפדה שלא יחדור אתנול אל תוך הבלוק, חתכו את הרקמה הקפואה לפרוסות בעובי 10 עד 12 מיקרון באמצעות קריוסטט, והעבירו אותן לשקופיות super plus המיועדות לרקמות מוח ועובריות.

טמפרטורת החיתוך המיטבית היא בטווח שבין 18- °C ל-20- °C. יש לאחסן את החתכים בקופסת סליידים בטמפרטורה של 80- °C. העבירו את הסליידים מאחסון ב-80- °C למעמד מתכת על קרח יבש.

לאחר מכן, בעבודה בתוך מנדף כימי מאושר, הכניסו את המתקן לתוך תמיסה של 4% para formaldehyde שחוממה מראש לטמפרטורה הגבוהה ב-3 עד 5 מעלות צלזיוס מטמפרטורת החדר. דגרו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הוציאו את המתקן מה-para formaldehyde ושטפו את השקופיות על ידי טבילת המתקן ב-PBS כ-15 פעמים. חזרו על שלב שטיפה זה פעמיים, תוך שימוש בתמיסת PBS טרייה בכל פעם.

בשלב הבא, טבלו את השקופיות בבופר אצטילציה שהוכן טרי למשך 10 דקות כדי להפחית קישור לא ספציפי של הגשש של ה-RIBA. לאחר מכן, שטפו את השקופיות כפי שבוצע קודם לכן, אך הפעם השתמשו ב-SSPE בריכוז פי 2 כתמיסת שטיפה. ייבשו את הרקמה באמצעות סדרת אתנול בריכוזים של 70%, 95% ו-100% למשך שתי דקות בכל תמיסה.

לאחר מכן ייבשו את השקופיות במנדף במשך 10 עד 15 דקות לפחות. לאחר סינתזת גשש ה-RIBA, בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב, חשבו את הנפח הנדרש של גשש ה-RIBA ושל תמיסת ההיברידיזציה עבור כל השקופיות. חממו מראש את תערובת ההיברידיזציה של גשש ה-Ribo ל-65 °C למשך חמש דקות.

כדי לדנטורה את ה-Ribo probe, שאיף 100 microliters של תמיסת ההיברידיזציה של ה-Ribo probe ופזר אותה לאורך כיסוי הזכוכית. לאחר מכן, השתמש בכיסוי זכוכית שני כדי לפרוס את התמיסה באופן אחיד על הרקמה ועל כיסוי הזכוכית. הנח את הפסייד בצורה אופקית וכשהוא פונה כלפי מעלה בתוך מעמד מתכת, וברגע שכל הפסיידים מוכנים, טבול את המעמד באיטיות באמבט שמן בטמפרטורה של 65 degree Celsius למשך ארבע שעות לפחות ולכל היותר 16 שעות.

השמן יוצר אטימה הרמטית סביב לביבות הכיסוי לאחר האינקובציה. הסר כל עודף שמן ממתקן המתכת המכיל את השקופיות, ולאחר מכן הנח את המתקן בתוך מגש זכוכית או מתכת המכיל כלורופורם בתוך מ 빠르게 מנדף. חזור על השטיפה עם מגש שני המכיל כלורופורם טרי.

בשלב הבא, טבל את המתקן בתוך תמיסת 0.1%betta me cap אתנול בתוספת תמיסת SSPE בריכוז פי 2, כדי לשחרר את לוחות הכיסוי ולהמיס את עודפי תמיסת ההיברידיזציה. לאחר מכן, העבר את השקופיות לתמיסה שנייה ורעננה של 0.1%betta me cap TER אתנול בתוספת תמיסת SSPE בריכוז פי 2. העבר את השקופיות ללא לוחות הכיסוי למתקן חדש במגש המכיל 0.1%beta macca TER אתנול ב-SSPE בריכוז פי 2, והדגש בתמיסה זו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להסיר עודפי פרוב RNA שאינם קשורים.

לאחר מכן, העבירו את מתקן השקופיות לבישול מקדים של תמיסת SSPE בריכוז פי 2 בתוספת 50% main wide solution בטמפרטורה של 65 degrees Celsius, המכילה beta ME ו-ethanol בריכוז סופי של 0.1%, והדגירו בטמפרטורה של 65 degrees Celsius למשך שעה אחת. לאחר ההדגרה, השליכו תמיסה זו ואת כל תמיסות השטיפה המימיות הקודמות, וכן את לוחות הכיסוי, כפסולת רדיואקטיבית. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים ב-0.1 times SSPE שחומם מראש ל-65 degrees Celsius למשך 30 דקות בכל פעם.

לאחר מכן, יש לבצע דהידרציה לרקמה באמצעות סדרת אתנול בריכוזים של 70%, 95% ו-100%, למשך שתי דקות בכל תמיסה. לבסוף, יש לייבש את השקופיות במנדף במשך 30 דקות לפחות. ראשית, כדי לקבוע האם קיים אות רדיואקטיבי ברקמה.

הניחו את השקופיות המיובשות בתוך קסטת סרט, בעבודה בחדר חשוך תחת תאורה בטוחה, והניחו סרט רנטגן מעל השקופיות. ודאו שהשקופיות פונות לצד האמולסיה של הסרט ולאחר מכן סגרו את הקסטת. חשפו את השקופיות לסרט למשך יום אחד עד שבעה ימים, בהתאם לשפע הצפוי של התמלילים.

לאחר השלמת החשיפה, יש לפתח את סרט הרנטגן במפתח ומקבע סטנדרטיים. אות ההיברידיזציה יופיע כאזורים שחורים על הסרט, כתוצאה מגריסי כסף שנחשפו באמולסיה, כדי לקבוע את הרזולוציה התאית ולראות את האות על הרקמה עצמה. את השקופיות טובלים באמולסיה פוטוגרפית ולאחר מכן מבצעים צביעה נגדית.

אם יש לצבוע את השקופיות בצביעה נגדית של סגול קריסטל (crystal violet), יש לבצע דה-ליקווידציה (deliquidization) לחתכים בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב. בשלב זה, בעבודה בחדר חשוך, מזגו מים מזוקקים למבחנה. הוציאו כמות של תחליב NTB ודללו את התחליב במים מזוקקים ביחס של אחד לאחד.

לאחר המסת האמולסיה באמבט מים של 42 °C למשך 20 עד 30 דקות, העבר אותה למכל טבילה מזכוכית המוצב באמבט מים של 42 °C למשך 20 עד 30 דקות. גובה האמולסיה המדוללת צריך להיות כעת כזה המכסה את כל החתכים על גבי השקופית כאשר טובלים אותה בתוכו. במקרה של כמות גדולה של שקופיות, ייתכן שיהיה צורך באמולסיה נוספת.

כעת טבלו את השקופיות באמולסיה המדוללת בתוך אמבט מים בטמפרטורה של 42 °C, ולאחר מכן ייבשו את השקופיות בתוך מכל סגור ואטום לאור למשך לילה בחדר חשוך, או בתנור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים עד שלוש שעות כאשר האורות כבויים. לאחר הייבוש, העבירו את השקופיות לקופסת שקופיות. אטמו את הקצוות בעזרת סרט בידוד שחור וכסו אותן בנייר אלומיניום.

יש לאחסן את הקופסאות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך מספר ימים עד שבועות; כאשר מגיעים לשלב הפיתוח, יש לחמם את השקופיות לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בעבודה בחדר חשוך, מוציאים את המתקן המכיל את השקופיות מהקופסאות ומפתחים אותן בתמיסת הפיתוח codec D 19 בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות. לבסוף, שוטפים את השקופיות המפותחות במי ברז בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.

לאחר מכן, יש להדגיר את השקופיות פעמיים בתמיסת קיבוע בטמפרטורה של 19 degrees Celsius למשך שש דקות בכל פעם; ניתן להדליק את אורות החדר במהלך הדגרת הקיבוע השנייה. כעת, יש לשטוף את השקופיות במים זורמים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן, בעזרת להב תער, גרדו את האמולסיה מגב השקופית בעוד היא רטובה.

לבסוף, בצעו צביעה נגדית עם crystal violet בריכוז 0.3%, ולאחר מכן בצעו דהידרטציה והרכבה של השקופיות בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב במידת הצורך. נקו שאריות אמולסיה מהצד האחורי של השקופיות על ידי הרטבה במים וגירוד באמצעות להב תער. שטפו את השקופיות בתמיסת ethanol 80% ונגבו בעדינות פעם אחת או פעמיים כדי להסיר לכלוך ואבק.

צלם תמונות תחת תאורה של שדה חשוך (darkfield) או שדה בהיר (brightfield). ייתכן שיהיה צורך לחזור על שלבי הגרידה והניקוי פעמיים עד שלוש פעמים כדי להשיג תמונות איכותיות ללא חלקיקי אבק, הנראים בקלות בשדה חשוך תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. התמונות הבאות הן דוגמאות לאוטורדיוגרפיה של היברידיזציה in situ מסרטי רנטגן.

תמונת סרט רנטגן זו מציגה חתך סגיטלי של ראש שלם של ציפור שיר מסוג Zebra Finch ביום עוברי 10, שעבר היברידיזציה עם גשש ribo antisense ל-Fox P one. הגרעינים השחורים החשופים על הסרט מראים ביטוי של messenger RNA כפי שניתן לראות בתוך המוח; כאן Fox P one messenger RNA מועשר ב-meso alium stri aum וב-dorsal thalamus. תמונת סרט הרנטגן מציגה חתך מאותה ציפור שיר Zebra finch שעברה היברידיזציה עם גשש 90 cents RIBA ל-Cuper.

TF two מועשר ב-palam alium ובחלקים ונטראליים יותר של התלמוס. התמונות הבאות הן דוגמאות של רדיוגרפיה עצמית של היברידיזציה in situ משקפיות טבילה באמולסיה. תמונת שדה אפל זו, שצולמה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מראה חתך סגיטלי של ראש שלם של פנסי זברה ביום השישי לאחר הבקיעה, אשר עבר היברידיזציה עם גשש antisense RIBA ל-Fox P one.

גרגירי הכסף הלבנים החשופים באמולסיה מעל הרקמה מעידים על ביטוי של messenger RNA. הצבע האדום מייצג צביעת kressel violet. סרגל המقياس מייצג מילימטר אחד.

כאן התמונה מציגה חיתוך מאותו ציפור זברה (zebra finch) שהועבר היברידיזציה עם גש probes של antisense ribo עבור coop TF two. התמונות הבאות משוות בין סימון antisense לסימון sense, המראים דפוסים שונים כפי שמוצג באוטו-רדיוגרפיה על סרטי רנטגן של חיתוכי ראש של עוברים של ציפור זברה ביום עוברי 12. הקו המקווקו מציין את מתאר המוח כולו והאות C מסמנת את המוחון (cerebellum).

ניתן לראות כי הגדיל האנטי-סנס (antisense) של PAC six בא לידי ביטוי במוח, ובמיוחד באזור הוונטריקולרי (ventricular zone). חיתוך סמוך שעבר היברידיזציה עם גדיל הסנס (sense) של pack six אינו מגלה ביטוי רקע ברחבי ראש העובר, אך מראה ביטוי ברור בשכבת הפיגמנט של הרשתית, בדומה לגדיל האנטי-סנס. התמונות הבאות מציגות ב-C שני אותות של ביטוי גני ושלשויות טבולות באמולסיה שנלקחו ממוח של פנסי זברה בשלבים עובריים מאוחרים, בתצוגות של שדה בהיר (brightfield) ושדה חשוך (darkfield).

תמונה זו במיקרוסקופ שדה בהיר מראה ביטוי של D one B ביום עוברי 10. בחשיפה רגילה לאמולסיה, הסימון המופיע כשחור בקושי נראה בהגדלה זו. תמונה זו מראה חיתוך והגדלה זהים לאלו שנראו בתמונה הקודמת, אך במצב של שדה חשוך המראה סימון בלבן בסטריאטום ובתלמוס.

תמונה זו בשדה בהיר מראה ביטוי של slit 3 ביום עוברי 12. לאחר חשיפת יתר לאמולסיה, ניתן לראות בקלות את הסימון השחור. SC מסמן את מיקום חוט השדרה ו-CB מסמן את מיקום המוחד הקטן.

הכיוון הרוסטרלי (קדמי) הוא לשמאל. התמונה המוצגת כאן היא של אותו חתך ובאותה הגדלה, אך היא מוצגת בתצוגת שדה אפל (dark field), המראה סימון בלבן בחוט השדרה התואם לתמונת השדה המואר (bright field). התמונות הבאות מראות רזולוציית גרגירי כסף ברמה התאית.

כאן מוצג סימון של mRNA של Fox P1 במוח הקדמי של פפיון זברה; גרגירי כסף מופיעים כנקודות שחורות מעל תאים שנצבעו ב-cresyl violet. תמונה זו מראה ביטוי בשפע גבוה מעל תאים בודדים ב-mesopallium של פפיון זברה בוגר. תמונה זו מראה ביטוי בשפע נמוך מעל תאים בודדים ב-pallium הסמוך מאותו חיתוך.

הביטוי של mRNA של Hi Fox P one messenger נראה בתאי המזו-אליום ביום עוברי 12.

התאים העובריים הנראים כאן קטנים יותר ודחוסים יותר בהשוואה לתאי הבוגר הנראים בשני התמונות הקודמות. לבסוף, תמונה זו מראה ביטוי ברמה נמוכה על פני תאים ב-alium הסמוך של אותו חיתוך. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונוכימיה כדי לענות על שאלות נוספות, כגון באיזה סוג תא מבוטא הגן המטרה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ביצוע ההיברידיזציה המוסדית. זכרו כי עבודה עם ריאגנטים רדיואקטיביים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון מיגון אישי במהלך הליך זה.