Name: רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 38 s
Description: למדו הכלאה באתרו לזיהוי תבניות ביטוי mRNA ברקמות חולייתנים. שיטה זו מאפשרת זיהוי תעתיקים בנפח נמוך ומעבדת מספר רב של שקפים בו-זמנית לחקר ביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לכל חברי המעבדה ג&#39;רוויס מי שיפר את הפרוטוקול במהלך השנים.

<ol><li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li>
<li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li>
<li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li>
<li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li>
<li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li>
<li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections%3A+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li>
<li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li>
<li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica%22%5BJournal%5D)">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li>
<li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li>
<li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li>
<li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li>
<li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363(2005).</li>
<li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li>
<li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+whom+the+bird+sings%3A+context-dependent+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li>
<li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain%3A+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768(2008).</li>
<li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

רדיואקטיבי הכלאה באתרו של ביטוי mRNA נעשה שימוש נרחב למטרות מרובות, כולל ללימוד הארגון רקמות אזורי, סוגי תאים, ואת הפעילות המוחית התפקודית 2-5,10,12-14. שימוש אחר הוא על גנים, אשר הביטוי mRNA במוח תלויה פעילות עצבית מוגברת, המכונה לעתים קרובות פעילות תלויי גנים או גנים מוקדמים מיידיות. עם השימושים האלה, השיטה שלנו יושם על פני מספר רב של מינים, כולל ציפורים, יונקים (למשל אדם), דגים, דו חיים, ברקמות רבות, כולל המוח, העור, השרירים, והגילאים מרובות, כולל גוזלים / תינוקות, ונוער , מבוגרים, והנה העובר בחלקים שלמים 2,3,5,15-17. התכונות המיוחדות של פרוטוקול שלנו כוללים: (1) הוא מייצר איזון בין ייחוד אנטומי וספציפיות כמותית. כדי לכמת את ביטוי הגנים על הסרט X-Ray, אנחנו לוקחים את התמונות הדיגיטליות של התמונות (לשעבר:. איור 1A ו-1B), השתמש Photoshop (Adobe) היסטוגרמה פונקציה כדי למדוד את צפיפות פיקסלים באזורים בעלי עניין ולחסר את רמות הרקע על הסרט מחוץ רקמות אך עדיין בשקופית זכוכית 2,4. לכמת ביטוי ברמה התאית, אנחנו לוקחים תמונות של גרגרי כסף על תאים בהגדלה גבוהה (40-100x, איור 4). לאחר מכן, אנו משתמשים סף פונקציות מידה של J תמונה של וויין Rasband ב-NIH על מנת לספור את מספר גרגרי כסף בתמונה, להפחית את מספר רקע בתחום דומה ללא תאים בשקופית זכוכית, לחלק במספר תאים, להשיג כמה ערכים של ביטוי לכל תא. 4,18 (2) ניתן תפוקה גבוהה יחסית, מה שמאפשר עיבוד של 100-200 שקופיות בו זמנית, עקב חותם coverslip חזק שנוצר על ידי אמבט שמן מינרלי. סטנדרט in-situ שיטות הכלאה להימשך זמן רב יותר לסגור את השקופיות עם parafilm, לק, ואמצעים אחרים, בהם שקופיות תופסים הרבה מקום, (3) זה מאודרגיש תמלילי שפע נמוכה עקב סולפט dextran פתרון של Denhardt במאגר הכלאה 2,13, (4) הגישה הדמיה darkfield מניב תמונות עם ניגודיות גבוהה בשל מצלם תחת תאורה darkfield על מיקרוסקופ לנתח 4,5. בנוסף, היא מאפשרת זיהוי הרגיש של שינויים קטנים ביטוי גנים, כמו בביטוי תלוי בפעילות הגן לזהות אזורים במוח ספציפיים המופעלים בזמן התפיסה והייצור של התנהגויות ספציפיות 19. המגבלות ביחס שאינם רדיואקטיביים פרוטוקולים הן כי האחרונים הם ברורים בהחלטה הסלולר ואת המיקום של ה-mRNA בתוך התא, ועבודה עם אמולסיה רגישה מאוד מניפולציה ואור. ניתן לשלב את השיטה שלנו עם שיטות אחרות, כגון אי - רדיואקטיבי הכלאה באתרו לתייג ביטוי mRNA של גן אחד או יותר בתוך הרקמה באותו 10,17,20. זה יכול להיות משולב עם immunocytochemistryלתייג את שתי רנ&quot;א ביטוי החלבון על מדגם זהה כדי שיתוף לתהליך הלוקליזציה של mRNA עם סוגי תאים מסוימים 10. השינויים בפרוטוקול הדרושים כאלה ניסויים תיוג כפולים מתוארים והאסמכתאות. לסיכום, הגישה שלנו מאפשרת הבנה של תזמון ומיקום הסלולרי של ביטוי גנים לשם הבנת הארגון באזור, פעילות רקמה תפקודית, ותפקוד הגן.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אצטית אנהידריד </td><td> VWR </td><td> MK242002 </td><td></td></tr><tr><td> כלורופורם </td><td> VWR </td><td> BDH1109 </td><td></td></tr><tr><td> סגול Cresyl אצטט </td><td> סיגמא </td><td> C5042 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Thermo Scientific </td><td> Microm HM550 </td><td></td></tr><tr><td> Deionized לפוראמיד </td><td> סיגמא </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> Promega </td><td> P1171 </td><td> 100 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא </td><td> ED </td><td></td></tr><tr><td> הטבעה עובש </td><td> VWR </td><td> 15160-215 </td><td></td></tr><tr><td> פישר המותג Superfrost בתוספת שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 22-034-979 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> פורמלדהיד </td><td> VWR </td><td> BDH0506-4LP </td><td></td></tr><tr><td> לפוראמיד </td><td> סיגמא </td><td> F7508 </td><td></td></tr><tr><td> GENECLEAN ערכת </td><td> Q-ביו גן </td><td> 1001-200 </td><td></td></tr><tr><td> קודאק BioMax MR הסרט </td><td> סיגמא </td><td> Z350370 </td><td></td></tr><tr><td> קודאק NTB אמולסיה </td><td> Carestream הבריאות </td><td> 8895666 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Professional Developer D19 </td><td> קודאק </td><td> 1462593 </td><td></td></tr><tr><td> קודאק מקצועי Fixer </td><td> קודאק </td><td> 1971746 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> שמן מינרלי </td><td> VWR </td><td> IC15169491 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> VWR </td><td> SX0600-1 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> סיגמא </td><td> 76240 </td><td></td></tr><tr><td> פולי </td><td> Invitrogen </td><td> POLYA.GF </td><td></td></tr><tr><td> rATP </td><td> Promega </td><td> P1132 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> rCTP </td><td> Promega </td><td> P1142 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> rGTP </td><td> Promega </td><td> P1152 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td> 40Units/μl </td></tr><tr><td> S 35 UTP </td><td> PerkinElmer </td><td> NEG039C001MC </td><td></td></tr><tr><td> בטיחות לפתור פתרון </td><td> בטיחות לפתור מוצרים המחקר הבינלאומי </td><td> 111177 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום אצטט </td><td> סיגמא </td><td> S7899 </td><td> 3M </td></tr><tr><td> פוספט נתרן dibasic </td><td> סיגמא </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט נתרן monobasic </td><td> סיגמא </td><td> S3139 </td><td></td></tr><tr><td> SP6RNA פולימראז </td><td> Promega </td><td> P1085 </td><td></td></tr><tr><td> מכתים מתלה מתכת </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 70312-54 </td><td></td></tr><tr><td> T7-RNA פולימראז </td><td> Promega </td><td> P2075 </td><td></td></tr><tr><td> רקמת-Tek אוקטובר </td><td> סאקורה </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> תמלול 5x חיץ </td><td> Promega </td><td> P1181 </td><td></td></tr><tr><td> בכאבים ודלקות שאינן זיהומיות </td><td> VWR </td><td> IC15216391 </td><td></td></tr><tr><td> טריס-HCl (1 מ &#39;, pH 8.0) </td><td> VWR </td><td> 101449-446 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> רוש </td><td> 10109509001 </td><td></td></tr></tbody></table> פתרונות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומרים כימיים להכנת של riboprobes: 1.5 תבנית ה-DNA μl (0.2-0.3 מיקרוגרם / μl), 2 μl מאגר 5x שעתוק אופטימיזציה, 1 μl של DTT 100 מ&quot;מ (מגיע עם פולימראז מ Promega, תמהילגם בטמפרטורת החדר), 0.3 μl של RNasin (40 יחידות / μl), 1.5 μl של פתרון שילוב AGC ribonucleotide, 3.5 μl של S 35 UTP, ו 1 μl RNA פולימראז. להביא עד 10 μl עם מים nuclease חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת AGC פתרון ribonucleotide: לערבב כמויות שוות של 10 מ&quot;מ ATP, GTP ו CTP יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אצטט נתרן פתרון EtOH משקעים להסיר 35 חינם UTP: 40 RNase μl ומים DNase חינם, 5 μl של נתרן אצטט 3M, ו - 125 μl של EtOH 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההכלאה חיץ (10 מ&quot;ל המלאי): 5 מ&quot;ל של לפוראמיד deionized 100%, 600 μl של NaCl 5M, 1M Tris-HCl (pH = 8.0), 240 μl של 0.5m EDTA (pH = 8.0), 100 μl של פתרון 100x של Denhart, 100 μl של 1M DTT, 250 μl של 20mg/ml tRNA, 125 μl של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פולי, ו - 1 גר &#39;של נתרן גופרתי dextran. הוסף DEPC שטופלו במים כדי להביא את הנפח הכולל ל 10 מ&quot;ל. לנער במרץ ולאחר מכן לדגור על 55 ° C עד שכל נתרן גופרתי dextran נמס. אחסן את מאגר ההכלאה ב-20 ° C, שהוא טוב ~~~HEAD=NNS 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4% שנאגרו פתרון paraformaldehyde: הוסף 40 גרם של paraformaldehyde במים מזוקקים 760 מ&quot;ל בבקבוק המיועד paraformaldehyde, חום עד 50 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית תוך ערבוב. הוסף 320 μl של 10N NaOH כדי לעזור לפזר את paraformaldehyde. לאחר המסת (~ 10 דקות), מוסיפים 100 מ&quot;ל של PBS 10x, ולהביא את עוצמת הקול עם מים מזוקקים עד 1 ליטר. מערבבים ומחממים את הפתרון עד paraformaldehyde נמס. PH אמור להיות 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר acetylation: 13.6 מ&quot;ל של בכאבים ודלקות שאינן זיהומיות בתוספת 2.52 מ&quot;ל אנהידריד אצטית ב 1 ליטר של מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20x SSPE פתרון: 3M NaCl, 200 מ&quot;מ לאא 2 PO 4-H 2 O, ו - 200 mM EDTA במים מזוקקים. התאמת פתרון ה-pH 7.4 עם 10N NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר 10x PBS: 80G של NaCl, 2.0g של KCl, 14.4g של Na 2 HPO 4, 2.4G של KH 2 PO 4 במים מזוקקים. התאמת פתרון ה-pH 7.0 ולהביא הנפח הכולל עד 1 לייטr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הפתרון השני: 0.1% β-mercaptoethanol ו לפוראמיד 50% 2x SSPE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגול Cresyl פתרון אצטט: 3% אצטט סגול cresyl במי ברז (מים מזוקקים מונעת הכתמה טוב), פיזר הלילה עם ערבוב בבקבוק בטמפרטורת החדר. סנן עם היניקה ואקום דרך Whatman 1mm מסנן נייר משפך בוכנר. </li></ol>

רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

לדעת את העיתוי, ברמה, לוקליזציה נייד, ואת סוג התא הגן מתבטא תורם להבנתנו את הפונקציה של הגן. כל התכונות הללו ניתן להשיג עם ההכלאה ב באתרו כדי mRNAs בתוך התאים. כאן אנו מציגים רדיואקטיבי בשיטת הכלאה באתרו שונה מ קלייטון et al. (1988) 1, כי עובדת בהצלחה במעבדה שלנו במשך שנים רבות, במיוחד שכל בעלי חוליות בוגרים 2-5. הארוכים משלימים RNA (קרנה) בדיקות רצף היעד מאפשר זיהוי של תמלילי שפע נמוכות 6,7. שילוב הנוקליאוטידים רדיואקטיביים לתוך בדיקות קרנה מאפשר רגישות גילוי נוסף של תמלילי שפע נמוכות ניתוחים כמותיים, או על ידי סרט אור רנטגן רגיש או תחליב מצופה על הרקמה. אלה שיטות זיהוי לספק תיעוד ארוך טווח היעד של ביטוי גנים. לעומת הלא רדיואקטיבי בדיקה ספידODS, כגון DIG-תיוג, שיטת בדיקה רדיואקטיבית ההכלאה אינו מחייב צעדים הגברה מרובים באמצעות HRP נוגדנים ו / או ה-TSA ערכת לגילוי תמלילי שפע נמוכים. לכן, שיטה זו מספקת יחס ליניארי בין עוצמת האות לבין כמות ה-mRNA ממוקדים על ניתוח כמותי. הוא מאפשר עיבוד 100-200 שקופיות בו זמנית. זה עובד גם על שלבי ההתפתחות השונים של העובר. מחקרים התפתחותיים ביותר של ביטוי גנים משתמשים עוברים שלמים שאינם רדיואקטיביים גישות 8,9, בין השאר בשל הרקמה העוברית היא שברירית יותר רקמת מבוגר, עם פחות לכידות בין תאים, ולכן קשה לראות את הגבולות בין אוכלוסיות תאים עם קטעי רקמה. לעומת זאת, הגישה שלנו רדיואקטיבי, בשל מגוון גדול יותר של רגישות, הוא מסוגל להשיג ניגודיות גבוהה יותר בהחלטה של ​​ביטוי גנים בין אזורים רקמות, מה שמקל לראות הגבולות בין האוכלוסיות. באמצעות שיטה זו, החוקרים יכלו לחשוף אתמשמעות אפשרית של הגן המזוהה החדש, ובהמשך לחזות את הפונקציה של הגן של עניין.

פרוטוקול זה משמש בהצלחה כמותית לזהות רמות ודפוסים מרחביים של ביטוי mRNA של מספר סוגי רקמות על פני בעלי החוליות. השיטה יכולה לזהות תעתיקי שפע נמוך ומאפשר עיבוד של מאות שקופיות בו זמנית. אנו מציגים את הפרוטוקול באמצעות פרופיל הביטוי של היווצרות העופות המוח העוברי כדוגמה.

הבנת התזמון, הרמה, הלוקליזציה התאית והסוג התאי שבהם גן בא לידי ביטוי תורמת להבנת תפקוד הגן. ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות אזורים של ביטוי גן ספציפי ולאפיין את התזמון ואת רמות ביטוי הגן כדי לתרום להבנת תפקוד הגן. מטרה זו מושגת על ידי קציר והכנה מהירים של הרקמה שתשמש בפרוצדורה, במטרה לשמר את שלמות הרקמה. כשלב שני, הרקמה עוברת טיפול להפחתת קישור הרקע של גששי ריבו (ribo probes).בשלב הבא, מתבצעת היברידיזציה של הגששים (ribo probes) לרקמה, ולאחר מכן ויזואליזציה של קישור גשש ה-RIBA. בעזרת סרט רנטגן או אמולסיה רגישה לאור, מתקבלים תוצאות המראות את המיקום ואת רמת ביטוי הגנים, בהתבסס על תמונות רנטגן או ניתוח במיקרוסקופיה בשיטות שדה בהיר (brightfield) ושדה כהה (darkfield). בעת שימוש בתוכנת Image J, ישנם מספר שלבים קריטיים שחובה לבצע היטב ובהם רבים טועים, ואחד מהם הוא מניעת רקע.ישנם מספר שלבים שעלולים לגרום לרעש רקע, כגון סטורציה לקויה או היברידיזציה בטמפרטורה לא נכונה. גורם נוסף הוא זיהום ב-RNA שיגרום לפירוק של הגשוש (probe) ה-RNA שלך. לכן, יש להקפיד שכל הציוד והחומרים יהיו נקיים מ-RNA.והשלישי הוא שכאשר טובלים את השקופיות באמולסיה, עליכם לוודא שאין דליפות אור בחדר החשכים או חשיפה של האמולסיה לאור לאורך כל שלבי התהליך, שעלול להימשך שלושה שבועות. את הטכניקה הזו תדגים Hun Chen, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. לאחר הוצאת מוח טרי ושטיפה ב-1x PBS, טמיעו את המוח במדיום OCT tissue tech על ידי טבילת המוח בתבנית המכילה את המדיום בטמפרטורת החדר.ודאו שהמוח מונח בכיוון הדרוש לחיתוך. לאחר מכן, רססו את הקרח היבש באתנול והקפיאו את הרקמה על ידי הנחת הבלוק לתוך תערובת האתנול והקרח היבש. תוך הקפדה שלא יחדור אתנול אל תוך הבלוק, חתכו את הרקמה הקפואה בעזרת קריוסטט לחתכים בעובי של 10 עד 12 מיקרון, והעבירו אותם לשקופיות super plus המיועדות לרקמת מוח ורקמה עוברית.טמפרטורת החיתוך האופטימלית היא בטווח של 18- מעלות צלזיוס עד 20- מעלות צלזיוס. יש לאחסן את החתכים בקופסת שקופיות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. העבירו את השקופיות מאחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למסגרת מתכת על קרח יבש.לאחר מכן, בעבודה בתוך מנדף מאושר, מקמו את העמד בתוך תמיסה של 4% para formaldehyde שחוממה מראש לטמפרטורה הגבוהה ב-3 עד 5 מעלות צלזיוס מטמפרטורת החדר. דגרו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר; לאחר הדגירה, הוציאו את העמד מה-para formaldehyde ושטפו את השקופיות על ידי טבילה של העמד ב-PBS כ-15 פעמים. חזרו על שלב שטיפה זה פעמיים, תוך שימוש בתמיסת PBS רעננה בכל פעם.בשלב הבא, טבול את השקופיות בבופר אצטילציה (acetylation buffer) שהוכן זה עתה למשך 10 דקות, כדי להפחית קישור לא ספציפי של פרובת ה-RIBA. לאחר מכן, שטוף את השקופיות כפי שנעשה קודם לכן, אך הפעם השתמש ב-two times SSPE כתמיסת השטיפה. ייבש את הרקמה באמצעות סדרה של אתנול בריכוזים של 70, 95 ו-100% למשך שתי דקות בכל תמיסה.לאחר מכן, ייבשו את השקופיות במכסוף במשך 10 עד 15 דקות לפחות. לאחר סינתזת גשש ה-RIBA, בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב, חשבו את הנפח הנדרש של גשש ה-RIBA ושל תמיסת ההיברידיזציה עבור כל השקופיות. חממו מראש את תערובת ההיברידיזציה של גשש ה-Ribo ל-65 °C למשך חמש דקות.כדי לדנטר את ה-Ribo probe, העבירו בפיפטה 100 µL מתמיס ההיברידיזציה של ה-Ribo probe ופזרו אותו על פני זכוכית הכיסוי. לאחר מכן, השתמשו בזכוכית כיסוי שנייה כדי לפרוס את התמיסה באופן אחיד על הרקמה ועל זכוכית הכיסוי. הניחו את השקופית בצורה אופקית ובמצב זקוף בתוך מתקן מתכת, ולאחר שכל השקופיות מוכנות, טבלו את המתקן באיטיות באמבט שמן בטמפרטורה של 65 °C למשך מינימום של ארבע שעות ומקסימום של 16 שעות.השמן יוצר אטם אטום לאוויר מסביב לכיסויי הזכוכית לאחר האינקובציה. הסר כל עודף שמן ממתקן המתכת המכיל את השקופיות, ולאחר מכן הנח את המתקן בתוך מגש זכוכית או מתכת המכיל כלורופורם תחת מסיסת אדים. חזור על השטיפה עם מגש שני המכיל כלורופורם טרי.בשלב הבא, טבל את מתקן השמורות בתוך תמיסת 0.1% betta me cap אתנול בתוספת תמיסת SSPE בריכוז פי 2, כדי לשחרר את לוחות הכיסוי ולהמיס את עודפי תמיסת ההיברידיזציה. לאחר מכן, העבר את השקופיות לתמיסה שנייה ורעננה של 0.1% betta me cap TER אתנול בתוספת תמיסת SSPE בריכוז פי 2. העבר את השקופיות ללא לוחות הכיסוי למתקן שמורות רענן במגש המכיל 0.1% beta macca TER אתנול ב-SSPE בריכוז פי 2, והדגש את הדגימות בתמיסה זו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להסיר עודפי גשושית RNA שאינם קשורים.לאחר מכן, העבירו את מתקן השקיקיות לפתרון SSPE בריכוז פי 2 פלוס 50% main wide שחומם מראש ל-65 degrees Celsius ומכיל beta ME capto ethanol בריכוז סופי של 0.1%, והדגרימו ב-65 degrees Celsius למשך שעה אחת. לאחר ההדגרה, השליכו פתרון זה ואת כל פתרונות השטיפה המימיים הקודמים, כמו גם את כיסויי הזכוכית (cover slips), כפסולת רדיואקטיבית. לאחר מכן, שטפו את השקיקיות פעמיים ב-0.1 times SSPE שחומם מראש ל-65 degrees Celsius למשך 30 דקות בכל פעם.לאחר מכן, בצעו דהידרטציה לרקמה באמצעות סדרת אתנול בריכוזים של 70%, 95% ו-100% למשך שתי דקות בכל תמיסה. לבסוף, ייבשו את השקופיות במנדף במשך 30 דקות לפחות. ראשית, על מנת לקבוע האם קיים אות רדיואקטיבי ברקמה.הניחו את השקופיות המיובשות בתוך קסטה לסרט, בעבודה בחדר חשוך תחת תאורה בטוחה, והניחו סרט רנטגן מעל השקופיות. ודאו כי השקופיות פונות לצד האמולסיה של הסרט ולאחר מכן סגרו את הקסטה. חשפו את השקופיות לסרט למשך יום אחד עד שבעה ימים, בהתאם לשפע הצפוי של התמלילים.לאחר השלמת החשיפה, יש לפתח את סרט הרנטגן במקבע ומפתח סטנדרטיים. אות ההיברידיזציה יופיע כאזורים שחורים על הסרט, הנובעים מגבשי כסף שנחשפו באמוּלסיה, כדי לקבוע את הרזולוציה התאית ולראות את האות על הרקמה עצמה. את השקופיות טובלים באמוּלסיה פוטוגרפית ולאחר מכן צובעים בצבע ניגוד.אם יש לצבוע את השקופיות בצביעה נגדית ב-crystal violet, יש להוציא את החתכים מהפראפין (deliquidize) בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב. בשלב זה, בעבודה בחדר חשוך, שפכו מים מזוקקים לתוך מבחנה. הוציאו כמות של an NTB emulsion ודללו את האמולסיה במים מזוקקים ביחס של אחד לאחד.לאחר המסת האמולסיה באמבט מים בטמפרטורה של 42 °C למשך 20 עד 30 דקות, העבירו אותה למכל טבילה מזכוכית בתוך אמבט מים בטמפרטורה של 42 °C למשך 20 עד 30 דקות. מפלס האמולסיה המדוללת צריך כעת לכסות את כל החתכים על השקופית כאשר השקופית טובלת בה. במידה ויש מספר רב של שקופית, ייתכן שיהיה צורך באמולסיה נוספת.כעת טבלו את השקופיות באמולסיה המדוללת בתוך אמבט מים בטמפרטורה של 42 °C, ולאחר מכן ייבשו את השקופיות במיכל סגור ואטום לאור למשך לילה בחדר חשוך, או בתנור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים עד שלוש כאשר האורות כבויים. לאחר הייבוש, העבירו את השקופיות לקופסת שקופיות. אטמו את הקצוות בסרט בידוד שחור וכסו בנייר אלומיניום.אחסנו את הקופסאות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך מספר ימים עד שבועות; כאשר השקופיות מוכנות לפיתוח, חממו אותן לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בעבודה בחדר חשוך, הוציאו את התושבת המכילה את השקופיות מהקופסאות ופתחו אותן במפתח פיתוח codec D 19 בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות המפותחות במי ברז בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.לאחר מכן, הדגרו את השקופיות פעמיים בתמיסת קיבוע בטמפרטורה של 19 degrees Celsius למשך שש דקות בכל פעם; ניתן להדליק את אורות החדר במהלך הדגרת הקיבוע השנייה. כעת, שטפו את השקופיות במי ברז בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן, בעזרת להב תער, גרדו את האמולסיה מגב השקופית בעוד היא רטובה.לבסוף, בצעו צביעה נגדית עם 0.3% crestal violet, ולאחר מכן בצעו דהידרציה והרכבה של השקופיות בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב במידת הצורך. נקו שאריות אמולסיה מהצד האחורי של השקופיות על ידי הרטבה במים וגירוד בעזרת להב תער. שטפו את השקופיות בתמיסת 80% ethanol ונגבו בעדינות פעם אחת או פעמיים כדי להסיר לכלוך ואבק.צלם תמונות תחת תאורת שדה אפל (darkfield) או שדה בהיר (brightfield). ייתכן שיהיה צורך לחזור על שלבי הגרידה והניקיון פעמיים עד שלוש פעמים כדי להשיג תמונות איכותיות ללא חלקיקי אבק, הנראים בקלות בשדה אפל תחת מיקרוסקופ דיסקטורי. התמונות הבאות הן דוגמאות של רדיוגרפיה עצמית של היברידיזציה in situ מסרטי רנטגן.תמונת סרט רנטגן זו מציגה חיתוך סגיטלי של ראש שלם של ציפור שיר מסוג Zebra Finch ביום עוברי 10, אשר עבר היברידיזציה עם probe של antisense ribo ל-Fox P1. הגרגירים השחורים החשופים על הסרט מראים ביטוי של messenger RNA, כפי שניתן לראות בתוך ארבעת חלקי המוח; כאן, Fox P1 messenger RNA מועשר ב-meso alium stri aum וב-dorsal thalamus. תמונת סרט הרנטגן מציגה חיתוך מאותה ציפור Zebra Finch שעברה היברידיזציה עם 90 cents RIBA probe ל-Cuper.TF two Co.TF two מועשר בגרעין ה-palam alium ובחלקים ונטרליים יותר של התלמוס. התמונות הבאות הן דוגמאות לאוטורדיוגרפיה של היברידיזציה במקום (in situ hybridization) משטריפי טבילה באמולסיה. תמונת השדה האפל זו, שצולמה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מראה חיתוך סגיטלי של ראש שלם של צופית זברה ביום השישי לאחר הבקיעה, אשר עבר היברידיזציה עם גשש RIBA אנטי-סנס ל-Fox P one.גרגרי הכסף הלבנים החשופים באמולסיה מעל הרקמה מראים ביטוי של RNA שליח. הצבע האדום מייצג צביעת kressel violet. סרגל המقياس מייצג מילימטר אחד.כאן התמונה מציגה חתך מאותו ציפור זברה פינץ' שהוibridized עם גשוש antisense ribo נגד coop TF two. התמונות הבאות משוות בין סימון antisense לסימון sense, המראים דפוסים שונים כפי שמוצג באוטורדיוגרפיה על סרטי רנטגן של חתכי ראש של זברה פינץ' ביום עוברי 12. הקו המקווקו מציין את מתאר המוח כולו והאות C מסמנת את המוזוליאן (cerebellum).ניתן לראות כי הגדיל האנטי-סנס (antisense) של PAC six בא לידי ביטוי במוח, ובמיוחד באזור הוונטריקולרי. חיתוך סמוך שעבר היברידיזציה עם גדיל הסנס (sense) של PAC six אינוre מראה ביטוי רקע ברחבי ראש העובר, אך מראה ביטוי ברור בשכבת הפיגמנט של הרשתית, בדומה לגדיל האנטי-סנס. התמונות הבאות מציגות ב-C שני אותות של ביטוי גנים ושלחאות טבולות באמולסיה שנלקחו ממוח של פנזיברא (zebra finch) במהלך שלבים עובריים מאוחרים, בתצוגות שדה בהיר ושדה חשוך.תמונה זו בשדה בהיר (brightfield) מראה ביטוי של D one B ביום עוברי 10. בחשיפה רגילה לאמולסיה, את הסימון המופיע בצבע שחור ניתן בקושי להבחין בו בהגדלה זו. תמונה זו מציגה חתך והגדלה זהים לאלו שנראו בתמונה הקודמת, אך במעבר לתצוגת שדה אפל (dark field), המראה את הסימון בצבע לבן בסטריאטום (striatum) ובתלמוס (thalamus).תמונה זו בשדה בהיר מראה ביטוי של slit three ביום עוברי 12. לאחר חשיפת יתר של האמולסיה, ניתן לראות בבירור את הסימון השחור. SC מסמן את מיקום חוט השדרה ו-CB מסמן את מיקום המוח הקטן.הכיוון הרוסטרלי (Rostral) הוא שמאלה. התמונה המוצגת כאן היא אותו חתך בדיוק ובאותה הגדשה, אך במבט בשדה חשוך (dark field) המראה סימון בלבן בחוט השדרה, התואם לתמונת השדה המואר (bright field). התמונות הבאות מראות רזולוציה של גרגירי כסף ברמה התאית.מוצג כאן סימון של mRNA של Fox P1 במוח הקדמי של חולת הזברה; גרגירים של כסף מופיעים כנקודות שחורות מעל תאים שצבעו ב-cresyl violet. תמונה זו מראה ביטוי בשפע גבוה על פני תאים בודדים ב-mesoalium של חולת זברה בוגרת. תמונה זו מראה ביטוי בשפע נמוך על פני תאים בודדים ב-alium הסמוך באותו חתך.ביטוי של mRNA של Hi Fox P1 messenger נראה בתאי המזואליום ביום עוברי 12.התאים העובריים הנראים כאן קטנים ודחוסים יותר בהשוואה לתאי המבוגר הנראים בשתי התמונות הקודמות. לבסוף, תמונה זו מראה ביטוי ברמה נמוכה על תאים ב-alium הסמוך מאותו חתך. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כמו אימונוכימיה כדי לענות על שאלות נוספות, כגון באיזה סוג תא מבוטא הגן המטרה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע ההיברידיזציה במכון. זכרו כי עבודה עם ריאגנטים רדיואקטיביים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון מיגון אישי, במהלך הליך זה.

radioactive-situ-hybridization-for-detecting-diverse-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר אסטרטגיית הכלאה רציפה הכוללת הכלאה של גשושיות mRNA ל-mRNA מטרה ספציפי. לאחר הכלאת הגשושיות, הגברת האות מבוצעת כדי לשפר את הרזולוציה באמצעות הפחתת יחס אות לרעש במהלך RNA-CISH של דגימות היסטולוגיות.

הכלאת בדיקה והגברת אותות בהכלאה של RNA באתרו: טכניקה לאיתור רצפי RNA ספציפיים במקטעי רקמות

סרטון זה מציג את פרוטוקול זיהוי האותות במהלך הכלאה כרומוגנית של RNA באתרו. טכניקה זו יכולה לשמש לאבחון זיהום אונקוגן פעיל חזותית בדגימת רקמה שלמה.

RNA CISH Signal Detection: טכניקה לזיהוי אותות כרומוגניים במהלך הכלאה של RNA באתרו בדגימות רקמות שלמות

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

לוקליזציה של ביטוי גנים לסוגי תאים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת בשל היעדר נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי משולש בו זמנית של ביטוי גנים על ידי שילוב של RNA פלואורסצנטי כפול הכלאה באתרו עם צביעה חיסונית.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

כאן, אנו מתארים בחיי עיר הכלאה assay המאפשרת זיהוי רגיש וספציפי של רצפי קצר ככל נוקלאוטידים 50 עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד ברמת תא בודד. וזמינותו, אשר יכול להתבצע באופן ידני או אוטומטי, באפשרותך לאפשר ויזואליזציה של גרסאות splice, רצפים קצרים מוטציות בתוך ההקשר רקמות.

וריאציות גנטיות להמחיש מטרות קצרות, מוטציות נקודה בהקשר רקמות מורפולוגי עם RNA בחיי עיר Assay הכלאה

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

הליך זה מתאר כיצד להקים ראשוני בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine ואחריו transfection באמצעות Pulser ג'ין מערכת MXCell electroporation.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

Non-רדיואקטיבי באתרו הכלאה פרוטוקול ישים עבור נורווגיה Spruce ומגוון של מיני צמחים

למדו הכלאה באתרו לזיהוי תבניות ביטוי mRNA ברקמות חולייתנים. שיטה זו מאפשרת זיהוי תעתיקים בנפח נמוך ומעבדת מספר רב של שקפים בו-זמנית לחקר ביולוגיה התפתחותית.

רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות

גלה סרטונים נוספים