פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לבחון את ההשפעות של pseudomona siro PV tomato על חלבונים המוסדרים על ידי רדוקס בצמחי עגבנייה. ראשית, יש להחדיר (inoculate) לצמחי עגבנייה את pseudomona siro PV PV tomato כדי להשרות זיהום פתוגני ותגובה חלבונית. לאחר מכן, יש לצבוע באמצעות DIAM benzine כדי לבחון שינויים במיני חמצן רהורגיביים (ROS).

לאחר מכן בצעו סימון TMT של ציסטאין כדי לבחון ציסטאינים מווסתים על ידי חמצון-חיזור בחלבונים. התוצאות המתקבלות יכולות למדוד שינויים בין דגימות מטופלות לדגימות ביקורת. שלום, אני צ'ן מהמחלקה לביולוגיה ומהמעבדה לפרוטאומיקה כאן באוניברסיטת פלורידה.

היתרון של סימון ה-CTMT שלנו על פני שיטות קיימות, כגון סימון פיני מצופה איזוטופים (isotope coated fin tag), המכונה גם ASCA, הוא היכולת לבצע ריבוי דגימות (multiplexing) תוך כדי ניתוח חלבונים המגיבים לחמצון-חיזור (redox responsive proteins) בקנה מידה רחב. בעוד שהדגמה זו תספק תובנות לגבי חלבונים מווסתים על ידי חמצון-חיזור בעגבנייה בתגובה לזיהום על ידי פתוגן, ניתן להחיל את הניסוי על מערכות אחרים כגון זבובים, עכברים, צמחים אחרים ובקרת תנאי עקה. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה לאחר ששמנו לב לשונות ניכרת בין ניסויי ICAD, מכיוון שרק שני סוגי סימון זמינים.

הדגמה של שיטה זו ב-VIR היא קריטית, שכן שלבי הסימון וההעשרה קשים ללמידה. יש למזער וריאציות ניסיוניות בין דגימות מסומנות ולהפחית את הסרת האזורים כדי להבטיח סימון יעיל. בואו נתחיל. הגדילו שני שתילים של עגבנייה שהושתלו, בגודל דומה, בעציצים בעובי 4 אינץ' עבור תרבית האינוקולום.

משטח גידול של pseudomona singe על מצע KBM. גרדו את החיידקים לתוך 20 milliliters של מים והכינו תמיסת חידוע של כ-10 to the six יחידות יוצרות מושבות (colony forming units) ל-milliliter. בתוך ליטר אחד של בופר חידוע, טבלו את הצמחים בני הגיל של ארבעה שבועות בתוך תמיסת החידוע החיידקית למשך 30 שניות.

לאחר מכן, כסו מיד בשקיות פלסטיק שקופות. לאחר זמן ההסמכה המועדף, קצרו את העלה הפרוס במלאו, הניחו את הצד העליון (epidermal side) כלפי מעלה ב-1 mg/mL של צבע DAB, ובצעו חלחול בוואקום למשך 15 דקות. לאחר מכן, דגרו את העלים בחושך בטמפרטורת החדר למשך לילה.

כעת הרתיחו את העלים הצבועים ב-95% ethanol למשך 10 דקות ואחסנו אותם ב-75% ethanol. השתמשו במכתש ועלי כדי לטחון את העלים שנאספו לאבקה דקה בחנקן נוזלי. לאחר מכן, בצעו מיצוי פנול כפי שמתואר בטקסט הנלווה.

בשלב הבא, שקיע את החלבונים שהופקו במיצוי פנול באמצעות חמישה נפחים של 0.1 molar ammonium acetate קר ב-100%methanol. אסוף את החלבונים באמצעות סבוב במסננת (centrifugation) ובצע שטיפות של המשקע. לאחר מכן, השהה מחדש את הדגימות ב-1.5 milliliters של 70%ethanol קר והעבר אותן לפרוטסת מיקרו-צנטריפוגה בנפח של שני מיליליטר.

לאחר סרטיפוגציה, השליכו את העלייה (supinate) של האתנול ויבשו את המשקע לזמן קצר ב-speed vac. המיסו את הדגימות במאפר למיצוי חלבונים דנטורטיבי; לאחר סרטיפוגציה ליצירת משקע, אספו את העלייה ומדדו את ריכוז החלבון בהתאם למדריך היצרן. עבור כל אחד מששת התגיים למסה, התחילו עם 100 µg של דגימת חלבון בנפח שווה של באפר אלקילציה IO acetamide בריכוז 200 mM שהוכן טרי, כדי לחסום את קבוצות התיול החופשיות; דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, כדי להשקיע את החלבונים, הוסיפו 1 mL של אצטון קר בריכוז 80% והניחו בטמפרטורה של 20- °C למשך הלילה.

השקיעו את החלבון על ידי סנטריפוגציה ובצעו שלושה שטיפות עם 80% acetone. לאחר ייבוש הדגימות באוויר על קרח, השביו את המשקע ב-50 µL של lysis buffer. לאחר מכן, כדי להפחית את קשרי הדיסולפיד, הוסיפו 0.5 µL של 100 mM TCEP והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

המס את התגיות על ידי הוספה של 20 µL של aceto nitrile למבחנות הריאגנטים. ערבב במכשיר vortex וסבב במ centri-fuge כדי להשקיע את התוכן. לאחר מכן, כדי להסיר TCEP עודף, טען 50 µL של דגימה לתוך עמודת MicroCon three KD. הוסף 50 µL של lysis buffer וסבב בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-10,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C.

כדי לאסוף את הדגימה, הוצא את העמודה, הפוך אותה לתוך מבחנה נקייה וסבב בצנטריפוגה. בדוק את ה-pH של הדגימה במידת הצורך. כוונן ל-pH בין שבע לשמונה באמצעות hydrochloric בריכוז one molar.

הוסיפו 5 µL של ריאגנט TMT ודגרו את התגובה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ערבבו את הדגימות והוסיפו נפח שווה של בופר דגימה לליזיס, הרתיחו למשך חמש דקות והפרידו על ג'ל פוליאקרילאמיד 12% מוכן מראש. לאחר שטיפת הג'ל שלוש פעמים במים מסוננים, צבעו עם Coomassie Blue למשך שעה והשאירו להשריה במים למשך הלילה, בהתאם לריכוזי פסי החלבון. חלקו ל-12 פרקציות לכל נתיב בג'ל. חתכו כל פרקציה לחתיכות של 1 mm והניחו בתוך מבחנה של 1.5 mL.

הסעו לחלוטין את חתיכות הג'ל ב-0.1 molar ammonium bicarbonate ב-50% acetonitrile. כעת, כסו את החתיכות ב-100% acetonitrile למשך 15 דקות. הסירו את הנוזל ויבשו את החתיכות באמצעות SpeedVac.

בשלב הבא, הוסיפו נפח שווה של תמיסת tripsin והניחו על קרח להרטבה מחדש. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 12 עד 16 שעות לעיכול על ידי trypsin. לאחר מכן, הסירו את תמצית החלבון הנוזלית מהדגימות שעברו דגירה.

עצרו את התגובה והסירו שאריות של עיכול חלבון על ידי כיסוי חלקי הג'ל ב-5% formic acid ו-50% aceto nitrile. לאחר מכן, נערו את חלקי הג'ל למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנות דגימות החלבון המופקות לאחר שתי הפקות נוספות.

ייבשו את הדגימות באמצעות SpeedVac במבחנות של 0.5 מיליליטר. הכינו תגלי (slurry) בריכוז 50% של שרף anti-TMT ב-TBS בריכוז היחסי לעוצמת פס החלבון המתאים. שטפו את השרף שלוש פעמים עם נפח עמודה אחת של TBS בריכוז פי 1, ולאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטר של TBS לכל דגימה.

לאחר מכן, העבירו לשרף anti TMT וערבבו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, ולאחר מכן הניחו לערעור (rocking) למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. טענו כל דגימה לעמודה. בצעו שטיפות עמודה של 200 µL כל אחת.

לאחר מכן, בצעו אלוציה של כל דגימה שלוש פעמים עם 200 µL של elution buffer בריכוז 50% ויבשו בוואקום. השעו את הדגימות ב-12 µL של aceto nitrile בריכוז 3% עם 0.1% formic acid, והזריקו 5 µL ישירות לעמודת HPLC. בצעו אלוציה של הפפטידים באמצעות גרדיאנט של aceto nitrile עולה, כפי שפורט בטקסט המצורף.

השתמשו בספקטרומטריית מסה כדי לזהות פפטידים במסלול עבודה של top two by three. התחילו בבדיקת ms בשלב אחד. לאחר מכן, רכשו שלושה ספקטרא של Ms.Ms עם פרגמנטציה בשיטת higher energy C trapped dissociation, ולאחריה שלושה נוספים.

Ms.MS עם דיסוציאציה מושרית התנגשות (collision induced dissociation) לזיהוי חלבונים. נתחו את נתוני ספקטרומטריית המסה באמצעות זרימת עבודה מסועפת. יישמו כמותן ברזל של דיווח (reporter iron quantizer) כדי לכמת את היחס.

בנוסף, העבירו את ספקטרום ה-MSM MS דרך צמתי בחירת הספקטרום (spectrum selector), נרמול הספקטרום (spectrum normalizer) וקיבוץ הספקטרום (spectrum grouper), ובצעו שאילתת נתונים מול מנוע החיפוש seaquest. תמונה זו מציגה דוגמאות של עלה צמח עגבנייה ביקורת משמאל ועלה שהוחדר ב-pseudomonas מימין לאחר צביעת העלים באמצעות DAB. תהליך צביעת ה-DES מאפשר לצבע ההיסטוכימי להראות סימנים של רדיקלים חופשיים של חמצן (reactive oxygen species) ברקמת העלה.

כפי שניתן היה לצפות, הביקורת אינה מראה צביעה משמעותית, בעוד שהעלים שטופלו ב-pseudomonas נצבעים באופן חיובי לייצור מימן-פרוקסיד. דוגמה זו מציגה פלט של נתוני גילוי פרוטאומי, שבו שטח הפסגה של חלבון המהווה ביטוי רגולטורי רדוקס דיפרנציאלי עבור כל דגימה מאפשר כימות מוחלט. שטח הפסגה בין דגימות הביקורת לדגימות המוחדרות מעיד על כמויות יחסיות.

כאן, הוויסות רדוקס של חלבון בין דגימת ביקורת לדגימה מוחדרת הוא דומה. פסגות בעוצמה דומה מרמזות על נוכחות של קשרי דיסולפיד שאינם מווסתים על ידי שינוי בטיפול. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה כהלכה בתוך שבוע אחד.

זכרו לשמור על הדגימות קרות ולהוסיף סדר לתוויות. כמו כן, יש לנקוט באמצעי זהירות בעת שימוש בפנול, כגון הרכבת כפפות ועבודה במכססה (Hood) בהתאם לנוהל זה. ניתן לבצע מדדים נוספים, כגון אנליזה ספציפית של מספקטרומטריית מסות למודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות, כדי לקבוע שינויים מערכתיים אחרים כמו חומצה אונית וסימולציית גלוטן.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ביצוע הפעלת DIB standing CTMD וכיול redox 16.