במרחב ובזמן מניפולציה של פעילות GTPase קטן ברמת subcellular ועל לוח זמנים של שניות בתאים חיים

סרטון זה מדגים שיטה שבה אור UV משמש למניפולציה של פעילות חלבון בקרום הפלזמה. לשם כך, תאים עוברים טרנספטציה עם חלבון FRB מעוגן ממברנה וחלבון FK BP ממוזג מעניין. נגזרת רפמיצין בכלוב צילום מתווספת למדיום.

לאחר מכן, במהלך הדמיית תאים חיים, אור UV מוחל על אזור מסוים בתא. המקשר בין רפמיצין לביוטין הוא דימריזר כימי משחרר ותוצר הלוואי שלו, הדימריזר המשוחרר מתפזר לתאים וגורם לדימריזציה בין החלבון המעניין המסומן FKBP לבין FRB המעוגן בקרום הפלזמה באזור המוקרן. ללא קרינת UV, FKBP ו-FRB אינם מתקשרים, ולכן אינם מייצרים השפעה.

ניתוח הנתונים מגלה גיוס מקומי מאוד של חלבון התמזג FKBP מעניין על סמך השפעתו הפיזיולוגית. היתרון של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון פרמקולוגיה וגישת גנטיקה, הוא השילוב של מהירות פעולה, ספציפיות מטרה ורזולוציה מרחבית. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בסרטן גרורתי הוא תוצאה של נדידה של תאים סרטניים.

לכן, מניפולציה של פעילות גורמי נדידה מרכזיים עשויה לחשוף את המנגנון המולקולרי המדויק שלה, שהוא תנאי מוקדם לטיפול ולריפוי שלה. המדגימים את הנוהל יהיו כריס פול מאייר, סטודנט לתואר שני ובוב דה רוז, טכנאי מהמעבדה שלי. התחל פרוטוקול זה על ידי שילוב הדברים הבאים בפלסמיד צינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי, DNA, ממברנה קשורה FRB מתויג פלואורסצנטי FKBP, TIA אחד ומים נטולי יונים מוסיפים מיקרוליטר אחד כמה גנים HD לתערובת ולמערבולת.

דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. במהלך הדגירה, הוסיפו 50 מיקרוליטר פולי דה ליצין לכל באר של צד תא שמונה בארות זכוכית ודגרו למשך דקה אחת כדי לצפות את פני השטח, ואז שאפו את התמיסה ושטפו את מרכז כל באר ב-50 מים נטולי יונים. הטריפסין הבא הוא 80 עד 85% NIH מתלכד שלושה T שלושה תאים.

לאחר ניתוק התאים, הוסף 10 מיליליטר DMEM המכיל 10% FBS להעביר 375 מיקרוליטר של המתלה לצינור סטרילי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב -1, 500 גרם למשך שלוש דקות. לאחר הסיבוב, שאפו בזהירות את המדיום. הוסף 750 מיקרוליטר של DMEM עם 10% FVS ו-Resus.

השעו את הגלולה על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים. לבסוף, הוסף את תרחיף התא לתמיסת הטרנספקציה ובעזרת קצה הפיפטה מערבבים בעדינות, מוסיפים 250 מיקרוליטר של תרחיף העברת התאים לכל באר בתא. החלק ודגר אותו.

37 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 18 שעות. כדי לסנתז רפמיצין בכלוב, תוספת ביוטין. התחל בהכנת תמיסת מלאי של מילי-מולרית אחת של CRB ב-DMSO בצינור פוגה סטרילי בצינור מיקרו-צנטריפוגה נפרד של 1.5 מיליליטר, ממיס מיליגרם אחד של אבדון ב-250 מיקרוליטר של PBS.

ליד להצמיד את חלקי הכלוב לרפמיצין. הוסף 0.5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי CRB ל-AVID המומס בערבוב על ידי היפוך מספר פעמים ולאחר מכן דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי להניב CRB AVID בתמיסה מצומדת כדי לא לכלול מולקולות קטנות לא קשורות ולטהר CRBA, יש לאזן עמודת אי הכללה בגודל G 25 עם 300 מיקרוליטר PBS.

חזור על הפעולה חמש פעמים לאחר שיווי המשקל של העמודה. טען 125 מיקרוליטר של תמיסת CRBA על המיטה המרכזית של העמוד. לאחר מכן סובב את התמיסה למשך שתי דקות ב-800 גרם בטמפרטורת החדר, אסוף את הזרימה בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לאחר טרנספקציה של התאים.

החלף את המדיום ל-DMEM ללא FBS לסרום להרעיב את התאים לדגור במשך 12 שעות. לאחר הדגירה יש לשאוב בעדינות את המדיום ולהוסיף 250 מיקרוליטר מתמיסת ה- CRBA המיקרוטולרית המוכנה. לאחר מכן כדי לדמיין דינמיקת חלבונים בתאים חיים, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב עם תאורת UV כדי לחבר אופטיקה לאור LED UV ב-365 ננומטר.

עם אור אפי פלואורסצנטי. הגדר את הקואורדינטות והגודל של נקודת תאורה באמצעות לוחית זכוכית המצופה בצבעי פלורסנט הנרגשים על ידי אור UV. זה מאפשר כוונון עדין של האזור המיועד להקרנה.

הנח את שקופית החדר עם התאים על הבמה באמצעות מטרה של פי 100 ופלואורסצנציה אפי. הביאו את התאים למיקוד ומצאו תא. לצורך הדמיה, התחל לדמות את התאים לאחר קביעת רמות הרקע של האפקט הפיזיולוגי.

כאן, סלסול הממברנה נמדד מקרין אור UV ברבע נבחר אחד של התא, מתמוסס ללא עיבוד, ובכך רפמיצין מקורי ב-DMSO ולאחר מכן ב-PBS לריכוז סופי של 400 ננו-מולר. הוסף 100 מיקרוליטר מהתמיסה לתא ההדמיה כדי לגרום להשפעות גלובליות. צלם תמונות פלואורסצנטיות כל 15 שניות למשך 20 דקות כדי לקבוע אם הפעלה מקומית של RAC יכולה לגרום להיווצרות קפלים מקומיים.

NIH שלושה תאי T שלושה הועברו עם מפעיל RAC מתויג YFP FK bp, TIA one ו-LDR, שהוא ממברנה מעוגנת. הקרנה מקומית FRB בקצה התא המסומן על ידי העיגול הצהוב, ואחריה הארה גלובלית עם מנורת כספית למשך שנייה אחת החל מ-1063 שניות. כפי שניתן לראות כאן, כמעט ולא היה סלסול קרום בהתחלה.

עם זאת, בעקבות תאורה מקומית נצפתה סלסול מוגבל מרחבית לאחר תאורה גלובלית ותוספת של רפמיצין, הגורם לטרנסלוקציה של FK bp TIA אחד לקרום הפלזמה. התא הראה היווצרות סלסול גלובלית המצביעה על כך שהיווצרות הסלסולים המקומית שנצפתה בעבר נגרמה על ידי הפעלה מוגבלת מרחבית של המתלה. לצורך ניתוח כמותי, תאי המטרה חולקו לארבעה רבעים ותדירות היווצרות הסלסולים בכל רביע על גירוי מקומי וגלובלי נקבעה כפי שניתן לראות בגרף זה.

אף אחד מהתאים שנצפו לא הראה היווצרות קפלים עם CRBA ללא קרינה או uve מקומית, קרינה עם או בלי עדן בתפזורת. עם זאת, כאשר נוספה CRBA ובוצעה הקרנת UV, היווצרות קפלים נצפתה בערך באותו האופן, בערך 90% בכל הרבעים עם הקרינה הגלובלית כאשר רק רבע אחד הוקרן, תדירות היווצרות הסלסולים הייתה 100% בהשוואה ל-30%25% ו-30% ברבעים שניים עד ארבע. תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן להשתמש בפירוק מקומי של רפמיצין כדי לגרום להשפעות פיזיולוגיות מקומיות מאוד בתא בודד.

במקרה זה, סלסול קרום הנגרם על ידי הפעלת מתלה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג שליטה זמנית מרחבית על פעילות g TPAs קטנים על ידי אור. ניתן ליישם שיטה זו על כל תהליך פיזיולוגי התלוי בחלבונים ספציפיים העוברים לקרום הפלזמה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין טרי תמיסות, ריאגנטים ותאים לכל הליך. אל תשכח שעבודה עם אור UV עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש להרכיב אמצעי זהירות כגון משקפי UV.