Culturing ויישומים של סיבוב bioreactor וול כלי נגזר מודלים 3D תא אפיתל

פרוטוקול לא שגרתי זה מציג מערכת פשוטה וחסינה לגידול תאים אפיתליאליים אנושיים למודלים תלת-ממדיים אורגנוטיפיים המשחזרים את הרקמה האנושית in vivo. ראשית, תאים אפיתליאליים מוגדלים לשכבה אחת צפופה (confluent monolayer) בבקבוק לתרבית רקמה, נאספים, ולאחר מכן משולבים עם חרוזי נשאי-מיקרו (micro carrier beads) בביוראקטור מסוג STLV; סיבוב ה-STLV על הפלטפורמה יוצר סביבה של נפילה חופשית קבועה עם גזירת נוזלים נמוכה, המאפשרת לתאים להיקשר ולהתרבות על החרוזים ולהיווצר אגרגטים תאיים לאחר 96 שעות, ובערך בכל יום לאחר מכן.

יש להשלים את המצע ב-SDLV כדי להבטיח אספקה למטבוליזם התאי. לאחר היווצרות הצברים, יש לדגום תמונות באמצעות מיקרוסקופיית אור פעם בשבוע כדי לנטר את התקדמות ההתפתחות, מרגע שהושלמו היווצרות הצברים והדיפרנציאציה התאית. יש להשתיל את הצברים לצורך אנליזות ניסוייות ובדיקות המשך. בסופו של דבר, מערכת זו יכולה להפיק מערכות מודל אורגנוטיפיות דמויות in vivo עבור מגוון רחב של מחקרים מדעיים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרבית תאים קונבנציונלית, הוא שתאי האפיתל יעברו דיפרנציאציה וקיטוב לצברים דמויי רקמה, ובכך יתנהגו באופן מורפולוגי ותפקודי בדומה לרקמה אנושית אותנטית. מערכת מודל תלת-ממדית זו מספקת תובנות נוספות לגבי ביולוגיה של תאי אפיתל, אינטראקציות בין מאחס לפתוגן, והיחסיים המורכבים בין סוגי תאים שניתן להחדיר למערכת. ד"ר Andrea Radkey.

פוסט-דוקטור במעבדה שלי ידגים כעת את ההליך לנטרול רעלים בביוראקטור של כלי דם צדדיים בעל סיבוב איטי. כסו את הפתחים הפתוחים בעזרת פקקי לור (lure caps). מלאו את ה-STLV ב-95% ethanol והמתינו 24 שעות להשגה של שיווי משקל.

הסיר את האתנול, לאחר מכן מלא במים מזוקקים סטריליים והדגר למשך 24 שעות. באמצעות הכלים שסופקו על ידי הספק, שחרר את כל הברגים והסר את הפקק המרכזי מה-STLV. הנח אותם בנרתיק סטריליזציה ועקר באוטוקלאב בטמפרטורה של 110 °C למשך 20 דקות. הרכב מחדש את ה-STLV וחזור על תהליך ניקוי הרעלים כדי להבטיח סטריליות.

בשלב הבא, הדקו את הברגים של ה-STLV. חברו ברז מעבר (stopcock) חד-כיווני שעבר עיקור מראש לכל פתח. כעת, הוציאו את הבוכנות ממזרק lure lock בנפח 10 מיליליטר וממזרק lure lock בנפח חמישה מיליליטר, והניחו את הבוכנות בתוך העטיפות.

כדי לשמור על סטריליות, הברגו את המזרקים אל הברז המעכב (stop stopcock). המשיכו להוסיף DPBS למזרק ה-10 milliliter עד שה-STLV יתמלא והמזרק של ה-five milliliter יתחיל להתמלא. לאחר מכן, החזירו את הבוכנות הסטריליות לכל מזרק והסִירו בועות שאריות מהביוראקטור על ידי דחיפה לסירוגין של בוכנות המזרקים.

סגור את הברזים וחבר את ה-STLV לפלטפורמה האנכית המסתובבת. סובב למשך 24 שעות לפחות כדי לבדוק דליפות בתוך מבחנה קונית של 50 milliliter. הוסף 15 milliliters של DPBS ל-250 milligrams של חרוזי cyto dex microcar ובצע אוטוקלאב לאחר קירור.

הסר את ה-DPBS ושטוף שלוש פעמים עם מצע תרבית עבור התאים האפיתליאליים. סובב את המבחנה כדי להשעות מחדש את החרוזים. לאחר מכן, השהה את החרוזים ב-15 milliliters של מצע תרבית.

ראשית, תרבתו 1×10⁷ תאים אפיתליאליים כשכבה אחת (monolayers) בבקבוקי תרבית רקמה. קצרו את התאים, ספרו אותם וקבעו את חיוניות התאים באמצעות צביעת הדחייה של trypan blue. לאחר מכן, הוסיפו את התאים לחרוזים שהוכנו מראש.

שטפו את הפפה הקונית כדי להבטיח שכל התאים הועברו. לאחר מכן, הסירו את ה-DPBS ואת המזרקים מה-STLV. כמו כן, הסירו את הפקק מהפתח המרכזי באמצעות פפית סרולוגית של 10 מיליליטר.

טען את תרחיף חרוזי התאי האפיתליאליים לתוך ה-STLV. שטוף את המבחנה הקונוית פעם אחת כדי להעביר את כל התאים והחרוזים. לאחר מכן, החזר את הפקק של פתח המרכז.

בשלב הבא, הוציאו את הבוכנות ממזרק של 5 מיליליטר וממזרק של 10 מיליליטר והניחו את הבוכנות בתוך העטיפות. כדי לשמור על סטריליות, סגרו את פתחי המזרקים באמצעות ברזי עצירה פתוחים. מלאו את ה-STLV במדיית גידול.

החליפו את הבוכנות וסגרו את ברז המעצור. כעת, בצעו שיווי משקל לתרבית ה-STLV שנזרעה acabado בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות ללא סיבוב. לאחר הוצאת ה-STLV מהאינקובטור, פתחו את ברז המעצור.

הסר בועות אוויר באמצעות הבוכנות וסגור את ברז המעבר. לאחר מכן, הגדר את ה-STLV לסיבוב רציף במהירות של 20 RPM בתוך האינקובטור. לאחר 96 עד 120 שעות, החלף את המצע על ידי הסרת המזרקים ופתיחת שני ברזי המעבר של ה-STLV כדי לאפשר לחרו지를 ולתאים לשקוע.

לאחר שהתאים שקעו, שפו כ-75% מהמצע דרך הפתח הצדדי באמצעות המזרקים כדי לבצע את פרוטוקול ההזנה. שוב, המשיכו להשלים את המצע לפי הצורך בהתבסס על חילוף החומרים התאי. כמו כן, עקבו אחר הצמיחה והחיוניות של האגרגטים בכל חמישה עד שבעה ימים.

כדי למנוע גזירה של צברים, השתמשו בטיפ של פיפט ל-1000 microliter שנקצץ כ-שני סנטימטרים מהקצה ועומסתרה. הסירו בזהירות 200 microliter של צברים מהפתח המרכזי וחלקו לשתי מבחנות של 1.5 milliliter. השתמשו במניה אחת למעקב אחר חיוניות התאים. לאחר הפרדת התאים מהחרוזיים, העריכו את החיוניות באמצעות בדיקת הדרה של tripan blue.

צביעה לצורך דימות של אגרגטים תאיים. הוסף 0.5 עד 1 mL של מצע למנת האגרגטים השנייה בנפח 1.5 mL והעבר לכלי פטרי קטן באמצעות קצה של פיפט 1000 µL קטום. דמיין את האגרגטים.

בשימוש במיקרוסקופ אור הפוך עבור חלק מדגמי תאי אפיתל, יש להעביר את האגרגטים למכל חד-פעמי כדי להגביר את אוורור התרבית כשבוע לפני קצירת האגרגטים. לצורך ניתוח, הסר את המזרקים מה-STLV ושפך כ-50% מהמדיה דרך פתח הצד. הסר את הפקק המרכזי ושפך בזהירות את כל התוכן אל מבחנה קונית של 50 milliliter דרך הפתח המרכזי.

שטפו את ה-STLV פעמיים עם 5 mL ממרב ומזגו את מי השטיפה יחד עם האגרגטים שנאספו. לאחר מכן, העבירו את האגרגטים מהמבחנה הקונית בנפח 50 mL אל ה-Harv. לאחר שבוע, אספו בזהירות את האגרגטים עבור פורמטים פוטנציאליים של בדיקות, ניסויים ואנליזה; אגרגטים מובחנים של אפיתל אנושי גודלו במערכת הביוראקטור STLV.

תמונות ה-SEM וה-TEM נאספו מתאי נרתיק אנושיים שגודלו ב-STLV במשך 39 ימים. שימו לב שהאגרגטים התלת-ממדיים מציגים מאפיינים אולטרה-מבניים הדומים לרקמות: רכסים מיקרוסקופיים, פנימיות (invaginations), שלפוחיות הפרשה תוך-תאיות ומיקרוויליי על הפני面 האפיקלי. תמונות מיקרוסקופיה של פלואורסצנציה אימונו-קונפוקלית של תאי נרתיק תלת-ממדיים מעידות על ביטוי של מוצין וסימנים ספציפיים לתאים אפיתליאליים ולדיפרנציאציה סופית. פנוטיפים רלוונטיים פיזיולוגית משמשים גם כפלטפורמה מצוינת להערכת רעילות של תרכובות.

בדיקת MTT, בדיקה נפוצה למדידת חיות תאים, מטבוליזם או פרוליפרציה, יכולה לשמש למדידת רעילות של כימיקלים ותרכובות שונות. לחלופין, ניתן למדוד רעילות לאחר טיפול בתרכובות בדיקה באמצעות דחיית trypan blue. בדוגמה זו, לאחר טיפול ב-NONOXINOL nine, הצבירים הוגינליים הדגימו תגובת רעילות דומה לזו של מודלי cervical X explan, אך פרופיל שונה בהשוואה לשכבות מונו).

האגרגטים התלת-ממדיים מגיבים באופן תפקודי, לדוגמה, בעקבות גרייה באמצעות מולקולות המופקות ממיקרובים המזוהים על ידי קולטני toll-like. האגרגטים מגיבים ומפרישים ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל חלבון IL six וביטוי של תמלול קולטן פרוגסטרון. ניתן להבחין בתאי הנרתיק גם בקולטן המגיב לגירוי הורמונלי.

לצבירים התלת-ממדיים יש לא רק את היכולת להגיב למולקולות של פתוגנים והורמונים, אלא הם מסוגלים גם לתמוך תפקודית בזיהום של נגיף ההרפס הסימפלקס מסוג 2. תמונת מיקרוסקופיה קונפוקלית של צבירים נרתיקיים תלת-ממדיים המודבקים ב-HSV 2 מדגימה את הזיהום. ניתן לכמת את התכונות הפיזיקליות והתפקודיות של תאים בודדים בתוך הצבירים גם באמצעות ציטומטריה של זרימה, לדוגמה, באמצעות בדיקת ציטומטריה של זרימה למדידת ביטוי שטח של muc1 בתאים נרתיקיים בודדים.

האגרגטים הנרתיקיים בתלת-ממד ביטאו אחוז נמוך יותר של mucin 1 על פניהם בהשוואה לשכבות חד-שכבתיות לאחר פיתוחן. טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחומי ביולוגיית הרקמות ומחלות זיהומיות לחקור את המבנה ואת התגובות הפיזיולוגיות לגירויים. באמצעות מודלים אורגנוטיפיים אלו, אנו מדמים טוב יותר את הביולוגיה האנושית.